CN112138158B - 红细胞在制备光热转换材料中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种红细胞在制备光热转换材料中的应用。本发明还公开了红细胞在制备肿瘤光热治疗制剂中的应用。红细胞在近红外激光照射下具有良好的升温效果，在体内注射后原位形成的红细胞凝胶的光热效应能有效的烧伤肿瘤释放肿瘤相关抗原。

Description

红细胞在制备光热转换材料中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种红细胞在制备光热转换材料中的应用。

背景技术

肿瘤免疫治疗作为治疗恶性肿瘤的新一代疗法，主要是通过激发或调动机体的免疫系统，增强肿瘤微环境抗肿瘤免疫力，从而控制和杀伤肿瘤细胞。然而，该治疗方式存在的低应答率和炎症失控相关等副作用限制了其广泛应用。

目前，较多的研究者将光热治疗与其他治疗技术结合以提高治疗效果。例如光热治疗联合免疫治疗不仅可以提高治疗效果，还可以防止肿瘤的转移和复发，光热治疗和光声成像的联合提供了肿瘤诊断的另一种成像方式，而且还能在肿瘤微环境中检测出与生物学相关的信号，比如酸性pH，酶和活性氧。光热治疗的材料有以下三种：1)传统的有机化合物，如吲哚菁绿。2)碳纳米材料，如碳纳米管。3)贵金属纳米材料如纳米金棒等。但这些材料存在着转换效率低、成本较高、光热稳定性较差，有一定毒性等缺点，因此以光热纳米材料为基础的光热疗法在肿瘤治疗领域将具有远大的前景，值得人们继续研究探索。

最近，生物材料已经被设计用于癌症免疫治疗，以应对这些挑战。红细胞膜能够更好地保护被运载物质的活性，具有更长和更可控的生命期。这些性能使“载体红细胞”成为极具价值的一种运输载体。如CN202010085502.4公开了一种红细胞凝胶递释系统及其制备方法与应用。其制备的红细胞凝胶疫苗中所载的免疫调节剂和肿瘤相关抗原，经埋植后，刺激招募免疫细胞分化成为具有肿瘤抗原特异性的免疫细胞，诱导产生高效的抗肿瘤免疫反应。该疫苗是否具有光热治疗效应仍未可知。CN201811211049.6公开了一种功能性红细胞膜的制备方法及应用，CN201811055247.8公开了一种集靶向、光热于一体的红细胞仿生型纳米粒的制备方法，上述两种功能性红细胞虽具有光热治疗效果，但二者均是依靠材料中的纳米金颗粒或吲哚菁绿作为光热转换材料，并未揭示红细胞是否具有光热转换效应。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供红细胞在制备光热转换材料中的应用，本发明公开了红细胞的新用途，在近红外光照下产生明显的升温效果，利用其光热转换效应制备光热转换材料或肿瘤光热治疗制剂。

本发明的第一个目的是公开红细胞在制备光热转换材料中的应用。

进一步地，光热转换材料为近红外光照射升温材料。

进一步地，近红外光的波长为700-1400nm，功率为0.1-2W/cm²。

红细胞的深褐色使其在近红外光的照射下产生明显的升温效果，导致红细胞逐渐脱水氧化。

本发明的第二个目的是要求保护红细胞在制备肿瘤光热治疗制剂中的应用。

进一步地，制剂为疫苗。

进一步地，肿瘤光热治疗制剂中还包括免疫佐剂。利用红细胞负载免疫佐剂，方法简单快捷，载药量高。当肿瘤光热治疗制剂中同时包含红细胞和免疫佐剂时，该治疗制剂具有光热免疫协同作用。红细胞可向肿瘤引流淋巴结释放免疫佐剂，显著激活淋巴结的抗原呈递细胞。红细胞负载免疫佐剂并注射入生物体的皮下后，可形成负载免疫佐剂的红细胞凝胶，有效地增强抗肿瘤效果，产生持久的免疫记忆效应，防止肿瘤复发和转移。

