CN1121410C - N－甲基－d－苯丙氨酰基－n－[1－[3－[(氨基亚氨基甲基)－氨基]丙基]－3,3－二氟－2－氧代己基]－l－脯氨酰胺的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过直接脒化Dakin-West中间体来制备N-甲基-D-苯丙氨酰基-N-[1-[3-[(氨基亚氨基甲基)氨基]丙基]-3，3-二氟-2-氧代己基]-L-脯氨酰胺或其可药用盐以及关键中间体的新方法。

Description

N-甲基-D-苯丙氨酰基-N-[1-[3-[(氨基亚氨基甲基)- 氨基]丙基]-3，3-二氟-2-氧代己基]-L-脯氨酰胺的制备方法
                   发明领域
本发明涉及制备N-甲基-D-苯丙氨酰基-N-[1-[3-[(氨基亚氨基甲基)氨基]丙基]-3，3-二氟-2-氧代己基]-L-脯氨酰胺及其可药用盐的新方法。
                       发明背景
N-甲基-D-苯丙氨酰基-N-[1-[3-[(氨基亚氨基甲基)氨基]丙基]-3，3-二氟-2-氧代己基]-L-脯氨酰胺二盐酸盐一水合物(也称为“MDL75579DA”)记载于美国专利5391705中，它同时是凝血酶和类胰蛋白酶的抑制剂。该化合物可作为抗凝剂用于治疗血栓性静脉炎、冠状动脉血栓形成，并可用于治疗哮喘。N-甲基-D-苯丙氨酰基-N-[1-[3-[(氨基亚氨基甲基)氨基]丙基]-3，3-二氟-2-氧代己基]-L-脯氨酰胺二盐酸盐一水合物的生物化学和药理学作用记载于R.J.Broersma等， 血栓形成和止血 (Thrombosis and Haemostasis)69，666(1993)和B.Neises等， 生物有 机医学化学(Bioorg.Med.Chem.)3，1049-1061(1995)中。
美国专利5391705公开了从硝基中间体会聚制备N-甲基-D-苯丙氨酰基-N-[1-[3-[(氨基亚氨基甲基)氨基]丙基]-3，3-二氟-2-氧代己基]-L-脯氨酰胺二盐酸盐一水合物的方法。例如，将4-氨基-1-硝基丁烷盐酸盐直接用二-Boc-S-甲基异硫脲脒化。然后将所述脒化的产物与2，2-二氟戊烯-1-醛乙基半缩醛偶联，形成5-羟基-6-硝基中间体，将其通过催化氢化还原得到5-羟基-6-氨基中间体。然后将5-羟基-6-氨基中间体与N-Boc-N-甲基-D-Phe-L-Pro二肽中间体偶联并将偶联后的肽用一般的氧化方法如Swern氧化法氧化，形成N-甲基-D-苯丙氨酰基-N-[1-[3-[(氨基亚氨基甲基)氨基]丙基]-3，3-二氟-2-氧代己基]-L-脯氨酰胺二盐酸盐一水合物。
另外，B.Neises等在 Bioorg.Med.Chem.3，1049-1061(1995)中公开了、并且美国专利5391705也建议了使用改进的Dakin-West反应，从2-苯基-[4-(3-苄氧羰基氨基丙基)]-5-(4H)-噁唑啉酮和2，2-二氟-4-戊烯酸的酸酐或酰卤反应制得9，6-二氨基-5-羟基-4，4-二氟壬烷二盐酸盐。然后将该二盐酸盐用三步脒化法脒化，所述三步脒化法包括，用三氟乙酸酐(“TFAA”)保护内胺，将末端胺脒化和脱除TFA保护基。然后将得到的5-羟基-6-氨基中间体与N-Boc-N-甲基-D-Phe-L-Pro二肽中间体偶联，并将偶联后的肽用一般的氧化方法如Swern氧化法氧化，形成N-甲基-D-苯丙氨酰基-N-[1-[3-[(氨基亚氨基甲基)氨基]丙基]-3，3-二氟-2-氧代己基]-L-脯氨酰胺二盐酸盐一水合物。
但这些方法有一些缺点。就使用适宜硝基中间体的方法而言，4-脒基-1-硝基丁烷中间体的制备存在困难。例如，当将亚硝酸钠加入到原料溴丁基邻苯二甲酰亚胺中时，由于亚硝酸酯的形成，很难以高产率得到所需的硝基丁基邻苯二甲酰亚胺中间体。另外，还必需将亚硝酸酯水解并与所需的硝基丁基邻苯二甲酰亚胺分离。此外，还需使用过量的肼以除去邻苯二甲酰亚氨基。为了除去有毒的肼，必需向粗产物混合物中加入过量昂贵的试剂Boc2O，而相应的氨基甲酸酯必需通过色谱法除去。除了难以制备适宜的4-脒基-1-硝基丁烷中间体外，还难以达到可接受的产品纯度(＞97％)，在合成时需要大量进行色谱纯化。
就Dakin-West路线而言，三步脒化法的终产物MD L75579DA的收率很低，从N-9-[1-[3-[二[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]亚甲基]氨基-6-氨基-5-羟基-4，4-二氟壬烷中间体开始，收率仅为约15％。此外，使用Dakin-West三步脒化路线时，仅能达到约92％的产品纯度。此外，由于担心会脒化未保护的内胺(即6-氨基)，现有技术中教导并建议在选择性脒化9，6-二氨基-5-羟基-4，4-二氟壬烷二盐酸盐时需要将内胺保护；K.Hofmann等，美国化学学会会志(J.Am.Chem.Soc.)  82，3727-3732(1960)；K.Marayanan和O.Griffith，医学化学杂志(J.Med.Chem.)37，885-887(1994)；F.Weygard and R.Geiger，德国化学学会会志(Berichte de Deutschen Chemishen Gellellschaft)，89，647(1956)。
本发明的目的之一是提供制备N-甲基-D-苯丙氨酰基-N-[1-[3-[(氨基亚氨基甲基)氨基]丙基]-3，3-二氟-2-氧代己基]-L-脯氨酰胺或其可药用盐的新方法，该方法可选择性地一步脒化所需的Dakin-West中间体，克服了制备4-脒基-1-硝基丁烷中间体的困难。
本发明的另一目的是提供经济地制备N-甲基-D-苯丙氨酰基-N-[1-[3-[(氨基亚氨基甲基)氨基]丙基]-3，3-二氟-2-氧代己基]-L-脯氨酰胺或其可药用盐的新方法，与所公开的现有技术相比，该方法的步骤和纯化次数更少。
本发明的又一目的是提供了制备N-9-[1-[3-[二(K1-保护的)氨基]亚甲基]氨基]-6-氨基-5-羟基-4，4-二氟壬烷的新方法，其中K1是适于保护脒基上氮的N-保护基，该物质是用于制备N-甲基-D-苯丙氨酰基-N-[1-[3-[(氨基亚氨基甲基)氨基]丙基]-3，3-二氟-2-氧代己基]-L-脯氨酰胺或其可药用盐的所需中间体。
通过下述发明实现了上述以及其它的目的。
                          发明概述
本发明涉及制备N-甲基-D-苯丙氨酰基-N-[1-[3-[(氨基亚氨基甲基)氨基]丙基]-3，3-二氟-2-氧代己基]-L-脯氨酰胺或其可药用盐的新方法，该方法包括如下步骤：
(a)将9，6-二氨基-5-羟基-4，4-二氟壬烷或其可药用盐与适宜的脒化试剂反应，得到N-9-[1-[3-[二(K1-保护的)氨基]亚甲基]氨基]-6-氨基-5-羟基-4，4-二氟壬烷，其中K1是适于保护脒基上氮的N-保护基；
