CN112143737A

CN112143737A - OsbZIP62-VP64融合表达改良水稻农艺性状的应用

Info

Publication number: CN112143737A
Application number: CN202010997324.2A
Authority: CN
Inventors: 杨诗勤; 徐凯; 罗利军; 封功能; 张楷歆; 王维
Original assignee: Yancheng Institute of Technology
Current assignee: Suzhou Chien Shiung Institute of Technology
Priority date: 2020-09-21
Filing date: 2020-09-21
Publication date: 2020-12-29
Anticipated expiration: 2040-09-21
Also published as: CN112143737B

Abstract

本发明公开了一种OsbZIP62‑VP64融合表达改良水稻农艺性状的应用。本发明将从疱疹病毒来源的、具有增强水稻基因转录活性的转录激活域变体VP64与水稻中的基因OsbZIP62进行融合重组(OsbZIP62‑VP64，OsbZIP62V)，超量表达OsbZIP62V可提高水稻的株高和穗长，增加每穗实粒数和一/二次枝梗数等农艺性状。本发明的水稻基因OsbZIP62V对水稻农艺性状影响明显，可应用于水稻分子育种，对丰富水稻种质资源、创制新种质，乃至缩短育种过程起着重要作用。

Description

OsbZIP62-VP64融合表达改良水稻农艺性状的应用

技术领域

本发明涉及一种与水稻重要农艺性状相关的基因，具体地说，涉及一种OsbZIP62-VP64融合表达改良水稻农艺性状的应用，属于基因工程领域。

背景技术

水稻是重要的粮食作物，为全球50％以上人口提供安全保障。近年来，随着人类活动的加剧，各种气候灾害日渐频发，对水稻的生理代谢等过程造成了严重影响，进而影响了水稻的株高、穗长和产量等理化性状，严重制约了作物育种高产稳产的长远目标。因而深入研究水稻株高等农艺性状生理和分子机制是培育高产稳产的水稻新品种、保障粮食生产安全的重要科学需求。

进入新世纪以来随着基因组学、蛋白组学等学科及基因编辑技术的飞速发展，及为应对农业从业人员老龄化，耕地减少，环境恶化和对粮食品质需求的提高，设计育种的理念被提出来。而近年来随着育种理论与技术的突破，使得育种技术，即分子设计育种成为现实。育种技术的发展是践行绿色超级稻的核心内容，而重要农艺性状基因的克隆与鉴定是实现分子设计育种的前提和基础，只有在基因层面上解析了作物性状形成的分子机制，才能在育种过程中进行准确的设计和实施，聚合优异基因，打破优异基因与不利基因之间的连锁累赘，做到有针对性地设计育种，大幅提高育种效率。而农艺性状中株型改良一直是高产稳产水稻品种的核心指标之一，水稻株型直接影响有效穗数和穗粒数，是决定产量的核心要素。因此，要利用分子设计育种理念培育高产稳产的水稻品种，其核心在于挖掘影响水稻株型的关键基因，并对其进行详细的功能解析。目前已报道了部分基因参与了对水稻株型的调控，如对水稻株型起重要调控作用的基因GRAS家族蛋白单蘖基因MOC1、MOC3等；编码一个含有SBP-box结构域的转录因子IPA1基因等。但株型多是多基因、多机制共同作用的结果，主效基因较少。因而如何提高单个基因的作用效果才是育种关键。而对不同类型启动子的选择是增强基因表达效果常用手段之一，目前已从动/植物、病毒和微生物中分离到许多适用于植物的启动子。根据作用方式及功能可将启动子分为3类：组成型启动子、诱导型启动子和组织特异型启动子。但仍有许多基因的表达效果不近人意，因此对其相关机理还需要深入研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种OsbZIP62-VP64融合表达改良水稻农艺性状的应用。本发明发现水稻农艺性状相关基因OsbZIP62V及其编码蛋白，通过超量表达OsbZIP62V后可提高转基因植物的株高和穗长，增加每穗实粒数和一/二次枝梗数等农艺性状。

本发明通过将一段完整DNA片段VP64与水稻中分离克隆的一段完整的DNA片段OsbZIP62进行融合，形成融合有转录激活结构域的OsbZIP62V融合蛋白。

本发明分离和应用一种含有OsbZIP62V基因的DNA片段，该基因能影响水稻株高、穗长等重要农艺性状。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明公开了一种OsbZIP62V基因或其编码的蛋白在用于提高水稻重要农艺性状中的应用。

