CN112143832B - 用于检测hpv-18病毒感染的荧光传感器 - Google Patents
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Abstract
用于检测HPV‑18病毒感染的荧光传感器，包括用于在等温无酶环境中对HPV‑18 E6/E7 mRNA进行循环扩增的核酸扩增体系所使用的核酸组，其中用于HPV‑18 E6基因所使用荧光检测系统探针如SEQ ID NO.1‑4所示，用于HPV‑18 E7基因所使用荧光检测系统探针如SEQ ID NO.5‑8所示。本发明核酸材料天然有高生物相容性、无毒、无免疫源性；通过核酸间的链置换反应，可以在无酶的环境中实现高效的核酸等温扩增；等温扩增后的产物通过荧光侧流免疫层析技术进行检测。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种用于快速检测HPV-18感染的荧光传感器。
背景技术
宫颈癌是人类女性生殖系统的常见恶性肿瘤，据相关报道，在中国，每年大约新增宫颈癌病例14万例，约为世界总量的三分之一。近年来，宫颈癌的发病呈现越来越年轻化的趋势，宫颈癌是20至39岁女性癌症死亡的第二大主要原因。通过长时间的流行病学及医学研究，高危型人乳头瘤病毒持续感染被证明是引起宫颈癌的致病因素。因为宫颈癌与HPV的因果关系，所以可以对宫颈癌进行积极的预防，现阶段对宫颈癌进行筛查具有重大临床意义。
HPV E6/E7 mRNA检测是近年来出现的新型宫颈癌筛查技术，该方法以E6/E7基因整合后转录的mRNA作为检测靶点。当宿主初始感染HPV时，病毒基因并没有整合到宿主基因组中，此时E6/E7基因不表达或者低表达，病毒可以被机体自行清除，不会导致病情的进展。当HPV病毒持续性感染后，病毒基因整合到宿主基因组中，持续性地高表达E6、E7基因，此时E6、E7 mRNA持续性转录，并翻译大量E6、E7癌蛋白，E6、E7可降解P53从而导致宿主细胞癌变，最终导致宫颈癌的发生。另外，相关研究表明HPV E6/E7 mRNA表达量水平与疾病的进展程度有极高的相关性，随着宫颈病变的进展，HPV E6/E7检测的阳性率也逐步升高。所以检测HPV E6/E7 mRNA作为筛查方法有极高的临床价值。
动态DNA技术因其可程序化控制核酸分子自组装行为的特性，已成为一个新兴的研究热点。动态DNA纳米技术通过精细设计反应中各核酸探针的序列，从而使得各链间可自发进行链置换，控制反应的步骤。该过程不依赖酶即可使得反应高效进行，仅依靠体系熵值变化驱动发生。
发明内容
解决的技术问题：本发明设计并构建了一种用于检测HPV-18病毒感染的荧光传感器,该传感器是基于熵驱动的无酶扩增循环体系，通过反应体系中各条核酸链之间的交叉链置换，构建了一个闭环循环，在无需酶的环境中实现了核酸底物的循环扩增。通过对核酸链进行修饰，即可使用荧光侧流免疫层析试纸条作为传感系统，对核酸扩增系统的产物进行特异性捕获并进行信号放大及转化。
技术方案：用于检测HPV-18病毒感染的荧光传感器，包括用于在等温无酶环境中对HPV-18E6/E7 mRNA进行循环扩增的核酸扩增体系所使用的核酸组，其中用于HPV-18E6基因所使用荧光检测系统探针如SEQ ID NO.1-4所示，用于HPV-18E7基因所使用荧光检测系统探针如SEQ ID NO.5-8所示。
荧光传感器还包括用于检测特异性扩增产物的荧光侧流免疫层析试纸条，其C线固定有生物素，T线固定有抗地高辛抗体。
如SEQ ID NO.1-4所示的探针在制备荧光检测HPV-18E6基因试剂盒中的应用。
如SEQ ID NO.5-8所示的探针在制备荧光检测HPV-18E7基因试剂盒中的应用。
有益效果：1.核酸材料天然有高生物相容性、无毒、无免疫源性；2.通过核酸间的链置换反应，可以在无酶的环境中实现高效的核酸等温扩增；3.等温扩增后的产物通过荧光侧流免疫层析技术进行检测。
附图说明
图1为熵驱动无酶扩增循环示意图。其中S，F，T，O，B分别代表反应体系中所使用核酸链链S，链F，链T，链O，链B。链S为从左至右按5’-3’顺序，其它核酸链为从右至左按5’-3’顺序。1，2，3，4代表其中其中的核酸功能区，1’，2’，3’，4’分别代表功能区1，2，3，4的互补序列。反应按箭头所示方向进行。
