CN107158405B - 一种线粒体靶向的纳米光敏免疫复合药物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种线粒体靶向的纳米光敏免疫复合药物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种线粒体靶向的纳米光敏免疫复合药物及其制备方法和应用，属于纳米医药领域。本发明药物包括水溶性碳基纳米载体，以及分别与纳米载体连接的线粒体靶向共聚物、免疫佐剂共聚物和光敏剂，由此构建了一种联合光学治疗和免疫治疗的线粒体靶向型复合药物，运用该药物于肿瘤原位治疗，能够高效靶向原位肿瘤的亚细胞器——线粒体，进而产生单态氧以及光热效应，单态氧诱导机体产生非特异性抗肿瘤免疫响应，并在免疫佐剂作用下进一步增强机体免疫抵抗肿瘤，产生肿瘤特异性免疫力，达到特异性地抑制恶性肿瘤的发展和转移的目的。本发明在治疗原位肿瘤甚至转移肿瘤领域具有广阔的前景，未来将会成为肿瘤联合增敏治疗的重要策略之一。

Description

一种线粒体靶向的纳米光敏免疫复合药物及其制备方法和 应用
技术领域
本发明属于纳米医药领域，具体涉及一种线粒体靶向的纳米光敏免疫复合药物及其制备方法和应用。
背景技术
肿瘤作为一类严重危害人类健康的疾病，是全球疾病致死的重要原因之一。恶性肿瘤发展较快，容易造成侵袭或转移。目前手术、放疗与化疗仍然是治疗肿瘤的三种常规手段，但这些治疗手段存在诸多不足，损伤正常组织，系统毒副反应大，二次复发率高等。因此，亟需开发一种新型非传统治疗方法来提高癌症的治疗效果，减少系统毒副作用，降低二次复发率。
肿瘤光学治疗是一种精确靶向治疗肿瘤的方法，是近年来兴起的肿瘤非侵入性治疗新方法。光学治疗的基本原理是系统或局部给予的光敏剂在各组织中的半衰期不同，肿瘤组织中光敏剂浓度明显高于正常组织，形成光敏剂在肿瘤组织的选择性滞留，因此具有选择性高，疗效显著，对正常组织伤害小及无全身毒副作用等优点。肿瘤光学治疗包括光热治疗(Photothermal therapy,PTT)和光动力治疗(Photodynamic therapy,PDT)，PTT主要通过具有近红外光吸收能力的物质在激光照射下产生热量而杀死肿瘤细胞；PDT则利用激光与聚集在肿瘤组织中的光敏剂发生光化学反应产生活性氧物质达到治疗作用。PDT对肿瘤细胞的杀伤效率受多种因素的影响：光敏剂的种类，激光的波长，细胞类型等。在以上同等条件下，光敏剂的亚细胞定位则成为了影响PDT效率的关键因素，因为它决定光动力损伤的最初位点。很多研究证实线粒体是光动力治疗的重要靶点，且定位在线粒体的光敏剂比定位在其它细胞器的光敏剂能更有效地杀死肿瘤细胞。光照后起始反应是在线粒体上形成单态氧，接着线粒体上的活性氧直接诱导线粒体通透性改变进而导致线粒体去极化，变形，细胞色素c的释放，从而导致肿瘤细胞凋亡或者间接损伤肿瘤组织血管内皮细胞，破坏肿瘤组织中的微血管，造成局部缺血缺氧导致细胞死亡。光疗作为一种局部治疗手段，对原位肿瘤具有很好的疗效，但对于转移性肿瘤疗效甚微，而肿瘤转移是造成治疗失败和患者死亡的最主要的原因。因此，理想的肿瘤治疗方法应该不仅能清除原发的肿瘤病灶同时还对转移病灶具有良好治疗作用。
有研究发现：在引起肿瘤组织不可逆损伤的同时，PTT和PDT还能够进一步刺激机体够释放各种炎症和急性响应调节因子，有效地刺激固有和获得性免疫系统，导致治疗部位大量聚集中性细胞、树突状细胞和其它炎症细胞，改变肿瘤微环境，在增强肿瘤疗效、对抗局部复发和转移的肿瘤细胞方面显示巨大的潜能。肿瘤光疗的独特免疫刺激效应受到研究者的极大重视，然而肿瘤的免疫逃逸机制如诱导产生抑制性细胞，分泌抑制因子等会阻碍机体自身抗肿瘤免疫系统的建立，故大多肿瘤患者的免疫功能处于抑制状态，仅由光疗产生的免疫应答反应作用是有限的。机体的免疫功能与肿瘤的发生、发展有密切关系，而放疗和化疗等恶性肿瘤常规治疗手段又会进一步抑制机体的免疫功能。