作为本发明的一个实施方案，所述水稻重要农艺性状包括提高水稻株高、穗长、每穗粒数、一/二次枝梗数。

作为本发明的一个实施方案，包括构建OsbZIP62V超量表达载体，导入植物细胞，获得转基因植株。

作为本发明的一个实施方案，将水稻中的OsbZIP62基因重组克隆到含转录激活域变体VP64的超量表达载体中，获得所述OsbZIP62V超量表达载体。

作为本发明的一个实施方案，将转录激活域变体VP64与水稻中的OsbZIP62基因进行融合重组，扩增产物片段克隆到超量表达载体，获得所述OsbZIP62V超量表达载体。

作为本发明的一个实施方案，所述转录激活域变体VP64为疱疹病毒来源。

作为本发明的一个实施方案，构建OsbZIP62V超量表达载体所选用的载体为Ti质粒或植物病毒载体。

作为本发明的一个实施方案，所述OsbZIP62V基因的序列为SEQ ID NO.1中所示的DNA序列，或者与SEQ ID NO:1至少90％同源的DNA序列，或者其功能相当于SEQ ID NO:1所示序列的亚片段。

作为本发明的一个实施方案，OsbZIP62V基因编码的蛋白的氨基酸序列为序列表SEQ ID NO:2所示，或者SEQ ID NO:2序列的同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体或诱导突变体。

本发明还提供一种包含OsbZIP62V基因编码的重组载体和植物转化体，构建重组载体所选用的载体为Ti质粒或植物病毒载体，所述植物转化体的宿主为水稻。

可以采用PCR(polymerase chain reaction)技术，从基因组、mRNA或cDNA中扩增得到本发明的OsbZIP62V基因以及任何感兴趣的一段DNA或与其同源的一段DNA。采用上述技术，可以分离得到OsbZIP62V基因，将这一序列与任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体连接后转化植物，可获得影响农艺性状的转基因植株。

本发明提供的载体携带有OsbZIP62V基因的表达载体，可通过使用Ti质粒、植物病毒载体、显微注射和电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞。

本发明OsbZIP62V基因表达载体转化宿主是包括水稻在内的多种植物。

本发明通过对水稻中基因的克隆分离、融合及其对水稻农艺性状影响的评价，提供了一种新的重组的水稻DNA片段，包含一个975bp的编码基因OsbZIP62V。该基因明显影响水稻株高和穗长，增加每穗实粒数和一/二次枝梗数等农艺性状。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1)本发明通过将激活结构域VP64与OsbZIP62转录因子进行重组(OsbZIP62-VP64，OsbZIP62V)，超量表达OsbZIP62V可提高水稻的株高和穗长，增加每穗实粒数和一/二次枝梗数等农艺性状；

2)本发明的水稻基因对农艺性状产生明显影响，可应用于在植物分子育种。

3)本发明可以用于研究利用此基因遗传转化获得转基因植物的分子方法。

附图说明

图1为本发明的含VP64激活结构域的OsbZIP62(OsbZIP62V)的结构图；

图2为本发明的OsbZIP62V基因超量表达转基因水稻植株的表达水平检测；

图3为本发明的OsbZIP62V基因超量表达转基因水稻与野生型水稻株高比较分析；

图4为本发明的OsbZIP62V基因超量表达转基因水稻与野生型水稻分枝粳数比较分析；

图5为本发明的OsbZIP62V基因超量表达转基因水稻与野生型水稻穗长比较分析；

具体实施方式

下述实施例进一步描述本发明，但所述实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1水稻OsbZIP62基因的克隆

以本实验室构建保存的质粒OsDTH1为模板，分别以上下游引物OsbZIP62F(5’ACAGCCCTGGAACATTGGCC 3’SEQ ID NO.3)和OsbZIP62R(5’TAGTTAAGAAAAGAGTTCGTCG 3’SEQID NO.4)，扩增OsbZIP62目的片段，凝胶回收，连接到pEASY-Blunt载体上，鉴定后进行序列测定，测序结果经BLAST比对确认。结果显示本发明中的水稻OsbZIP62的CDS序列为825bp。

实施例2水稻融合基因OsbZIP62V超量表达载体转化水稻

1.利用GATEWAY重组克隆技术构建含OsbZIP62基因的超量表达载体，其结构图如图1所示：

以实施例1中已获得的含有OsbZIP62基因的pEasy-blunt载体为模板，用前引物F:5’-AAAAAGCAGGCTATGGGAGTCCACGCA-3’SEQ ID NO.5，后引物R:5’-AGAAAGCTGGGTTTAGAAAGAGGC-3SEQ ID NO.6’进行第一轮PCR扩增。再利用通用引物attB1adapter:5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3’SEQ ID NO.7，attB2 adapter:5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3’SEQ ID NO.8进行第二轮PCR扩增，扩增产物经回收纯化后，通过BP反应，将扩增产物片断克隆到入门载体pDONR，筛选阳性克隆，通过LR反应，将目的基因重组克隆到超表达载体pBCV。具体过程如下：