进一步地，红细胞的数量为1×10⁶-1×10⁹个/kg(以血球计数板计数)且免疫佐剂为0.1-2mg/kg。

进一步地，免疫佐剂包括疏水性和/或亲水性免疫调节药物。红细胞中细胞膜的两亲性使疏水性和亲水性药物均能在细胞膜上进行装载。

进一步地，肿瘤光热治疗制剂用于接受近红外光照射。

进一步地，近红外光的波长为700-1400nm，功率为0.1-2W/cm²。

进一步地，肿瘤光热治疗制剂用于抑制肿瘤的生长、转移或复发。

进一步地，肿瘤光热治疗制剂用于治疗多种肿瘤，包括但不局限于膀胱癌、骨癌、脑癌、结肠癌、前列腺癌、皮肤癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌。

进一步地，肿瘤光热治疗制剂为皮下注射剂，可直接注入病灶部位。

红细胞的深褐色使其在近红外光的照射下产生明显的升温效果，导致红细胞逐渐脱水氧化。肿瘤在光热灼烧后，大量抗原提呈细胞被富集到照射部位。破裂的红细胞被吞噬后，抗原提呈细胞迁移至淋巴结，产生较强的免疫应答。

肿瘤光热治疗制剂皮下注射后，在生理条件下可以快速产生大量的血小板、凝血酶等促凝物质，导致流动的血液变成凝胶状态，血液离心去除其他物质后得到的纯净红细胞在生理学条件下可以自发形成红细胞凝胶，这是由于在皮下注射后红细胞招募了大量的凝血酶和血小板等促凝物质。该凝胶可作为光敏剂在近红外光照下产生明显的升温效果。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

将红细胞用于制备光热转换材料或肿瘤光热治疗制剂，可在近红外光照射下，利用红细胞的光热转换效应有效的烧伤肿瘤释放肿瘤相关抗原，达到抑制肿瘤的生长、转移或复发的效果。并促进红细胞向肿瘤引流淋巴结释放免疫佐剂，显著激活淋巴结的抗原呈递细胞。

本发明利用红细胞的光热转换效应，将红细胞用于制备光热转换材料或肿瘤光热治疗制剂，其中红细胞不仅获取来源广、制备简单，有更好的生物安全性和生物相容性，大大提高了光热转换材料或肿瘤光热治疗制剂的生物安全性和生物可降解性。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。

附图说明

图1为本发明红细胞凝胶的形成过程中各阶段的照片；

图2为本发明中流变仪验证红细胞凝胶的胶体性质；

图3为本发明中红细胞凝胶的SEM图；

图4为红细胞凝胶和游离红细胞的免疫荧光染色图；

图5为本发明中红细胞凝胶在体内于第0、3、7、14天时的外观形貌变化；

图6为本发明中红细胞凝胶植入第0、3、7、14天后的HE切片染色结果；

图7为本发明中装载免疫佐剂的红细胞凝胶中免疫佐剂在体外的释放效率测试结果；

图8为不同试验组的小鼠体内热成像图和升温曲线；

图9为不同试验组的小鼠激光照射前后淋巴结的富集情况；

图10为不同试验组的小鼠淋巴结巨噬细胞、树突状细胞的免疫荧光图；

图11为不同试验组的小鼠淋巴结内巨噬细胞、树突状细胞的定量分析；

图12为不同试验组对CT26结肠癌进行干预后的治疗效果分析；

图13为不同试验组对CT26结肠癌进行干预后复发模型的治疗效果分析；

图14为不同试验组对CT26结肠癌再次干预后对小鼠脾脏内记忆细胞的数量分析；

图15为不同试验组对CT26结肠癌进行干预治疗后对小鼠CT26结肠癌远端模型的效果分析。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

本发明以下实施例中的材料来源为：

免疫佐剂R837购自MedChemExpress公司。DMSO购自上海麦克林生化科技有限公司。DiD(细胞膜红色荧光探针)购自于美仑生物技术有限公司。罗丹明购自上海优宁维生物科技股份有限公司。EDTA购自源叶生物科技有限公司。CT26结直肠癌细胞株和4T1小鼠乳腺癌细胞株受赠于苏州大学刘庄教授。CT26和4T1于添加有10％胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml的链霉素的Roswell Park Memorial Institute培养基中培养。