因此，免疫疗法作为一种新型肿瘤治疗方法，通过针对机体肿瘤的发生机制，采用生物学干预策略调控机体的免疫系统功能，刺激机体免疫系统识别、扑捉、杀灭残余的肿瘤细胞，最终达到治愈目的。因此大量的研究集中在利用PDT或PTT体外诱导制备肿瘤细胞全抗原，并致敏离体分离的树突状细胞，制备肿瘤疫苗。这种方法虽然具有原理可行、操作直接的特点，但是最终临床响应率低(仅有7％)，离体产生的树突状细胞在淋巴结中的迁移率较低(只有3～5％)；更为繁琐的是，制备基于树突状细胞的肿瘤疫苗需要根据每一个病人个体进行制作，耗时较长，过程复杂，费用昂贵，目前仍缺乏生产临床级疫苗的标准方案，因此质量不可控。
因此，如何实现光学治疗和免疫治疗相结合综合治疗肿瘤，并产生肿瘤特异性免疫力，成为本领域技术人员亟待解决的问题。随着纳米生物技术的发展，构建基于纳米载体的具有协同效应的多功能复合药物对于肿瘤治疗具有重要意义。
发明内容
鉴于现有技术的需求，本发明构建了一种联合光学治疗和免疫治疗的线粒体靶向型复合药物及其制备方法和应用，在肿瘤原位治疗中运用本发明纳米复合药物，能够高效靶向原位肿瘤的亚细胞器——线粒体，进而产生单态氧以及引发光热反应，单态氧诱导机体产生非特异性抗肿瘤免疫响应，并在免疫佐剂作用下进一步激发机体免疫抵抗肿瘤，最终达到特异性地抑制恶性肿瘤的发展和转移的目的。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
技术方案1：
一种线粒体靶向的纳米光敏免疫复合药物，包括纳米载体，以及分别与纳米载体连接的线粒体靶向共聚物、免疫佐剂共聚物和光敏剂，所述纳米载体为水溶性碳基纳米粒子，所述线粒体靶向共聚物为由磷脂聚乙二醇衍生物修饰的亲脂性阳离子共聚物，所述免疫佐剂共聚物是由磷脂聚乙二醇衍生物修饰的CpG ODN共聚物，所述光敏剂为近红外光激发下具有光动力及光热效应的有机染料，其中：磷脂的疏水脂肪链与水溶性碳基纳米粒子之间通过疏水作用力结合使得线粒体靶向共聚物和免疫佐剂共聚物负载于水溶性碳基纳米粒子上，光敏剂通过π-π堆积作用自组装于水溶性碳基纳米粒子表面。
本技术方案中水溶性碳基纳米粒子包括：纳米氧化石墨烯、单臂碳纳米管、多臂碳纳米管或者富勒烯；优选为纳米氧化石墨烯，因为纳米氧化石墨烯表面易于修饰，能够将与磷脂聚乙二醇衍生物(以下简写为磷脂-PEG)共价结合的分子组装到氧化石墨烯表面，同时氧化石墨烯具有免疫刺激性。
作为优选实施方式，水溶性碳基纳米粒子的粒径为150nm～500nm。
本技术方案中在近红外光(波长620～1100nm)激发下具有光动力及光热效应的有机染料包括：二氟化硼二吡咯甲川染料及其衍生物类(BODIPY)，罗丹明类，菁类(优选为：ICG、IR820、IR825)或者苝类。
本技术方案中免疫佐剂共聚物优选为由磷脂聚乙二醇衍生物修饰的非甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸共聚物(以下简称为DP-CpG共聚物)，非甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(以下简称为CpG ODN)能够模拟非甲基化CpG二核苷酸片段的免疫刺激活性。当其被树突状细胞(DC)、B细胞、单核细胞、巨噬细胞等靶细胞内化后，会与Toll样受体9(TLR-9)结合，有效增强相应细胞的活性和促进多种细胞因子的分泌，诱导免疫应答，进而在抵抗机体肿瘤方面发挥免疫佐剂的作用。
本技术方案中DP-CpG共聚物中CpG ODN部分硫化，即部分具有硫代磷酸酯键，能够耐受核酸酶——DNase酶。
本技术方案采用的CpG ODN包括：A型CpG ODN、B型CpG ODN、C型CpG ODN和P型CpGODN，优选为含有20～24个碱基对，其中：A型CpG ODN中包括CpG ODN1585，CpG ODN2216和CpG ODN2336，B型CpG ODN中包括CpG ODN1668，CpG ODN1826，CpG ODN2006，CpG ODN2007，CpG ODN7909，CpG ODN BW006和CpG ODN D-SL 01；C型CpG ODN中包括CpG ODN2395，CpGODN M362和CpG ODN D-SL 03；P型CpG ODN中包括CpG ODN21798；