(1)第一轮PCR扩增

20μL反应体系如下表1：

表1

扩增程序：98℃预变性2min，98℃15s，60℃30s,72℃2min，10个循环。

(2)第二轮PCR扩增

取上述PCR产物10μL作为模板，加入到下面PCR配置的40μL反应体系。

表2

扩增程序：98℃预变性1min，98℃15s，45℃30s，72℃2min，共10个循环，98℃15s，55℃30s，72℃2min，共25个循环。

反应结束后取5μL PCR产物进行电泳检测。

(3)PCR产物的回收

采用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行纯化回收。

(4)BP重组反应

重组反应可在室温配制混匀，0.5mL的离心管中进行。反应体系如下表3：

表3

25℃温浴16h左右，随后将BP反应液转化大肠杆菌感受态细胞。重组大肠杆菌需在含庆大霉素平板上生长。接着挑取单菌落以进行PCR验证，最后抽提质粒。

(5)LR重组反应

重组反应可在室温配制，0.5mL的离心管中进行。反应体系如下表4：

表4

25℃温浴16h左右，然后将反应液转化大肠杆菌感受态细胞。转化完成的大肠杆菌液涂布在含有卡那霉素的平板上生长。接着挑取单菌落，进行PCR验证，然后送测序，测序结果与该基因cDNA序列比对以确认序列正确与否，最后提取质粒，即可转化农杆菌EHA105。

2.农杆菌转化

(1)根癌农杆菌(EHA105)感受态细胞的制备：

根癌农杆菌菌液于28℃培养至OD600＝0.5时，4℃离心收集菌体，用500μL、0.1mol/L冰浴CaCl₂重悬，冰浴30min后离心，去上清，用100μL，0.1mol/L冰CaC1₂重悬后，于4℃保存。

(2)农杆菌转化(冻融法)：

向农杆菌感受态细胞(100μL)中加入5μL植物表达载体质粒DNA，轻轻混匀，冰水浴30min后，于液氮中速冻冷激2min；加入400-800μL YEP培养液(含卡那霉素，Kan，50mg/L)；28℃，200r/min振荡培养3-5h；室温离心(5000r/min，5min)，保留100μL上清重悬菌体，涂布于LB固体培养基(含Kan 50mg/L)上，28℃倒置培养2天直至长出合适大小的菌落，挑取单克隆进行PCR检测，得到阳性菌株。

3.愈伤诱导：种子用无菌水漂洗15-20min，再用75％的乙醇消毒1min，然后用次氯酸钠(1.5％有效浓度)溶液振荡消毒20min。最后再用无菌水冲洗5遍。将洗好的种子用吸水纸吸干接种在诱导愈伤培养基中，25℃暗培养2周。

愈伤诱导培养基：采用表5的诱导培养基，加入0.3g脯氨酸、0.6g水解酪蛋白酶、30g蔗糖和2.5mL 2,4-D(浓度1mg/mL)，配成1L溶液，调pH至5.9，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。

4.继代培养：把胚性愈伤组织切下，接入继代培养基中，25℃暗培养2周。

继代培养基：采用表5的继代培养基，加入0.5g脯氨酸、0.6g水解酪蛋白酶、30g蔗糖和2mL 2,4-D(浓度1mg/mL)，配成1L溶液，调pH至5.9，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。

5.农杆菌浸染和愈伤组织共培养：培养农杆菌，挑取阳性单菌落，在1mL YEP,50mg/L农杆菌培养液(含抗生素)中，28℃培养过夜；取以上培养物，加入50mL农杆菌培养液(含抗生素)中，28℃培养至OD600＝0.6-1.0。将获得的农杆菌菌液离心，将收集到的菌体加入悬浮培养液中，震荡培养30min至OD600＝0.6-1.0。然后将愈伤组织放入含有农杆菌菌液的悬浮培养液中，振荡培养20min左右。将愈伤组织在灭菌滤纸上晾干，转入共培养培养基中，25℃暗培养5d。