6-8周龄的BALB/c小鼠购自常州卡文斯实验动物有限公司。小鼠按照中国科学院生化与细胞所实验动物管理委员会(IACUC)的指导操作方法进行处理。

实施例1：红细胞凝胶的合成和表征

(1)从小鼠眼眶迅速取出200μL血液加入含有抗凝剂的EP管中；

(2)将步骤(1)得到的新鲜血液加入PBS 0.3G5min离心三次洗去血液中其他成分；

(3)将步骤(2)中得到的红细胞在小鼠背部皮下注射，短时间内即可得到红细胞凝胶。

如图1所示，注射后，小鼠背部皮肤鼓包，解剖皮下组织后可发现，该鼓包均为凝胶状结构，证明红细胞经皮下注射后可形成红细胞凝胶。

使用流变仪证明步骤(3)所得红细胞凝胶的流变学特性，取小鼠皮下组织所形成的红细胞凝胶，测试其流变特性，结果如图2所示，证明本发明的方法所形成的红细胞凝胶具有良好机械性能。

使用扫描电子显微镜(Scanning Electron Microscope，SEM)对红细胞凝胶进行微观成像(图3)，可看出，红细胞凝胶具有规整地内部结构，证明红细胞凝胶的形成。

用DiD分别对红细胞凝胶和游离红细胞进行免疫荧光染色，图4可见红细胞凝胶中存在大量凝血酶和血小板(图4b1-4b4)，证实凝胶的形成过程中产生凝血酶和血小板，而游离红细胞中则仅检测出DiD发出的荧光，其中并不存在凝血酶和血小板(图4a1-4a4)。

为进一步研究红细胞凝胶体内降解过程，于注射形成红细胞凝胶后的第0、3、7、14天，将其取出拍照。图5显示，随着时间的延长，小鼠皮下的红细胞凝胶逐渐减少，同时图6中的HE切片染色表明，在形成红细胞凝胶后的不同时间，小鼠皮下组织未发生明显形态变化，说明红细胞凝胶的形成及降解过程对小鼠皮下组织无影响。

为了测试红细胞凝胶的装载效率，分别将步骤(2)得到的纯净的红细胞与不同浓度的免疫佐剂R837混匀，然后将得到的混合物皮下注射后，短时间内在小鼠皮下形成红细胞凝胶。取红细胞凝胶并将红细胞凝胶研磨制成单细胞悬液，加入高效液相色谱测试时的流动相乙腈破坏红细胞，使免疫佐剂溶于乙腈，离心去除红细胞，测试乙腈溶液中的免疫佐剂R837的浓度，建立免疫佐剂浓度的标曲然后计算红细胞凝胶中免疫佐剂R837的装载效率，计算公式如下：

(实际纳米佐剂的装载量/加入红细胞中的纳米佐剂含量)×100％

以免疫佐剂R837的浓度为横坐标，实际测得的装载效率为纵坐标作图，如图7所示，由图7可见，红细胞凝胶对R837的装载效率可高达80％左右。

实施例2：红细胞凝胶的光热能力和淋巴结靶向

Balb/c小鼠经2.5％异氟烷麻醉后，将实施例1中步骤(2)得到的纯净的红细胞注入小鼠皮下，形成红细胞凝胶。然后用功率密度为1W/cm²的808nm激光对小鼠形成红细胞凝胶的部位进行激光照射。为了作为对照，按照以上同样的方法，向小鼠皮下注射纯PBS溶液，然后用功率密度为1W/cm²的808nm激光对小鼠注射PBS溶液的部位进行激光照射。结果表明，小鼠注射红细胞后产生明显的升温效果(图8b1-8b4、8c)，而注射PBS并无明显升温情况(图8a1-8a4、8c)。