(b)将N-9-[1-[3-[二(K1-保护的)氨基]亚甲基]氨基]-6-氨基-5-羟基-4，4-二氟壬烷与N-K2-保护的-N-甲基-D-苯丙氨酰基-L-脯氨酰胺偶联，得到N-K2-保护的-N-甲基-D-苯丙氨酰基-N-[1-[3-[[二(K1-保护的)氨基]亚甲基]氨基]丙基]-3，3-二氟-2-羟基己基]-L-脯氨酰胺，其中K2是N-保护基；
(c)将N-K2-保护的-N-甲基-D-苯丙氨酰基-N-[1-[3-[[二(K1-保护的)氨基]亚甲基]氨基]丙基]-3，3-二氟-2-羟基己基]-L-脯氨酰胺与适宜的氧化剂反应，得到N-K2-保护的-N-甲基-D-苯丙氨酰基-N-[1-[3-[[二(K1-保护的)氨基]亚甲基]氨基]丙基]-3，3-二氟-2-氧代己基]-L-脯氨酰胺；和
(d)用适宜的脱保护试剂将N-K2-保护的-N-甲基-D-苯丙氨酰基-N-[1-[3-[[二(K1-保护的)氨基]亚甲基]氨基]丙基]-3，3-二氟-2-氧代己基]-L-脯氨酰胺脱保护，得到N-甲基-D-苯丙氨酰基-N-[1-[3-[(氨基亚氨基甲基)氨基]丙基]-3，3-二氟-2-氧代己基]-L-脯氨酰胺或其可药用盐。
本发明还提供制备N-9-[1-[3-[二(K1-保护的)氨基]亚甲基]氨基]-6-氨基-5-羟基-4，4-二氟壬烷的方法，包括将9，6-二氨基-5-羟基-4，4-二氟壬烷或其可药用盐与适宜的脒化试剂反应，得到N-9-[1-[3-[二(K1-保护的)氨基]亚甲基]氨基]-6-氨基-5-羟基-4，4-二氟壬烷，其中K1是适于保护脒基上氮的N-保护基。
                         发明详述本申请中：a)符号“ ”指未指定立体化学的键。b)符号“ ”指伸向纸平面外的键。c)符号“ ”指伸向纸平面内的键。d)术语“可药用盐”指酸加成盐。
“可药用酸加成盐”用来表示N-甲基-D-苯丙氨酰基-N-[1-[3-[(氨基亚氨基甲基)氨基]丙基]-3，3-二氟-2-氧代己基]-L-脯氨酰胺或其中间体的所有无毒的有机或无机酸加成盐。可形成适宜盐的无机酸的例子包括盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸，以及酸性金属盐如磷酸一氢钠和硫酸氢钾。可形成适宜盐的有机酸的例子包括一元、二元和三元羧酸。这些酸的例子是，例如乙酸、三氟乙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、马来酸、羟基马来酸、苯甲酸、羟基苯甲酸、苯乙酸、肉桂酸、水杨酸、2-苯氧基苯甲酸和磺酸如甲磺酸和2-羟基乙磺酸。这些盐可以以水合物或基本无水的形式存在。
立体异构体是仅在原子的空间取向上不同的异构体。它包括具有一个以上手性中心的化合物的彼此不成镜像的异构体(非对映体或非对映异构体)。术语“对映体”是指两个互为镜像的不能重叠的立体异构体。术语“手性中心”是指连接了四个不同基团的碳原子。所采用的L/D或R/S命名法如IUPAC-IUB的生化命名联合委员会(Joint Commission onBiochemical Nomenculature)，欧洲生物化学杂志( Eur.J.Biochem.)138，9-37(1984)中所记载。手性物质可含有等量的R和S异构体(或L和D异构体)，这种情况被称为“外消旋的”或“外消旋体”，也可含有不等量的R和S异构体(或L和D异构体)，这种情况被称为“光学活性的”或“非外消旋的”。
术语“适于保护脒基上氮的N-保护基”包括叔丁氧羰基(Boc)、苄氧羰基(Cbz)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)等。
术语“N-保护基”包括适用于多肽合成的所有N-保护基，参见Greene，“有机化学中的保护基(Protective Groups in OrganicChemistry)”，第7章，John Wiley & Sons，New York(1981)。说明性的例子包括但不仅限于叔丁氧羰基(Boc)、苄氧羰基(Cbz)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)等。
本文所用的术语“氨基酸”包括天然氨基酸，它们是从基因编码转译的并且构成了蛋白质的结构单元。除非特别说明，术语氨基酸包括(L)-和(D)-氨基酸、化学修饰的氨基酸如氨基酸类似物、以及通常不掺入蛋白质中的天然氨基酸。包括在本说明书范围内的氨基酸类似物以及氨基和羧基保护基的缩写如表1所列。
           表1
  氨基酸或保护基     符号
  精氨酸苯丙氨酸鸟氨酸脯氨酸叔丁氧羰基苄氧羰基     ArgPheOrnProBocCbz
    乙酰基琥珀酰基苯乙酰氨基甲基     AcSucPAM
反应方案A列出了制备N-甲基-D-苯丙氨酰基-N-[1-[3-[(氨基亚氨基甲基)氨基]丙基]-3，3-二氟-2-氧代己基]-L-脯氨酰胺的一般合成方法。在反应方案A中，除非另有说明，原料和试剂均是本领域普通技术人员熟知的。反应方案A
Figure C9719331700111
在反应方案A步骤a中，将9，6-二氨基-5-羟基-4，4-二氟壬烷或其可药用盐1与适宜的脒化试剂反应，得到N-9-[1-[3-[二(K1-保护的)氨基]亚甲基]氨基]-6-氨基-5-羟基-4，4-二氟壬烷2。
例如，将9，6-二氨基-5-羟基-4，4-二氟壬烷或其可药用盐1与适宜的脒化试剂接触。适宜的脒化试剂是本领域熟知的，可用如下结构式1a表示：
Figure C9719331700121
其中K1是适于保护脒基上氮的N-保护基，包括叔丁氧羰基(Boc)、苄氧羰基(Cbz)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)等，优选叔丁氧羰基。取代基LG指适宜的离去基团，包括-S-CH3、1-吡唑等。适宜的脒化试剂包括但不限于，二-Boc-脒基吡唑、二-Boc-S-甲基异硫脲、二-Cbz-脒基吡唑等，优选二-Boc-脒基吡唑。反应在适宜碱的存在下进行。适宜的碱可用来中和9，6-二氨基-5-羟基-4，4-二氟壬烷或其可药用盐1中内胺的盐，或用来中和适宜的脒化试剂如二-Boc-脒基吡唑在反应过程中产生并释放出来的酸。适宜的碱包括但不限于，三乙胺、异丙基二乙胺、N-甲基-吗啉、吡啶、碳酸氢钠和碳酸钠。反应在适宜溶剂如二氯甲烷、二甲基甲酰胺、四氢呋喃或四氢呋喃/水混合物中进行。为了使9，6-二氨基-5-羟基-4，4-二氟壬烷或其可药用盐1中的内胺脒化的机会最小，对于每1.0摩尔当量的9，6-二氨基-5-羟基-4，4-二氟壬烷或其可药用盐1，脒化试剂的加入比例为约0.9-约1.2摩尔当量，优选约0.95-1.05摩尔当量。反应在约-30℃至约20℃的温度下进行，优选-15℃至5℃，首选-5℃至0℃。如本领域所熟知的，可通过萃取和蒸发将N-9-[1-[3-[二(K1-保护的)氨基]亚甲基]氨基]-6-氨基-5-羟基-4，4-二氟壬烷2从反应区分离出来。随需要，可将N-9-[1-[3-[二(K1-保护的)氨基]亚甲基]氨基]-6-氨基-5-羟基-4，4-二氟壬烷2通过本领域公知的技术如色谱和重结晶进行纯化。