图2为使用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳验证熵驱动无酶扩增系统。其中，泳道1，链S；泳道2，链B；泳道3，链O；泳道4，链T；泳道5，链F；泳道6，复合物SBO；泳道7，复合物SBO，链F，链T，反应60min；即链B，链O，复合物SF，链T；泳道8，复合物SBO，链T，反应60min；即链B，复合物STO；泳道9，复合物SBO，链F，反应60min；仍为复合物SBO，链F。
图3为本发明作用机制示意图。使用生物素标记的链S以及地高辛标记的链F参与循环反应生成两端分别标记有生物素和地高辛的双链复合物，该复合物被荧光微球捕获后再被试纸条上T线捕获，从而形成强烈的荧光，使用荧光扫描仪读取荧光读数即可定量分析初始靶标的浓度；
图4为基于熵驱动的无酶扩增循环荧光生物传感器的特异度分析。
图5为基于熵驱动的无酶扩增循环荧光生物传感器的灵敏度分析。细胞数量和荧光传感强度呈线性相关。其中，当细胞数在103-106时，细胞数量的对数与传感器读数呈线性相关，其回归方程为Y＝6597logN-19351，相关系数R2＝0.997，其中N为细胞数。根据空白加上三倍标准差的规则，我们估算出最低检测下限约为300个细胞。
具体实施方式
下面的实施例可使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1：反应所需复合物的自组装
使用TE buffer溶解的核酸探针用于实验，按所需复合物的序列组合将各探针溶液置于PCR管中并使用震荡涡旋仪充分混合；设定PCR仪温度曲线为95℃变性10min，随后以0.1℃/min缓慢降温至4℃，即可完成复合物自组装。
表1用于HPV-18E6基因所使用荧光检测系统探针序列
*表格中所有序列均为5’-3’顺序.
表2用于HPV-18E7基因所使用荧光检测系统探针序列
*表格中所有序列均为5’-3’顺序.
实施例2：使用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳验证
1)8％非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制：混合4mL的30％丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺(29：1)、1.5mL 10×TAE/Mg2+buffer(125mM Mg2+)、105μL 10％过硫酸铵(APS)溶液、10μL四甲基乙二胺(N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine，TEMED)以及9.385mL去离子水。混匀后加入10mL凝胶配制槽，室温静置30min；
2)1×TAE/Mg2+buffer(pH＝8.0)电泳缓冲液的配制：取10×TAE/Mg2+buffer贮存液50mL，使用450mL去离子水稀释后即得1×TAE/Mg2+电泳缓冲液；
3)将预先组装好的复合物与检测靶标的DNA类似物，按实验方案分别混合后(方案见表3)，置于37℃电热恒温箱中反应60min；
4)将各复合物以及反应各步骤的混合液与6×loading buffer混合均匀，在每个孔加入6μL溶液；
5)使用1×TAE/Mg2+buffer(pH＝8.0)进行电泳，设定电泳电压为100V，电泳60min，该过程中使用冰浴保护核酸复合物；
6)将电泳后的凝胶使用EB染料进行染色10min，后放置于凝胶成像仪，进行观察曝光。
表3核酸电泳用各反应体系及其构成
如图2所示，前5个泳道中，每个单独的核酸链均于图中被标记，第6泳道中为组装后的复合物SBO。第7泳道中为反应后的产物SF、链B、链O、链T。第8泳道中仅加入复合物SBO以及反应引发物链T，所以链T的竞争性结合效果使得链B被置换出而形成复合物STO以及链B。第9泳道中仅加入复合物SBO以及链F，因没有暴露出相应的立足点，链F与复合物SBO之间无反应。
实施例3：基于熵驱动无酶扩增系统的免疫荧光传感器的灵敏度检测
1)消化处于对数生长期的细胞，并使用Sysmex XN-550血球计数仪进行细胞计数；
2)取Hela细胞1×107个于1.5mL离心管，倍比稀释成1×106、1×105、1×104、1×103、100、10个细胞；分别5000rpm离心5min后弃去上清培养液；
3)加入200μL Trizol，混匀，室温静置5min；
4)加入熵驱动的核酸扩增系统所使用探针，固定其浓度均为100nM，置于37℃水浴加热反应60min；
5)将反应后的液体滴加于检测用荧光侧流免疫层析试纸条加样区；静置两分钟后使用荧光扫描仪检测C线、T线荧光强度。