将红细胞与荧光染料DiD混合后皮下注射到小鼠腹部皮下。5分钟后，用功率密度为1W/cm²的808nm激光照射小鼠5分钟，将其命名为DiD@RBC-gel(L⁺)组。对照组为注射了红细胞与荧光染料混合物且未受激光照射的小鼠(命名为DiD@RBCs-gel组)以及仅注射红细胞且未受激光照射的小鼠(命名为RBCs组)。48小时后进行体内生物发光成像，然后取小鼠腹股沟淋巴结进行荧光成像和定量，如图9所示，DiD@RBC-gel(L⁺)组的荧光强度是RBCs组的3倍，此外图9c的流式细胞术分析显示淋巴结中有更多的DiD阳性细胞，这与体外成像一致。

为观察淋巴结内免疫佐剂的富集，用荧光染料DiD模拟免疫佐剂，并设置多组实验，其中，对照组为未进行任何处理的小鼠(命名为

)。仅注射红细胞的小鼠(命名为RBCs组)，其是将实施例1步骤(2)得到的纯净的红细胞皮下注射后。荧光染料与红细胞混合后注射的小鼠(命名为DiD@RBC-gel)是将实施例1步骤(2)得到的纯净的红细胞与荧光染料混合后进行皮下注射。荧光染料与红细胞混合后注射且接受激光照射的小鼠(命名为DiD@RBC-gel(L⁺))是将实施例1步骤(2)得到的纯净的红细胞与荧光染料混合后进行皮下注射，然后用功率密度为1W/cm²的808nm激光对小鼠注射PBS溶液的部位进行激光照射。共聚焦显微镜分析结果如图10所示，激光照射促进了附近淋巴结的DiD积累，表明光热的触发促进了荧光染料在淋巴结的积累，同时红细胞凝胶招募了树突状细胞和巨噬细胞。为了观察淋巴结内免疫佐剂及红细胞凝胶对免疫细胞的招募情况，进一步运用流式细胞术进一步分析红细胞凝胶招募的免疫细胞变化及其表型。对照组为仅注射红细胞的小鼠(命名为RBCs组)，其是将实施例1步骤(2)得到的纯净的红细胞皮下注射后。免疫佐剂R837与红细胞混合后注射的小鼠(命名为R837@RBC-gel)是将实施例1步骤(2)得到的纯净的红细胞与免疫佐剂混合后进行皮下注射。免疫佐剂与红细胞混合后注射且接受激光照射的小鼠(命名为R837@RBC-gel(L⁺))是将实施例1步骤(2)得到的纯净的红细胞与免疫佐剂混合后进行皮下注射，然后用功率密度为1W/cm²的808nm激光对小鼠注射PBS溶液的部位进行激光照射。结果显示，红细胞凝胶植入体内后经激光照射后在淋巴结富集更多的树突状细胞和巨噬细胞，表明激光治疗促进了R837释放到附近的淋巴结和诱导大量APCs激活。(图11)。

实施例3：红细胞凝胶的光热免疫治疗的效果分析

(1)将0.7mg/kg R837、50μLRBCs在混匀仪上混合30min，得到混合物。

(2)将Balb/c小鼠称重，随机分为7组，分别为PBS组、游离免疫佐剂R837组(R837)、游离免疫佐剂R837加光热组(R837(L⁺))、红细胞凝胶组(RBCs)、红细胞凝胶加光热组(RBCs(L⁺))、红细胞凝胶与免疫佐剂R837组(R837@RBCs)、红细胞凝胶与免疫佐剂R837加激光照射组(R837@RBCs(L⁺))。1×10⁶CT26结肠癌细胞于第0天皮下注射于小鼠右侧。于第7天，红细胞凝胶与免疫佐剂R837组和红细胞凝胶与免疫佐剂R837加激光照射组是将本实施例步骤(1)中制备的混合物瘤内注射且红细胞凝胶与免疫佐剂R837加激光照射组的注射部位另外照射1W/cm²的808nm激光，红细胞凝胶与免疫佐剂R837加激光照射组的注射部位另外照射1W/cm²的808nm激光。PBS组则注射相同体积约50μl的中性PBS，游离免疫佐剂组和游离免疫佐剂R837加光热组则将相同剂量的R837用PBS稀释至50μl后瘤内注射，其中游离免疫佐剂R837加光热组的注射部位另外照射1W/cm²的808nm激光。红细胞凝胶组和红细胞凝胶加光热组是将相同体积的纯红细胞注射入小鼠体内，且红细胞凝胶加光热组的注射部位另外照射1W/cm²的808nm激光。每两天测量每组小鼠的肿瘤大小和小鼠体重。肿瘤体积计算公式为:短径²×长径×0.5。当肿瘤体积超过1.5cm³或肿瘤出现破裂或出血时对动物实施安乐死。图12a-g依次为PBS组、游离免疫佐剂R837组、游离免疫佐剂R837加光热组、红细胞凝胶组、红细胞凝胶加光热组、红细胞凝胶和免疫佐剂R837组和红细胞凝胶和免疫佐剂R837加光热组的实验结果。由图12h可知，结果显示红细胞凝胶与免疫佐剂结合在光热治疗下具有显著的治疗效果，有效抑制肿瘤生长，延长了小鼠的存活时间。