在反应方案A步骤b中，N-9-[1-[3-[二(K1-保护的)氨基]亚甲基]氨基]-6-氨基-5-羟基-4，4-二氟壬烷2与N-K2-保护的-N-甲基-D-苯丙氨酰基-L-脯氨酰胺(K2-N-甲基-D-Phe-L-Pro)偶联，得到N-K2-保护的-N-甲基-D-苯丙氨酰基-N-[1-[3-[[二(K1-保护的)氨基]亚甲基]氨基]丙基]-3，3-二氟-2-羟基己基]-L-脯氨酰胺3。
例如，用本领域技术人员熟知的标准液相肽合成技术，将N-9-[1-[3-[二(K1-保护的)氨基]亚甲基]氨基]-6-氨基-5-羟基-4，4-二氟壬烷2与K2-N-甲基-D-Phe-L-Pro偶联，其中K2是N-保护基，优选叔丁氧羰基(Boc)。标准液相肽合成技术包括叠氮化物法、碳酸-羧酸混合酐(氯甲酸异丁酯)法、碳化二亚胺(二环己基碳化二亚胺、二异丙基碳化二亚胺或水溶性碳化二亚胺)法、活泼酯(对硝基苯酯、N-羟基-琥珀酰亚胺酯)法、Woodward试剂K法、羰基二咪唑法、磷试剂如BOP-Cl或氧化还原法。优选用碳化二亚胺法偶联。可通过加入1-羟基苯并三唑使其中的一些方法(特别是碳化二亚胺法)得到改进。例如，将N-Boc-N-甲基-D-Phe-L-Pro(美国专利5391705，1995年2月21日授权)在惰性气氛如氮气下溶于适宜的有机溶剂如二氯甲烷中，随需要可加入约1当量的1-羟基苯并三唑(HOBt)。向该溶液中加入约1当量溶于适宜有机溶剂如二氯甲烷中的N，N’-二环己基碳化二亚胺(DCC)。将反应混合物搅拌约1-15小时。向该混合物中加入1-4当量适宜的碱如N-甲基吗啉或三乙胺和至少1摩尔当量溶于适宜有机溶剂如二氯甲烷中的N-9-[1-[3-[二(K1-保护的)氨基]亚甲基]氨基]-6-氨基-5-羟基-4，4-二氟壬烷2。然后将反应混合物搅拌约1-15小时。然后可通过本领域熟知的技术如萃取、沉淀、结晶和色谱法将偶联产物N-K2-保护的-N-甲基-D-苯丙氨酰基-N-[1-[3-[[二(K1-保护的)氨基]亚甲基]氨基]丙基]-3，3-二氟-2-羟基己基]-L-脯氨酰胺3分离和纯化。
在反应方案A步骤c中，  将N-K2-保护的-N-甲基-D-苯丙氨酰基-N-[1-[3-[[二(K1-保护的)氨基]亚甲基]氨基]丙基]-3，3-二氟-2-羟基己基]-L-脯氨酰胺3与适宜的氧化剂反应，得到N-K2-保护的-N-甲基-D-苯丙氨酰基-N-[1-[3-[[二(K1-保护的)氨基]亚甲基]氨基]丙基]-3，3-二氟-2-氧代己基]-L-脯氨酰胺4。
例如，用本领域技术人员熟知的常规氧化技术，将N-K2-保护的-N-甲基-D-苯丙氨酰基-N-[1-[3-[[二(K1-保护的)氨基]亚甲基]氨基]丙基]-3，3-二氟-2-羟基己基]-L-脯氨酰胺3与适宜的氧化剂如高碘化物(periodinane)、铬酐吡啶复合物、重铬酸吡啶鎓或二甲亚砜复合物如DMSO-(COCl)2(Swern条件)反应，生成N-K2-保护的-N-甲基-D-苯丙氨酰基-N-[1-[3-[[二(K1-保护的)氨基]亚甲基]氨基]丙基]-3，3-二氟-2-氧代己基]-L-脯氨酰胺4。常规氧化技术例如包括：Swern氧化法， 合成 (Synthesis)，165(1981)；Dess Martin periodinane反应，DessMartin， 有机化学杂志(J.Org.Chem.)48，4155(1983)和Jones氧化法(参见美国专利5391705)；优选Swern氧化法。例如，将约1.5当量的草酰氯溶于适宜的无水有机溶剂如二氯甲烷中，然后冷却至约-55℃至约-78℃。向该溶液中滴加约3至约8当量二甲亚砜，将温度保持在约-55℃或更低。将等当量N-K2-保护的-N-甲基-D-苯丙氨酰基-N-[1-[3-[[二(K1-保护的)氨基]亚甲基]氨基]丙基]-3，3-二氟-2-羟基己基]-L-脯氨酰胺3溶于适量元水有机溶剂如二氯甲烷中，然后在搅拌下缓慢加入反应液中。加料结束后，将反应液于约-55℃至约-78℃的温度下搅拌约30分钟，加入过量适宜的有机碱如三乙胺或N-甲基吗啉并将反应液升温至室温。然后可通过本领域技术人员熟知的技术如萃取、沉淀、结晶和色谱法将氧化产物N-K2-保护的-N-甲基-D-苯丙氨酰基-N-[1-[3-[[二(K1-保护的)氨基]亚甲基]氨基]丙基]-3，3-二氟-2-氧代己基]-L-脯氨酰胺4分离和纯化。
在反应方案A步骤d中，将N-K2-保护的-N-甲基-D-苯丙氨酰基-N-[1-[3-[[二(K1-保护的)氨基]亚甲基]氨基]丙基]-3，3-二氟-2-氧代己基]-L-脯氨酰胺4与适宜的脱保护试剂反应，得到N-甲基-D-苯丙氨酰基-N-[1-[3-[(氨基亚氨基甲基)氨基]丙基]-3，3-二氟-2-氧代己基]-L-脯氨酰胺5。
例如，将N-K2-保护的-N-甲基-D-苯丙氨酰基-N-[1-[3-[[二(K1-保护的)氨基]亚甲基]氨基]丙基]-3，3-二氟-2-氧代己基]-L-脯氨酰胺4与适宜的脱保护试剂如盐酸的二氧六环或乙酸乙酯溶液、三氟乙酸或其二氯甲烷溶液反应。氨基保护基的裂解条件记载于Greene，“有机化学中的保护基(Protective Groups in Organic Chemistry)”，第7章，John Wiley &Sons，New York(1981)。例如，将N-K2-保护的-N-甲基-D-苯丙氨酰基-N-[1-[3-[[二(K1-保护的)氨基]亚甲基]氨基]丙基]-3，3-二氟-2-氧代己基]-L-脯氨酰胺4溶于盐酸/乙酸乙酯中，搅拌一至数小时。然后向反应混合物中通入无水氯化氢气体约10-15分钟，将反应混合物搅拌约20-40分钟，然后浓缩。将残余物溶于水并随需要用碳酸氢钠中和。然后可通过本领域技术人员熟知的技术如萃取、沉淀、结晶和色谱法将脱保护的产物N-甲基-D-苯丙氨酰基-N-[1-[3-[(氨基亚氨基甲基)氨基]丙基]-3，3-二氟-2-氧代己基]-L-脯氨酰胺5分离和纯化。本领域技术人员可用本领域熟知的技术和方法制备N-甲基-D-苯丙氨酰基-N-[1-[3-[(氨基亚氨基甲基)氨基]丙基]-3，3-二氟-2-氧代己基]-L-脯氨酰胺5的可药用盐。
制备终产物5所需的中间体9，6-二氨基-5-羟基-4，4-二氟壬烷二盐酸盐1可用改进的Dakin-West反应制得，在美国专利5391705和如下反应方案B中说明了该反应。该方法所用的试剂、原料和技术是本领域技术人员易得的。反应方案B
Figure C9719331700161
在反应方案B步骤a中，将δ-K-L-鸟氨酸6根据本领域技术人员熟知的常规N-保护技术进行Nα-保护，得到Nα-K-Nδ-苄氧羰基-鸟氨酸7，其中的K指如反应方案A步骤a中所述的适宜保护基，优选Cbz。