悬浮培养液：采用表5的悬浮培养液，加入0.08g水解酪蛋白酶、2g蔗糖和0.2mL2,4-D(浓度1mg/mL)，配成100mL溶液，调pH至5.4，分成两瓶(每瓶50mL)，高温高压灭菌。使用之前加入1mL 50％的葡萄糖和100μL AS(100mM)。

共培养培养基：采用表5的共培养培养基，加入0.8g水解酪蛋白酶、20g蔗糖和3.0mL 2,4-D(浓度1mg/mL)，配成1L溶液，调pH至5.6，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。使用之前加入20mL 50％的葡萄糖和1mL AS(100mM)。

6.筛选培养：共培养3d后，选取好的愈伤组织，转入筛选培养基中，25℃暗培养2周，筛选两次。

筛选培养基：采用表6的筛选培养基，加入0.6g水解酪蛋白酶、30g蔗糖和2.5mL2,4-D(浓度1mg/mL)，配成1L溶液，调pH至6.0，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。使用之前加入1mL Hn和1mL Cn(100ppm)。

7.分化培养：挑取胚性愈伤组织接入分化培养基，24℃，16h/8h光暗培养诱导分化芽(4-6周)。

分化培养基：采用表6的分化培养基，加入2.0mg/L 6-BA、2.0mg/L KT、0.2mg/LNAA、0.2mg/L IAA、1.0g水解酪蛋白酶和30g蔗糖，配成1L溶液，调pH至6.0，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。

8.生根培养：待芽长至2cm左右时，将幼芽切下，插入生根培养基中，25℃左右，16h/8h光暗培养，诱导生根。

生根培养基：采用表6的生根培养基，加入30g蔗糖，配成1L溶液，调pH至5.8，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。

9.转化植株培养：待根系发达后，打开试管口，加入无菌水炼苗2-3d后，将植株取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入土壤中，刚开始遮荫避风，待植株健壮后进行常规田间或温室管理培养。

表5基本培养基成分1

表6基本培养基成分2

10.超量表达阳性植株中目的基因的表达水平检测

RNA提取及定量PCR方法见实施例1。

提取转基因T3代植物叶片RNA，采用定量PCR法检测了OsbZIP62V超量表达植株中目的基因的表达水平(图2)，在检测的2株转基因植株中，表达量均出现了不同程度的上升。

实施例3、OsbZIP62V超量表达转基因水稻农艺性状鉴定。

将OsbZIP62V超量表达转基因家系种子去壳消毒(75％酒精处理1min，1.5％NaClO处理20min，无菌水清洗4-5次)，在含有50mg/L潮霉素的1/2MS培养基上发芽，野生型对照晚一天播于不含潮霉素的1/2MS培养基上。待发芽2-3天后挑选发芽好且长势一致的幼苗移栽田间，待生长直孕穗期时进行表型观察。实验结果可以看出，超量表达OsbZIP62V转基因植株(OE11、OE12)与野生型对照(WT)相比其株高变高，分枝粳数变多，穗长变长(图3-图5)等。该结果表明超量表达OsbZIP62V基因改良了水稻农艺性状性。

综上所述，尽管已引证一些具体实例对本发明作了详细的说明，但对本领域技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围，作各种变化或修正是显然的。

序列表

<110> 盐城工学院

<120> OsbZIP62-VP64融合表达改良水稻农艺性状的应用

<141> 2020-09-21

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 975

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgggagtcc acgcaatgtc gtgccacggc ggcggcggcg gtggcggcga aggggcactg 60