实施例4：红细胞凝胶的光热免疫治疗在肿瘤术后复发模型上的治疗效果分析

通过将CT26肿瘤细胞(1×10⁶/只)注射到Balb/c小鼠的背部一侧建立小鼠CT26肿瘤模型。在肿瘤注射7天后，按实施例3步骤(2)中的方法对小鼠进行治疗，分别设置PBS组(UnTx)、红细胞凝胶加光热组(RBC-gel(L⁺))、红细胞凝胶与免疫佐剂R837加激光照射组(R837@RBC-gel(L⁺))。在治疗44天后接种第二个肿瘤，并对小鼠肿瘤大小进行监测。由图13可看出，本发明的红细胞凝胶联合光热免疫治疗对CT26结肠癌的复发具有抑制作用。通过流式细胞术分析脾脏内记忆细胞的变化情况，发现红细胞凝胶联合光热免疫治疗能够提高免疫记忆细胞的含量(图14)，图14a-d依次对应健康小鼠

UnTx、RBC-gel(L⁺)、R837@RBC-gel(L⁺)组的结果。

实施例5：红细胞凝胶的光热免疫治疗对远端肿瘤的治疗效果分析

将CT26肿瘤细胞(1×10⁶/只)注射到Balb/c小鼠的背部左侧建立小鼠CT26肿瘤模型。将Balb/c小鼠称重，随机分为7组，分别为PBS组、游离免疫佐剂R837组、游离免疫佐剂R837加光热组、红细胞凝胶组、红细胞凝胶加光热组、红细胞凝胶与免疫佐剂R837组、红细胞凝胶与免疫佐剂R837加激光照射组。7天后对小鼠左侧肿瘤进行治疗。第八天将1×10⁶个CT26细胞注射到小鼠的背部另一侧。每隔两天进行肿瘤大小测量，肿瘤体积计算公式为:短径²×长径×0.5。当肿瘤体积超过1.5cm³或肿瘤出现破裂或出血时对动物实施安乐死。图15a为每组肿瘤大小图片，图15b为肿瘤重量，图15c为小鼠的体重变化情况，图15d为小鼠远端肿瘤体积大小，该结果显示红细胞凝胶与免疫佐剂R837加激光照射组有效抑制远端肿瘤的生长。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.红细胞在制备光热转换材料中的应用，其特征在于：所述红细胞为血液离心去除其他物质后得到的纯净红细胞，经皮下注射后形成红细胞凝胶作为光热转换材料。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述光热转换材料为近红外光照射升温材料。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述近红外光的波长为700-1400 nm，功率为0.1-2W/cm²。

4.红细胞在制备肿瘤光热治疗制剂中的应用，其特征在于：所述制剂为包括红细胞和免疫佐剂的疫苗，经皮下注射后形成红细胞凝胶；所述红细胞为血液离心去除其他物质后得到的纯净红细胞。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述红细胞的数量为1×10⁶-1×10⁹个/kg且免疫佐剂为0.1-2 mg/kg。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述免疫佐剂包括疏水性和/或亲水性免疫调节药物。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述肿瘤光热治疗制剂用于接受近红外光照射。

8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述肿瘤光热治疗制剂用于抑制肿瘤的生长、转移或复发。

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