例如，将δ-Cbz-L-鸟氨酸6用苯甲酰氯和常规的Schotten-Baumann条件进行Nα-保护。具体地讲，将苯甲酰氯在醚类溶剂如乙醚中的溶液与氢氧化钠一起，在约0.5-1小时内加入到δ-Cbz-L-鸟氨酸6的氢氧化钠溶液中，同时保持反应温度在0℃至约5℃。然后将反应混合物室温搅拌约4小时，用醚类溶剂如乙醚萃取并用浓盐酸溶液酸化至约pH 1。加入水并将该混合物放置约48小时。通过本领域技术人员公知的技术收集和纯化固体，得到Nα-K-Nδ-苄氧羰基-鸟氨酸7。
在反应方案B步骤b中，将Nα-K-Nδ-苄氧羰基-鸟氨酸7环化得到2-苯基-[4-(3-K-氨基丙基)]-5-(4H)-噁唑啉酮8。
例如，将Nα-K-Nδ-苄氧羰基-鸟氨酸7在适宜有机溶剂如二氯甲烷中的浆液与约0.1-1.0摩尔当量的二环己基碳化二亚胺接触。然后将反应混合物搅拌约2-5小时，滤除形成的二环己基脲副产物沉淀并用适宜的有机溶剂如二氯甲烷洗涤。然后将滤液浓缩并用适宜的醚类溶剂如乙醚稀释，如需要，可重复该过程。然后通过本领域技术人员公知的技术如沉淀和结晶将环化产物2-苯基-[4-(3-K-氨基丙基)]-5-(4H)-噁唑啉酮8分离和纯化。
在反应方案B步骤c中，将2-苯基-[4-(3-K-氨基丙基)]-5-(4H)-噁唑啉酮8根据常规的酰化技术酰化得到相应的结构式9的O-酰基化合物。
例如，在约-10℃至约10℃及惰性气氛、优选氮气下，将适宜的叔胺如三乙胺加入到2-苯基-[4-(3-K-氨基丙基)]-5-(4H)-噁唑啉酮8在适宜有机溶剂如四氢呋喃或四氢呋喃/庚烷混合物的溶液中。向反应混合物中缓慢加入α，α-二氟戊烯酰氯或相应酸酐在适宜有机溶剂如庚烷中的溶液，同时保持反应温度在约-10℃和10℃之间。约30至60分钟后，将反应混合物升温至室温并继续搅拌约30分钟。通过本领域公知的提取技术如过滤除去三乙胺盐酸盐，将滤液浓缩得到相应的结构式9的O-酰基化合物。
在反应方案B步骤d中，将相应的结构式9的O-酰基化合物任意地与酰化催化剂反应得到相应的结构式10的C-酰基化合物。
例如，将相应的结构式9的O-酰基化合物溶于适宜的有机溶剂如四氢呋喃中并与酰化催化剂如二烷基氨基吡啶、优选4-二甲氨基吡啶(DMAP)接触。然后将反应混合物室温搅拌约2-4小时得到结构式10的C-酰基化合物，该产物不经分离或纯化直接使用。
在反应方案B步骤e中，将结构式10的C-酰基化合物用脱羧剂脱羧得到Nδ-9-K-氨基-6-苯甲酰氨基-5-氧代-4，4-二氟-1-壬烯11，所述脱羧剂例如是草酸、琥珀酸等，优选草酸。
例如，将含有1-5摩尔当量无水草酸在适宜有机溶剂如四氢呋喃中的溶液加入到含有结构式10的C-酰基化合物的反应方案B步骤d的反应混合物中，搅拌16-32小时。然后将反应混合物浓缩并用适宜的酸如盐酸处理，然后用乙酸乙酯萃取。分层，将有机层用适宜的碱如碳酸钠、碳酸氢钠或氢氧化钠洗涤，随需要，用盐水洗涤，用适宜干燥剂如硫酸镁干燥并浓缩。然后通过本领域技术人员公知的技术如沉淀和结晶将脱羧产物Nδ-9-K-氨基-6-苯甲酰氨基-5-氧代-4，4-二氟-1-壬烯11分离和纯化。
在反应方案B步骤f中，将Nδ-9-K-氨基-6-苯甲酰氨基-5-氧代-4，4-二氟-1-壬烯11与适宜的还原剂接触得到Nδ-9-K-氨基-6-苯甲酰氨基-5-羟基-4，4-二氟-1-壬烯12。
正如本领域所熟知的，该还原反应生成的5-羟基衍生物是在5-位是立体异构体的混合物。
适宜的还原剂是本领域公知的，它包括但不限于三叔丁氧基氢化锂铝、硼氢化钾、三仲丁基硼氢化锂、硼氢化锂、硼氢化钠和三乙基硼氢化锂，优选硼氢化钠。
例如，将Nδ-9-K-氨基-6-苯甲酰氨基-5-氧代-4，4-二氟-1-壬烯11与摩尔过量的适宜还原剂接触。该反应在适宜溶剂中进行。适于氢化物还原的适宜溶剂是本领域公知的，例如甲苯、乙醚、甲基叔丁基醚、四氢呋喃(THF)和四氢呋喃/乙醇混合物。反应在-78℃至约10℃的温度范围内进行。可通过萃取将还原产物Nδ-9-K-氨基-6-苯甲酰氨基-5-羟基-4，4-二氟-1-壬烯12从反应区分离出来，然后通过本领域公知的方法如色谱和重结晶进行纯化。
在反应方案B步骤g中，将Nδ-9-K-氨基-6-苯甲酰氨基-5-羟基-4，4-二氟-1-壬烯12与适宜的烯烃还原剂和适宜的脱保护剂接触得到9，6-二氨基-5-羟基-4，4-二氟壬烷1。
适宜的烯烃还原剂包括二硼烷、二异烷基硼烷、硼烷/叔胺复合物和存在氢化催化剂下的氢。最优选的烯烃还原剂是存在氢化催化剂下的氢。氢化催化剂的例子包括铂、钯、铑、钌和镍。金属本身以及这些金属的某些可溶性配合物均具有催化活性，所述金属可以是细微分散的固体或是吸附在惰性载体如碳或氧化铝上。
适宜的脱保护剂包括反应方案A步骤d中所述的那些。其它脱保护剂以及裂解保护基的条件是本领域公知的，并记载于Greene著的“有机化学中的保护基”，第7章，John Wiley & Sons，New York(1981)。
例如，将Nδ-9-K-氨基-6-苯甲酰氨基-5-羟基-4，4-二氟-1-壬烯12溶于适宜的醇如异丙醇和适宜的酸如盐酸中。然后将该溶液用烯烃还原剂如吸附在惰性碳载体上的氢氧化钯处理并在氢气(40-60磅/平方英寸)下振摇约20-30小时。将反应混合物过滤并浓缩，得到Nα-苯甲酰基-二氟醇盐酸盐。然后将Nα-苯甲酰基-二氟醇盐酸盐与适宜的脱保护剂如盐酸接触并加热回流。将反应混合物冷却至室温，过滤，将滤液用乙醚萃取并分层。将水层用活性炭处理，加热，过滤并浓缩，得到9，6-二氨基-5-羟基-4，4-二氟壬烷1。本领域技术人员可用本领域公知的技术和方法制备的9，6-二氨基-5-羟基-4，4-二氟壬烷1的可药用盐。
制备结构式9的O-酰基化合物所需的中间体α，α-二氟戊烯酰氯8a可按照美国专利5391705和反应方案C中的描述制得。该方法所用的试剂、原料和技术是本领域技术人员易得的。
反应方案C
Figure C9719331700191
在反应方案C步骤a中，通过用本领域公知的技术和方法如碱水解将α，α-二氟戊烯酸乙酯8b(美国专利5391705，1995年2月21日授权)水解制得2，2-二氟-4-戊烯酸8c。
例如，将约1.0-1.5摩尔当量的适宜碱如氢氧化锂于-10℃至约10℃下加入到α，α-二氟戊烯酸乙酯8b(也称为2，2-二氟-4-戊烯酸乙酯，美国专利4848401，1989年7月11日授权)的水溶液中。将反应混合物升温至室温约2-4小时，然后在约40℃-约55℃继续加热2-4小时。从反应混合物中除去乙醇和水，可通过萃取将2，2-二氟-4-戊烯酸8c从反应区分离出来，并可通过本领域公知的方法纯化。
在反应方案C步骤b中，将2，2-二氟-4-戊烯酸8c与适宜的氯化剂接触得到2，2-二氟-4-戊烯酰氯8a。
适宜的氯化剂是可将羟基转变成氯而不会造成原料或产物降解的试剂。适宜的氯化剂包括三氯化磷、亚硫酰氯、草酰氯等。
例如，将2，2-二氟-4-戊烯酸8c与约1.0-1.5摩尔当量的适宜氯化剂接触。反应在适宜溶剂如二氯甲烷、甲苯或二甲基甲酰胺中进行。反应在约20℃-约35℃下进行，通常需要约4-24小时。可通过分馏将产物2，2-二氟-4-戊烯酰氯8a分离出来，并可通过本领域公知的技术如色谱法进行纯化。