本技术方案中CpG ODN优选为CpG ODN 1826。
本技术方案中线粒体靶向共聚物优选为由磷脂聚乙二醇衍生物修饰的亲脂性阳离子共聚物，上述共聚物中阳离子基团具有较高的脂溶性和正电性能，能利用线粒体外膜与间隙、内膜与基质之间膜电位负电势的差异靶向线粒体；本技术方案中亲脂性阳离子基团优选为苯基膦基团，提供苯基膦基团的物质包括但不限于以下物质：三苯基膦分子(TPP)、四苯基膦分子；另外，本技术方案中提供亲脂性阳离子基团物质还包括但不限于罗丹明类。
本技术方案中磷脂为本领域技术术语，根据本领域技术常识，磷脂是指整个分子具有零电荷且具有疏水性脂肪链的中性磷脂乙醇氨；本技术方案中磷脂包括但不限于以下物质：二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二油烯基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、双肉豆蔻磷脂酰乙醇胺(DMPE)和二月桂酰基磷脂酰乙醇胺(DLPE)；
根据本发明优选实施例，磷脂采用二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)。
进一步地，本技术方案中亲脂性苯基膦阳离子共聚物是由氨基修饰的磷脂聚乙二醇衍生物(磷脂-PEG-NH2)与末端含有羧基的三苯基膦化合物通过酰胺化反应所制得；
进一步地，本技术方案中DP-CpG共聚物是由马来酰亚胺功能化的磷脂聚乙二醇衍生物(磷脂-PEG-MAL)中磷脂为疏水端，而马来酰亚胺(Maleinimide，MAL)为亲水端，与标记有巯基(-SH)的CpG ODN进行迈克尔加成反应生成CpG ODN共聚物。
上述亲脂性阳离子共聚物中疏水端磷脂和DP-CpG共聚物中疏水端磷脂均可通过疏水作用组装到所述纳米载体表面。
本技术方案中聚乙二醇(PEG)的分子量范围为500～5000Da，优选分子量为2000，分子量的单位为道尔顿。
技术方案2：
一种线粒体靶向的纳米光敏免疫复合药物的制备方法，包括如下步骤：
步骤A：分别制备亲脂性阳离子共聚物及免疫佐剂共聚物，具体操作如下：
制备亲脂性阳离子共聚物：
将含有苯基膦基团和羧基基团的亲脂性化合物溶解于氯仿中，搅拌条件下加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、N-羟基丁二酰亚胺和三乙胺，室温下反应2～6小时，再加入氨基功能化的磷脂聚乙二醇衍生物(磷脂-PEG-NH2)，搅拌均匀，室温下反应18～24小时，待反应完成后，将混合溶液经过旋转蒸发处理，旋转蒸发温度28～39℃，待旋转蒸发完成得到样品，然后用蒸馏水溶解样品得到亲脂性阳离子共聚物溶液；
制备免疫佐剂共聚物：
将巯基功能化的CpG ODN和马来酰亚胺功能化的磷脂聚乙二醇衍生物(磷脂-PEG-MAL)分别溶解于Tris-HCl缓冲液制得浓度为8～15mg/mL的CpG ODN溶液和浓度为0.5～1mg/mL的马来酰亚胺功能化的磷脂聚乙二醇衍生物(磷脂-PEG-MAL)溶液，上述所用Tris-HCl缓冲液的pH在为6.8～8.5范围内，然后将巯基功能化的CpG ODN溶液与马来酰亚胺功能化的磷脂聚乙二醇衍生物(磷脂-PEG-MAL)溶液混合均匀，得到的混合溶液中巯基功能化的CpG ODN与磷脂-PEG-MAL的质量比为1∶1～1∶10，将混合溶液在室温下避光反应4～8小时，反应完成后进行离心处理，离心处理完成后通过清洗操作去除多余的反应物，制得免疫佐剂共聚物溶液；