tcgcggcagg ggtcggtgta cagcctgacg ctgaacgagg tggagagcca cctgggcgag 120

ccgctgcgga gcatgaacct ggacgacctc ctgcgcacgg tgctccccgc cgcggcggcg 180

gcggcggaga cggcggggag gaagacggtg gacgaggtgt ggcgcgacat ccagggcgcc 240

agcaccggcc ggcaccacgc gacgcccatg ggcgagatga cgctcgagga cttcctctcg 300

cgcgccggcg tcgccgtcga cggtgccgcc tccgccgccg gcgcgcattg gctgcgtggg 360

cactacccgc cgccgccgcc gccgacgacg acgacgctgc agtacgtggg cggctccggg 420

gcggtggtgg acggcgtgta taaccgcgtg gacgggcacg gcgtcgcggg gttcctctcg 480

caggtgggcg tggcggggcg gaagcgcggc ggcggcgtgg acggcgtggt ggagaagacg 540

gtggagcgga ggcagaagcg catgatcaag aaccgcgagt cggcggcgcg gtcccgagca 600

cggaagcagg catacacgaa cgagctcgag aacaagatct cgcggttgga ggaggagaac 660

cagcgcctca gggagcacaa ggctgttgct gatttctcaa cattccctag ctgcgtcgat 720

ttcctgaaag cattcttgac gcagaagctg gaaccagtaa tgcagattgt gccccagccg 780

gagccgaagc agcagctgcg acgaactact tcggcctctt tctaagccga gcatgtccag 840

atcaaagtca tccaatgcgt cgcttcccaa catatccagg tcaaagtcat cgagggcatc 900

agaacccagc atgtcgagat cgaaatcgtc cagcgcgtcc atggtacccg gggatcctct 960

agagtcgacc tgcag 975

<210> 2

<211> 324

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Gly Val His Ala Met Ser Cys His Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly

1 5 10 15

Glu Gly Ala Leu Ser Arg Gln Gly Ser Val Tyr Ser Leu Thr Leu Asn

20 25 30

Glu Val Glu Ser His Leu Gly Glu Pro Leu Arg Ser Met Asn Leu Asp

35 40 45

Asp Leu Leu Arg Thr Val Leu Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Glu Thr

50 55 60

Ala Gly Arg Lys Thr Val Asp Glu Val Trp Arg Asp Ile Gln Gly Ala

65 70 75 80

Ser Thr Gly Arg His His Ala Thr Pro Met Gly Glu Met Thr Leu Glu

85 90 95

Asp Phe Leu Ser Arg Ala Gly Val Ala Val Asp Gly Ala Ala Ser Ala

100 105 110

Ala Gly Ala His Trp Leu Arg Gly His Tyr Pro Pro Pro Pro Pro Pro

115 120 125

Thr Thr Thr Thr Leu Gln Tyr Val Gly Gly Ser Gly Ala Val Val Asp

130 135 140

Gly Val Tyr Asn Arg Val Asp Gly His Gly Val Ala Gly Phe Leu Ser

145 150 155 160

Gln Val Gly Val Ala Gly Arg Lys Arg Gly Gly Gly Val Asp Gly Val

165 170 175

Val Glu Lys Thr Val Glu Arg Arg Gln Lys Arg Met Ile Lys Asn Arg

180 185 190

Glu Ser Ala Ala Arg Ser Arg Ala Arg Lys Gln Ala Tyr Thr Asn Glu

195 200 205

Leu Glu Asn Lys Ile Ser Arg Leu Glu Glu Glu Asn Gln Arg Leu Arg

210 215 220

Glu His Lys Ala Val Ala Asp Phe Ser Thr Phe Pro Ser Cys Val Asp

225 230 235 240

Phe Leu Lys Ala Phe Leu Thr Gln Lys Leu Glu Pro Val Met Gln Ile

245 250 255

Val Pro Gln Pro Glu Pro Lys Gln Gln Leu Arg Arg Thr Thr Ser Ala

260 265 270

Ser Phe Ala Gly His Val Gly Ile Leu Val Ile Gly Cys Val Ala Ser

275 280 285

Gly His Ile Gly Val Leu Val Ile Gly Gly Ile Ala Thr Gly His Val

290 295 300

Gly Ile Gly Ile Val Gly Ala Val His Gly Thr Ala Gly Ser Ser Ala

305 310 315 320

Val Ala Leu Gly

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acagccctgg aacattggcc 20

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tagttaagaa aagagttcgt cg 22

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aaaaagcagg ctatgggagt ccacgca 27

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

agaaagctgg gtttagaaag aggc 24

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggct 29

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggt 29

Claims

1.一种OsbZIP62V基因或其编码的蛋白在用于提高水稻重要农艺性状中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述水稻重要农艺性状包括提高水稻株高、穗长、每穗粒数和一/二次枝梗数。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，包括构建OsbZIP62V超量表达载体，导入植物细胞，获得转基因植株。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，将水稻中的OsbZIP62基因重组克隆到含转录激活域变体VP64的超量表达载体中，获得所述OsbZIP62V超量表达载体。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述转录激活域变体VP64为疱疹病毒来源。

6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，构建OsbZIP62V超量表达载体所选用的载体为Ti质粒或植物病毒载体。

7.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述OsbZIP62V基因的序列为SEQ ID NO.1中所示的DNA序列，或者与SEQ ID NO:1至少90％同源的DNA序列，或者其功能相当于SEQ IDNO:1所示序列的亚片段。

8.如权利要求1所述的应用，其特征在于，OsbZIP62V基因编码的蛋白的氨基酸序列为序列表SEQ ID NO:2所示，或者SEQ ID NO:2序列的同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体或诱导突变体。