N-甲基化的α-氨基酸可按照反应方案D和B.S.Pitzele等在 医学化学 杂志(J.Med.Chem.)，37，888-896(1994)(该文献全文引入本文作为参考)中的描述制备。若无另有说明，所用取代基均如前所定义。试剂和原料是本领域技术人员易得的。反应方案
在反应方案D步骤a中，将结构式13的α-氨基酸与适宜的保护基“K”按照与反应方案A步骤b中所述方法相似的方式偶联得到偶联产物，式13中的X是适宜的α-羧基保护基如甲酯或固相树脂，保护基“K”如反应方案A步骤a中所定义。
在反应方案D步骤b中，将偶联产物在本领域公知的条件下脱保护或从固相上裂解下来得到结构式14的酸。例如，当结构式13中的X是甲基或乙基时，将化合物溶于适宜的有机溶剂如乙醇中并用约等体积的水处理。搅拌下，向该溶液中加入1-2当量的氢氧化锂并将反应液搅拌1-6小时。然后通过本领域公知的技术将形成的酸分离和纯化。例如，减压蒸除有机溶剂并将剩余的含水溶液用稀盐酸酸化。然后将水相用适宜的有机溶剂如乙酸乙酯萃取，将合并的有机萃取液用无水硫酸镁干燥，过滤并减压浓缩。残余物可用适宜的洗脱剂如甲醇/氯仿通过闪式硅胶色谱纯化，得到结构式14的酸。
在反应方案D步骤c中，将酸14 N-甲基化得到结构式15的N-保护N-甲基化的化合物。例如，将酸14溶于适宜的有机溶剂如四氢呋喃中，冷却至约0℃并用过量碘甲烷处理。然后向溶液中加入1-3当量氢化钠，并将该溶液于0℃搅拌约10分钟，然后升温至室温搅拌24-48小时。然后通过本领域公知的技术如萃取的方法将产物分离。例如，加入稀盐酸水溶液并将反应液用适宜的有机溶剂如乙酸乙酯萃取。合并有机萃取液，用5％硫代硫酸钠、盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥，通过硅胶垫过滤并减压浓缩得到结构式15的N-保护N-甲基化的化合物。
或者，结构式15的N-保护N-甲基化的化合物可以按照反应方案D步骤d和e中描述的方法从结构式14的酸制备。
在反应方案D步骤d中，将酸14环化得到结构式14a的噁唑烷。例如，将酸14溶于适宜的有机溶剂如苯中，并用过量的多聚甲醛处理。向其中加入约0.2-0.4当量对甲苯磺酸并将反应液加热回流约23小时，用Dean-Stark分水器连续除水。然后将反应液冷却至室温并通过本领域公知的技术将产物分离和纯化。例如，将冷却的反应液减压浓缩，将残余物加入适宜的有机溶剂如乙酸乙酯中，用饱和碳酸氢钠洗涤，将有机相用无水硫酸镁干燥，过滤并减压浓缩。然后将残余物用适宜的洗脱剂如乙酸乙酯/己烷通过闪式硅胶色谱纯化得到噁唑烷14a。
在反应方案D步骤e中，将噁唑烷14a在本领域公知的条件下还原得到结构式15的N-保护N-甲基化的化合物。例如，将噁唑烷14a溶于适宜的有机溶剂如氨仿中并用过量三氟乙酸处理。室温搅拌下向该溶液中加入过量的三乙基甲硅烷。将反应液搅拌1-7天，然后减压浓缩得到结构式15的N-保护N-甲基化的化合物。
以下实施例代表反应方案A-D所述的一般合成方法。应当理解，这些实施例仅仅是说明性的，并非想以任何方式限制本发明的范围。
本文所用的下列术语的含义如下：“g”指克；“mmol”指毫摩尔；“mL”指毫升；“bp”指沸点；“mp”指熔点；“℃”指摄氏度；“mm Hg”指毫米汞柱；“μL”指微升；“μg”指微克；“μM”指微摩尔’“eq”指摩尔当量；“conc”指浓的；“sat”指饱和的。
                  实施例12，2-二氟-4-戊烯酸8c的制备
反应方案C步骤a：0-5℃下，于5分钟内向α，α-二氟戊烯酸乙酯8b(80g，0.49mmol，美国专利4847401，1989年7月11日授权)的水(80mL)溶液中加入氢氧化锂(20.9g，0.5mmol)。将反应混合物升温至室温3小时，然后于45-50℃加热约3小时。从反应混合物中除去乙醇和水(60托，45℃)。将得到的橙色油状物干燥(1托，室温)2小时得到油状固体。将该油状固体用水(75mL)稀释并用浓盐酸酸化至pH为1。将反应混合物用乙醚萃取(3×150mL)。向水层加入浓盐酸至pH为1，将水层再次用乙醚萃取(3×100mL)。将合并的有机层干燥(硫酸镁)，浓缩成油并蒸馏得到58.8g，432mmol油状标题化合物8c，收率88％。
19F NMR(CDCl3)δ-106.8(t)(CFCl3作对比)；13C NMR(CDCl3)δ168.3(t，CO2H)，126.4(s，C＝C)，122.3(s，C＝C)，115.0(t，CF2)，38.9(t，CH2)；1H NMR(CDCl3)δ2.88(m，CH2，2H)，5.28(m，1H)，5.32(s，1H)，5.76(m，1H)，8.74(s，1H).
                    实施例22，2-二氟-4-戊烯酰氯8a的制备
反应方案C步骤b：室温下向化合物8c(25g，183.7mmol)和二甲基甲酰胺(3滴)中加入草酰氯(17.6mL，201.8mmol)。观察到气体溢出约2小时。5小时后，向反应混合物中再次加入0.08当量(1.2mL)草酰氯并搅拌18小时。分馏(88-91℃)得到24.4g，158mmol油状标题化合物8a，收率85％。19F NMR(CDCl3)δ-101.9(t)；13C NMR(CDCl3)δ167.3(t，CO2H)，125.5(s，C＝C)，123.1(s，C＝C)，115.6(t，CF2)，38.3(t，CH2)；1H NMR(CDCl3)δ2.90(m，2H)，5.33(d，1H)，5.36(s，1H)，5.74(m，2H).
                 实施例3N α -苯甲酰基-N δ -苄氧羰基-鸟氨酸7(K＝Cbz)的制备
反应方案B步骤a：向δ-Cbz-L-鸟氨酸6(50g，187.8mmol，Advanced Chemtech，Louisville，KY 40228-1075)在1 N氢氧化钠(250mL，0.25mol)中的溶液中于45分钟内同时加入苯甲酰氯(22mL，189.5mmol)的乙醚(200mL)溶液和1N氢氧化钠(313mL，0.31mol)，同时保持反应液温度在0-5℃之间。将反应混合物室温搅拌4小时，用乙醚萃取(3×100mL)并分出有机相。将水相用乙醚洗涤(3×100mL)并用浓盐酸酸化pH为1，得到白色固体。再次加入水(450mL)并将该混合物放置48小时。收集白色固体，用水(200mL)和乙醚(200mL)洗涤并于109℃(100托)干燥过夜，得到64.04g、173.9mmol白色固体状标题化合物7，收率92％。MS-FABm/z(％相对强度)371(M++1，25％)，393(M++Na，100％)；1H NMR(CDCl3)δ7.9(m，2H，芳酰基)，7.7(d，J＝8Hz，1H，NH)，7.5-7.2(m，8H，芳酰基，芳基)，6.3(m，1H，NH)，5.1(s，2H，苄基)，4.7(m，1H，CH)，3.20(q，2H，NCH2)，2.1-1.8，1.8-1.6(2m，4H，CH2-CH2).