通过加入不同量的Hela细胞检测荧光传感器的检测效果。细胞数量和荧光传感强度呈线性相关。其中，当细胞数在103-106时，细胞数量的对数与传感器读数呈线性相关，其回归方程为Y＝6597logN-19351，相关系数R2＝0.997，其中N为细胞数。根据空白加上三倍标准差的规则，估算出最低检测下限约为300个细胞。
实施例4：42例宫颈癌患者临床样本的临床实验
宫颈癌患者的宫颈上皮细胞中，HPV的基因可能已经整合入细胞基因组，高表达E6、E7癌基因，所以本研究中我们使用HPV-18基因阳性宫颈癌患者的宫颈刷片样本作为阳性样本，同时匹配16例感染HPV-16、HPV-33等其它型HPV病毒患者的样本作为阴性对照。该结果说明基于熵驱动的无酶扩增循环荧光生物传感器对临床样本具有极高的诊断效果，其诊断的灵敏度为95.2％，特异度为100％，阳性预测值为100％，阴性预测值为88.9％，能显著区分HPV-18E6/E7 mRNA表达患者。
表4：42例HPV-18宫颈癌患者样本的检测结果。对该结果进行χ2检验，结果χ2＝49.1，p＜0.01，结果具有显著的统计学差异。该结果说明基于熵驱动的无酶扩增循环荧光生物传感器对临床样本具有极高的诊断效果，其诊断的灵敏度为95.2％，特异度为100％，阳性预测值为100％，阴性预测值为88.9％，能显著区分HPV-18E6/E7 mRNA表达患者。
表4 42例HPV-18宫颈癌患者样本的检测结果
与现有RNA扩增方法的对比，本方法兼具设计简单、无需特殊前处理步骤、无需特殊反应设备、快速检测、成本低廉等优点:
表5与现有RNA扩增方法的对比
序列表
<110> 东南大学
<120> 用于检测HPV-18病毒感染的荧光传感器
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gggaggaagg aaggatccta atggcactgg cctctatagt 40
<210> 2
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tccttccttc ctccc 15
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaggccagtg ccattagga 19
<210> 4
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaggccagtg ccattaggat ccttccttcc tccc 34
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gggagggagg gaggagggct gcaatacaat gtcttgcaat 40
<210> 6
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcctccctcc ctccc 15
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agacattgta ttgcagccc 19
<210> 8
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
agacattgta ttgcagccct cctccctccc tccc 34
Claims (3)
1.用于检测HPV-18病毒感染的荧光传感器，其特征在于，包括用于在等温无酶环境中对HPV-18 E6/E7 mRNA进行循环扩增的核酸扩增体系所使用的核酸组，其中用于HPV-18 E6基因所使用荧光检测系统探针如SEQ ID NO.1-4所示，用于HPV-18 E7基因所使用荧光检测系统探针如SEQ ID NO.5-8所示；还包括用于检测特异性扩增产物的荧光侧流免疫层析试纸条，其C线固定有生物素，T线固定有抗地高辛抗体；其中使用生物素标记的链S以及地高辛标记的链F参与循环反应生成两端分别标记有生物素和地高辛的双链复合物，该复合物被亲和素-荧光纳米微球捕获后再被试纸条上T线捕获，从而形成强烈的荧光。
2.如SEQ ID NO.1-4所示的探针在制备荧光检测HPV-18 E6基因试剂盒中的应用。
3.如SEQ ID NO.5-8所示的探针在制备荧光检测HPV-18 E7基因试剂盒中的应用。
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