                  实施例42-苯基-[4-(3-苄氧羰基氨基丙基)]-5-(4H)-噁唑啉酮8(K＝Cbz)的制备
反应方案B步骤b：向Nα-苯甲酰胺7(25g，676.5mmol)的二氯甲烷(250mL)浆液中分四次加入N，N’-二环己基碳化二亚胺(14.63g，70.9mmol)。将反应混合物搅拌3小时，观察到放热(5-10℃)。滤出二环己基脲沉淀并用二氯甲烷(100mL)洗涤。浓缩滤液得到黄色油，将其用乙醚(200mL)稀释，过滤并浓缩滤液得到淡黄色油。将该油用乙醚(150mL)稀释并滤除剩余的二环己基脲。将滤液在氢气下结晶过夜。收集并干燥(1托)结晶出的产物得到20.86g，59.2mmol白色固体状标题化合物8，收率88％。MS(CI，CH4)m/z(％相对强度)353(M++1，100％)。C20H20N2O4(352.30)元素分析，计算值：C，68.17；H，5.72；N，7.95；实测值：C，68.02；H，5.77；N，7.93。
1H NMR(CDCl3)δ8.0(d，J＝8Hz，2H，aroyl)，7.65-7.2(m，8H，芳酰基，芳基)，5.1(s(带有肩峰)，3H，苄基，NH)，4.4(m，1H，CH)，3.3(m，2H，NCH2)，2.2-2.0(m，1H)，1.95-1.6(m，3H，CH2-CH2).
                   实施例5N δ -9-苄氧羰基氨基-6-苯甲酰氨基-5-氧代-4，4-二氟-1-壬烯11(K＝Cbz)的 制备
反应方案B步骤c、d和e：0℃及氮气下，向氮杂内酯8(33.6g，95.2mmol)在四氢呋喃(80mL)和庚烷(70mL)的溶液中加入三乙胺(16mL，115mmol)。向反应混合物中缓慢加入2，2-二氟-4-戊烯酰氯8a(19.2g，124.2mmol)的庚烷(40mL)溶液，同时保持反应温度在0-3℃之间。45分钟后，将反应混合物升温至室温并继续搅拌30分钟。取出少量样品，干燥10分钟(5托，室温)并通过HPLC、1H NMR、19F NMR分析检测氮杂内酯的O-酰基化。过滤除去三乙胺·HCl，浓缩滤液得到淡橙色-黄色油。将油的样品进行HPLC、1H NMR、19F NMR分析以证实O-酰基中间体9的生成。将所述油溶于四氢呋喃(60mL)，用4-二甲氨基吡啶(1.74g，14.2mmol)处理并室温搅拌3小时。取出少量样品，干燥15分钟(5托，室温)并进行RPLC、1H NMR、19F NMR分析，以证实O-酰基中间体9向C-酰基中间体10的转变。向反应混合物中加入无水草酸(25.76g，286.1mmol)的四氢呋喃(60mL)溶液并搅拌24小时。取出少量样品，过滤并干燥(1托，室温)，进行1H NMR和19F NMR分析。将反应混合物浓缩至1/4体积并用l0％盐酸水溶液(200mL)处理，用乙酸乙酯(150mL)萃取并分液。将有机层用饱和碳酸氢钠水溶液(250mL)、盐水(250mL)洗涤，干燥(硫酸镁)并浓缩得到橙色油。将得到的油用4∶1己烷/乙酸乙酯稀释并放置过夜，得到白色固体。收集并干燥(1托，室温)产物，得到21.7g、48.8mmol淡黄色固体状标题化合物11，收率51％。浓缩滤液得到油。将该油粗品预吸附在硅胶上(2g SiO2/lg油)并用含有6英寸高二氧化硅的10cm O.D.柱通过闪式色谱进行纯化，用3∶2己烷/乙酸乙酯洗脱，得到15.4g、34.65mmol淡黄色固体状标题化合物11，收率36％。标题化合物11的总产量为37.1g(87％)。MS(CI，CH4)m/z(％相对强度)445(M++1，100％)。C24H26N2O4F2(444.49)元素分析计算值：C，64.85；H，5.90；N，6.30；实测值：C，64.74；H，5.86；N，6.20；19F NMR(CDCl3)δ-109.3(dt，J＝17，270Hz)，-103.6(dt，J＝17，270Hz)，1H NMR(CDCl3)δ7.8(m，2H，芳酰基)，7.6-7.4(m，3H，芳酰基)，7.3(s，5H，芳基)，7.1(m，1H，NH)，5.9-5.1(m，1H，CH＝C)，5.35-5.15(m，2H，C＝CH2)，5.1(s，2H，苄基)，4.95(m，1H，CH)，3.3(m，2H，NCH2)，2.9(m，2H，CF2CH2)，2.1，1.7(2m，4H，CH2-CH2).
                   实施例6N-9-苄氧羰基氨基-6-苯甲酰氨基-5-羟基-4，4-二氟-1-壬烯12(K＝Cbz)的制 备
反应方案B步骤f：0℃下，向二氟代酮11(38.0g，85.5mmol)的乙醇(500mL)和四氢呋喃(20mL)溶液中加入NaBH4(1.66g，43.88mm0l)。升温至室温1小时后析出沉淀。将该非均相的反应混合物用四氢呋喃(55mL)稀释，得到基本均相的溶液并将其搅拌0.5小时。将反应混合物浓缩至固体，用10％盐酸溶液(800mL)处理并用乙酸乙酯(400mL)萃取。分出有机相，干燥(硫酸镁)，过滤并浓缩，以定量收率得到38.4g、86mmol灰白色固体状标题化合物12(4/1非对映异构体混合物)。MS(CI，CH4)m/z(％相对强度)447(M++1，50％)。C24H28N2O4F2(446.51)元素分析计算值：C，64.56；H，6.32；N，6.27；实测值：C，64.75；H，6.25；N，6.17。19F NMR(CDCl3)δ(主要的非对映体)-106.9(ddt)，-110.5(ddt)，(次要的非对映体)-109.1(m)；1H NMR(CDCl3)δ7.8(m，2H，芳酰基)，7.6-7.4(m，8H，芳酰基，芳基)，6.9(m，1H，NH)，5.9-5.7(m，1H，CH＝C)，5.3(m，2H，CH2＝C)，5.1(s，2H，苄基)，4.4(m，1H，CHN)，4.0，3.9(2m，1H，CHCF2)，3.2(m，2H，NCH2)，2.9-2.6(m，2H，CHF2CH2)，1.8(m，2H)，1.6(m，2H，CH2).
                实施例79-氨基-6-苯甲酰氨基-5-羟基-4，4-二氟壬烷盐酸盐的制备
反应方案B步骤g(还原和脱保护)：将二氟代醇12(38g，85.1mmol)溶于异丙醇(800mL)和1N HCl(200mL)。将该溶液用10％Pd(OH)2/C(3.81g)处理，并在氢气(45磅/平方英寸)下振摇约28小时。将反应混合物用硅藻土过滤并浓缩(1托，室温)，以定量收率得到29.9g、85.4mmol灰白色固体状标题化合物。MS(CI，CH4)m/z(％相对强度)315(M++1，100％)。C16H24N2O2F2(350.84)元素分析计算值：C，54.78；H，7.18；N，7.98；实测值：C，54.47；H，7.28；N，7.83；19F NMR(CD3OD)δ(主要的非对映体)-105.7(ddt)and-107.9(m)，(次要的非对映体)-107.7(m)and-110.0(m)；1H NMR(CD3OD)δ7.9(m，2H，芳酰基)，7.5(m，3H，芳酰基)，4.4(m，1H，CHN)，3.9(dt，J＝17Hz，5 Hz，1H，CHCF2)，3.0(m，2H，NCH2)，2.2-1.4(2m，8H，4 CH2)，0.95(t，J＝7Hz，3H).
                  实施例89，6-二氨基-5-羟基-4，4-二氟壬烷二盐酸盐1的制备
反应方案B步骤g(脱保护)：将9-氨基-6-苯甲酰氨基-5-羟基-4，4-二氟壬烷盐酸盐(26.85g，76.5mmol)在浓盐酸(250mL)中的溶液加热回流19小时(110℃)。反应混合物冷却至室温的过程中有苯甲酸晶体形成。滤除该晶体。将滤液用乙醚(250mL)萃取并分液。将水层用活性炭处理，加热(80℃)，用硅藻土过滤，浓缩并干燥，以定量收率得到21.5g、75.9mmol褐色固体状标题化合物1。MS(CI，CH4)m/z(％相对强度)211(M++143％)；19F NMR(CD3OD)δ(主要的非对映体)-106.4(dt)and-110.6(m)，(次要的非对映体)-107.6(m)and-112.6(m)，1H NMR(D2O)δ4.0，3.9(2t，J＝4Hz，1H，CHCF2)，3.5(m，1H，CHN)，2.9(m，2H，NCH2)，2.0-1.5(m，6H，3 CH2)，1.3(m，2H，CH2)，0.8(t，J＝7Hz，3H).
                     实施例9N-9-[1-[3-[二[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]亚甲基]氨基]-6-氨基-5-羟基-4，4-二氟壬烷2(K1＝Boc)的制备
反应方案A步骤a：0℃下，将三乙胺(33mL，2当量)加入到二胺二盐酸盐1(34.4g，0.122mmol)的二甲基甲酰胺(250mL)溶液中。5分钟后，于0℃下向反应混合物中同时加入二-Boc脒基吡唑(36.93g，0.119mm0l)的二甲基甲酰胺(90mL)溶液和三乙胺(17mL，1当量)。将反应混合物升温至室温并搅拌过夜。向反应混合物中加入柠檬酸水溶液(200mL)，将混合物用二氯甲烷萃取(2×400mL)。将合并的有机层用盐水(500mL)和水(200mL)洗涤，干燥(硫酸钠)，过滤并浓缩得到油。经闪式色谱纯化(硅胶；7∶1氯仿∶甲醇)得到45.5g白色泡沫状标题化合物2，收率83％。
19F NMR(CDCl3)δ(主要的非对映体)-105.7(m)and-111.2(m)；1H NMR(CDCl3)δ11.4(m，1H，NHBoc)，8.3(m，1H，NH)，3.6(t，J＝5Hz，0.5H，CHCF2)，3.4(m，2.5H，CHCF2，NCH2)，2.9(m，1H，NCH)，2.0-1.0(m，26H，2Boc，4CH2)，0.9，0.8(2t，J＝7Hz，3H(4∶1比)).
                    实施例10N-[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]-N-甲基-D-苯丙氨酰基-N-[1-[3-[[二[[(1，1-二 甲基乙氧基)羰基]氨基]亚甲基]氨基]丙基]-3，3-二氟-2-羟基己基]-L-脯氨酰胺3(K1＝Boc，K2＝Boc，)的制备
反应方案A步骤b：0℃下，将N，N’-二环己基碳化二亚胺(20.76g，100.6mmol)加入到N-Boc-N-甲基-D-Phe-Pro-OH(37.89g，100.6mmol)和羟基苯并三唑(13.59g，100.6mmol)的二氯甲烷(800mL)溶液中。将反应混合物搅拌4小时。向反应混合物中加入氨基醇2(45.5g，100.6mmol)的二氯甲烷(200mL)溶液和N-甲基吗啉(11.1mL，100.6mmol)并搅拌过夜。滤除二环己基脲沉淀并将滤液浓缩得到黄色油。将该油溶于乙酸乙酯(2×250mL)，用10％柠檬酸水溶液(2×250mL)、盐水(250mL)和水(150mL)洗涤。分出有机层，干燥(硫酸钠)，过滤并浓缩，得到88g淡黄色泡沫状标题产物3的粗品，收率超过100％。该标题产物3的粗品可不经纯化直接用于下一步反应。19F NMR(CDCl3)δ(主要的非对映体)-107.9(m)and-111.0(m)；1H NMR(CD3OD)δ7.3(m，5H，C6H5)，5.1(m，1H，CH-phe)，4.5-4.0(m，2H，CH-pro，CH-OH)，3.9-3.3，3.2(2m，10H，苄基，CH2-pro，CH2-N-gua，CH3N，CH-N)，2.2-1.5(m，12H，6CH2)，1.5-1.2(3br s，27H，3 Boc)，0.9(dt，3H，J＝2，7Hz，CH3).实施例11N-[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]-N-甲基-D-苯丙氨酰基-N-[1-[3-[[二[[(1，1-二 甲基乙氧基)羰基]氨基]亚甲基]氨基]丙基]-3，3-二氟-2-氧代己基]-L-脯氨酰胺4(K1＝Boc，K2＝Boc，)的制备
反应方案A步骤c：-55℃下，将二甲亚砜(42.5mL，0.598mol)的二氯甲烷(700mL)溶液加入草酰氯(26.1mL，0.299mol)的二氯甲烷(350mL)溶液中。将反应混合物搅拌45分钟，然后在30分钟内加入醇3(80.84g，0.100mol)的二氯甲烷(350mL)溶液。将反应混合物继续搅拌15分钟，保持温度在-50℃和-60℃之间，然后于-55℃下在30分钟内加入二苯基乙胺(157mL，0.898mmol)。继续在-55℃搅拌1小时，反应混合物呈均匀的红色。将10％柠檬酸水溶液(250mL)于0℃缓慢加入反应混合物中。将有机层萃取，用盐水(200mL)洗涤，干燥(硫酸镁)，过滤并浓缩得到约80g油状泡沫。将该泡沫溶于最少量的洗脱剂中，并通过闪式色谱纯化(2×40g)(5″×5″Si2O柱；3∶3∶2庚烷/二氯甲烷/乙酸乙酯)，得到42.9g标题化合物4，收率53％。19F NMR(CDCl3)δ(主要的非对映体)-104.5(m)and-109.7(m)；1H NMR(CDCl3)δ11.50(d，J＝5Hz，1H，NH-Boc)，9.40(d，J＝6Hz，1H，NH)，7.6，7.2(2d，J＝5Hz，NH-CHCO(2 异构体))，5.0，4.5(2m，3H，CH(3))，3.6-2.7(m，9H，2 CH2N，苄基，CH3N)，2.3-1.7(m，8H，4 CH2)，1.7-1.1(m，31H，3Boc，2 CH2)，0.95(t，J＝7Hz，CH3).
                     实施例12N-甲基-D-苯丙氨酰基-N-[1-[3-[(氨基亚氨基甲基)氨基]丙基]-3，3-二氟-2- 氢代己基]-L-脯氨酰胺二盐酸盐一水合物5(MDL 75579DA)的制备
反应方案A步骤d：将酮4(21.6g，0.267mmol)溶于2N HCl/乙酸乙酯(470mL)，塞好烧瓶并在室温下搅拌60小时。反应混合物为淡黄色并且当打开烧瓶时有压力。向反应混合物中通入无水氯化氢10分钟，塞好烧瓶并将混合物搅拌1小时。将反应混合物浓缩得到黄色泡沫，将其用水(100mL)和二氯甲烷(75mL)稀释并剧烈搅拌20分钟。除去二氯甲烷层并再次用二氯甲烷(75mL)洗涤。将水相用硅藻土过滤并冷冻干燥，得到15.2g白色固体状标题化合物5(MDL 75579DA)，收率98％。通过使用δ填充柱(Delta Pack Column(2.1mm×150mm)的LC/MS，80℃。19F NMR(D2O)δ(主要的非对映体)-112.4(m)，(次要的非对映体)-106.2(m)；1H NMR(D2O)δ7.4，7.3(2m，5H，C6H5)，4.9(m，0.2H，CHCOCF2)，4.1(dd，J＝13Hz，3Hz，0.8H，CHC(OH)2-CF2)，4.55(dd，J＝9Hz，5Hz，1H，CH-phe)，4.35(m，1H，CH-pro)，3.5，2.6(2m，2H，CH2-N-pro)，3.25(m，2H，CH2-N)，2.70(s，3H，CH3N)，2.2-1.4(m，12H，6CH2)，0.95(2t，3H，J＝7Hz，CH3).
                   实施例13
用电子喷雾解离通过LC/MS测定MDL 75579DA样品的纯度
使用电子喷雾解离(ESI)通过液相色谱/质谱(LC/MS)对按照本发明方法制备的MDL 75579DA进行分析。A. HPLC
将MDL 75579DA样品以大约1mg/mL的浓度溶于初始流动相。为了减少因与水接触而形成的水合物的量，在即将进行分析之前制备样品。将该溶液的50μL等分试样用WISP 715自动进样器(WatersChromatography)注射到加热至表观温度为80℃的Waters Delta Pak窄孔经C18(2.1mm×15cm)柱中进行分析。
制备流动相，流动相A为乙腈/水(5/95)，其中含有约0.05％的三氟乙酸(TFA)，流动相B由乙腈/水(95/5)组成，其中含有约0.05％的TFA。用Waters 625 HPLC系统以0.2mL/分钟的流速建立梯度洗脱。以12-57％B的线性梯度洗脱45分钟。用装有低死体积微流量池的Waters 486可调波长检测器(0.5 AUFS)在214nm联机监测UV吸收。B. 电子喷雾质谱
将来自HPLC柱的整个流出液(0.2mL/分钟)引入到Finnigan MATTSQ 700三倍四极质谱仪的ESI探针中。将保持在5.5kV的ESI注射针头牢牢固定在距离质谱仪的不锈钢毛细管小孔2cm处。该装置(其内径为0.5mm)将大气压下的ESI喷雾和高真空条件下的质谱仪分离开。为了促进去溶剂化过程，在分析过程中将毛细管保持在200℃。通过通入与ESI针头同轴的氮气保护气(70磅/平方英寸)进一步完成去溶剂化。同时，使用流量为10mL/分钟的辅助气体(N2)。用Q3作为扫描四极，在2秒钟内覆盖200-1500的m/z范围，由此得到质谱。转换倍增电极和电子倍增器的电压分别为-15kV和1.4kV。用环形注射器以0.2mL/分钟的流速用合成肽的混合物完成调谐和校准。c. 纯度的评估
将MDL 75579DA的两种主要非对映异构体的峰面积相加并除以在整个分析过程中积分的总面积，其中不包括不保留的物质(无效峰)。以该比例(以百分比计)表示纯度。所有的纯度测定均用在UV吸收曲线中观察到的峰面积进行。用CALS数据系统(Beckman Intruments，Inc.)提供的Peak Pro积分软件对峰进行积分。
表2列出了用本发明的直接脒化方法制备的三个样品的纯度测定结果。
                表2
 用本发明的方法制备的三批MDL 75579DA的纯度
    MDL 75579DA批次     ％纯度(UV 214nm)
    C415F-193C415F-196C415F-198     96.998.397.9
通过使用包括将9，6-二氨基-5-羟基-4，4-二氟壬烷二盐酸盐一步脒化的本发明的方法，使现有技术中已知的Dakin-West路线(美国专利5391705)减少了两步化学步骤和一步色谱步骤。更令人惊奇的是，从N-9-[1-[3-[二[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]亚甲基]氨基]-6-氨基-5-羟基-4，4-二氟壬烷中间体开始的总收率从使用现有技术中已知的Dakin-West方法的约15％增加到使用本发明方法的约43％，并同时得到了纯度约为98％的高纯度的终产物。

Claims (20)

1.制备N-甲基-D-苯丙氨酰基-N-[1-[3-[(氨基亚氨基甲基)氨基]丙基]-3，3-二氟-2-氧代己基]-L-脯氨酰胺或其可药用盐的方法，该方法包括如下步骤：
(a)将9，6-二氨基-5-羟基-4，4-二氟壬烷或其可药用盐与适宜的脒化试剂反应，得到N-9-[1-[3-[二(K1-保护的)氨基]亚甲基]氨基]-6-氨基-5-羟基-4，4-二氟壬烷，其中K1是适于保护脒基上氮的N-保护基；
(b)将N-9-[1-[3-[二(K1-保护的)氨基]亚甲基]氨基]-6-氨基-5-羟基-4，4-二氟壬烷与N-K2-保护的-N-甲基-D-苯丙氨酰基-L-脯氨酰胺偶联，得到N-K2-保护的-N-甲基-D-苯丙氨酰基-N-[1-[3-[[二[(K1-保护的)氨基]亚甲基]氨基]丙基]-3，3-二氟-2-羟基己基]-L-脯氨酰胺，其中K2是N-保护基；
(c)将N-K2-保护的-N-甲基-D-苯丙氨酰基-N-[1-[3-[[二[(K1-保护的)氨基]亚甲基]氨基]丙基]-3，3-二氟-2-羟基己基]-L-脯氨酰胺与适宜的氧化剂反应，得到N-K2-保护的-N-甲基-D-苯丙氨酰基-N-[1-[3-[[二[(K1-保护的)氨基]亚甲基]氨基]丙基]-3，3-二氟-2-氧代己基]-L-脯氨酰胺；和
(d)用适宜的脱保护试剂将N-K2-保护的-N-甲基-D-苯丙氨酰基-N-[1-[3-[[二[(K1-保护的)氨基]亚甲基]氨基]丙基]-3，3-二氟-2-氧代己基]-L-脯氨酰胺脱保护，得到N-甲基-D-苯丙氨酰基-N-[1-[3-[(氨基亚氨基甲基)氨基]丙基]-3，3-二氟-2-氧代己基]-L-脯氨酰胺或其可药用盐。
2.权利要求1的方法，其中，对于每1.0摩尔当量的9，6-二氨基-5-羟基-4，4-二氟壬烷或其可药用盐，脒化试剂的加入比例为约0.9-约1.2摩尔当量。
3.权利要求1的方法，其中，对于每1.0摩尔当量的9，6-二氨基-5-羟基-4，4-二氟壬烷或其可药用盐，脒化试剂的加入比例为约0.95-约1.05摩尔当量。
4.权利要求1的方法，其中的K1是叔丁氧羰基。
5.权利要求4的方法，其中的K2是叔丁氧羰基。
6.  权利要求1的方法，其中9，6-二氨基-5-羟基-4，4-二氟壬烷或其可药用盐与适宜脒化试剂的反应在约-30℃至约20℃的温度下进行。
7.权利要求1的方法，其中9，6-二氨基-5-羟基-4，4-二氟壬烷或其可药用盐与适宜脒化试剂的反应在约-15℃至约5℃的温度下进行。
8.权利要求2的方法，其中适宜的脒化试剂是二-Boc-脒基吡唑或二-Boc-S-甲基异硫脲。
9.权利要求3的方法，其中适宜的脒化试剂是二-Boc-脒基吡唑或二-Boc-S-甲基异硫脲。
10.权利要求8的方法，其中9，6-二氨基-5-羟基-4，4-二氟壬烷或其可药用盐与适宜脒化试剂的反应在约-15℃至约5℃的温度下进行。
11.权利要求10的方法，其中适宜的氧化剂是Swern条件下的二甲亚砜复合物。
12.制备N-9-[1-[3-[二(K1-保护的)氨基]亚甲基]氨基]-6-氨基-5-羟基-4，4-二氟壬烷的方法，包括将9，6-二氨基-5-羟基-4，4-二氟壬烷或其可药用盐与适宜的脒化试剂反应，得到N-9-[1-[3-[二(K1-保护的)氨基]亚甲基]氨基]-6-氨基-5-羟基-4，4-二氟壬烷，其中K1是适于保护脒基上氮的N-保护基。
13.权利要求12的方法，其中，对于每1.0摩尔当量的9，6-二氨基-5-羟基-4，4-二氟壬烷或其可药用盐，脒化试剂的加入比例为约0.9-约1.2摩尔当量。
14.权利要求12的方法，其中，对于每1.0摩尔当量的9，6-二氨基-5-羟基-4，4-二氟壬烷或其可药用盐，脒化试剂的加入比例为约0.95-约1.05摩尔当量。
15.权利要求12的方法，其中9，6-二氨基-5-羟基-4，4-二氟壬烷或其可药用盐与适宜脒化试剂的反应在约-30℃至约20℃的温度下进行。
16.权利要求12的方法，其中9，6-二氨基-5-羟基-4，4-二氟壬烷或其可药用盐与适宜脒化试剂的反应在约-15℃至约5℃的温度下进行。
17.权利要求13的方法，其中适宜的脒化试剂是二-Boc-脒基吡唑或二-Boc-S-甲基异硫脲。
18.权利要求14的方法，其中适宜的脒化试剂是二-Boc-脒基吡唑或二-Boc-S-甲基异硫脲。
19.权利要求17的方法，其中9，6-二氨基-5-羟基-4，4-二氟壬烷二盐酸盐与适宜脒化试剂的反应在约-15℃至约5℃的温度下进行。
20.权利要求12的方法，其中的K1是叔丁氧羰基。
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