步骤B：将水溶性碳基纳米粒子超声溶解于水中，调节溶液的pH值为6.8～8.5，制得纳米载体溶液，然后将步骤A制得的亲脂性阳离子共聚物和免疫佐剂共聚物分别与所述纳米载体溶液中反应进行吸附，其中：亲脂性阳离子共聚物与水溶性碳基纳米载体的质量比为：1∶1，免疫佐剂共聚物与水溶性碳基纳米载体的质量比为：1∶40～1∶60，制得负载有亲脂性阳离子共聚物和免疫佐剂共聚物的纳米载体溶液；
步骤C：在避光条件下，将光敏剂溶解于水或二甲亚砜(DMSO)制得光敏剂溶液，然后将光敏剂溶液加入到完成步骤B后负载有亲脂性阳离子共聚物和免疫佐剂共聚物的纳米载体溶液中，充分混合后，在室温下振荡培养10～18小时，反应完成后，将溶液离心处理后清洗以除去多余光敏剂，制得负载有亲脂性阳离子共聚物、免疫佐剂共聚物和光敏剂的纳米载体溶液，经冷冻干燥即可得到线粒体靶向的纳米光敏免疫复合药物。
本技术方案中水溶性碳基纳米粒子包括：纳米氧化石墨烯、单臂碳纳米管、多臂碳纳米管或者富勒烯；优选为纳米氧化石墨烯；
作为优选实施方式，水溶性碳基纳米粒子的粒径为150nm～500nm。
本技术方案中在近红外光(波长620～1100nm)激发下具有光动力及光热效应的有机染料包括：二氟化硼二吡咯甲川染料及其衍生物类(BODIPY)，罗丹明类菁类(优选为：ICG、IR820、IR825)或者苝类。
本技术方案中免疫佐剂共聚物优选为由磷脂聚乙二醇衍生物修饰的非甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸共聚物(以下简称为DP-CpG共聚物)，非甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(以下简称为CpG ODN)能够模拟非甲基化CpG二核苷酸片段的免疫刺激活性。当其被树突状细胞(DC)、B细胞、单核细胞、巨噬细胞等靶细胞内化后，会与Toll样受体9(TLR-9)结合，有效增强相应细胞的活性和促进多种细胞因子的分泌，诱导免疫应答，进而在抵抗机体肿瘤方面发挥免疫佐剂的作用。
本技术方案中DP-CpG共聚物中CpG ODN部分硫化，即部分具有硫代磷酸酯键，能够耐受核酸酶——DNase酶。
本技术方案采用的CpG ODN包括：A型CpG ODN、B型CpG ODN、C型CpG ODN和P型CpGODN，优选为含有20～24个碱基对，其中：A型CpG ODN中包括CpG ODN1585，CpG ODN2216和CpG ODN2336，B型CpG ODN中包括CpG ODN1668，CpG ODN1826，CpG ODN2006，CpG ODN2007，CpG ODN7909，CpG ODN BW006和CpG ODN D-SL 01；C型CpG ODN中包括CpG ODN2395，CpGODN M362和CpG ODN D-SL 03；P型CpG ODN中包括CpG ODN21798；
本技术方案中CpG ODN优选为CpG ODN 1826。
本技术方案中线粒体靶向共聚物优选为由磷脂聚乙二醇衍生物修饰的亲脂性阳离子共聚物，上述共聚物中的阳离子基团具有较高的脂溶性和正电性能，能利用线粒体外膜与间隙、内膜与基质之间膜电位负电势的差异靶向线粒体；本技术方案中亲脂性阳离子基团优选为苯基膦基团，提供苯基膦基团的物质包括但不限于以下物质：三苯基膦分子(TPP)、四苯基膦分子。
本技术方案中磷脂为本领域技术术语，根据本领域技术常识，磷脂是指整个分子具有零电荷且具有输水性脂肪链的中性磷脂聚乙二醇氨；本技术方案中磷脂包括但不限于以下物质：二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二油烯基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、双肉豆蔻磷脂酰乙醇胺(DMPE)和二月桂酰基磷脂酰乙醇胺(DLPE)；
根据本发明优选实施例，磷脂采用二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)；
进一步地，本技术方案中亲脂性苯基膦阳离子共聚物是由氨基修饰的磷脂聚乙二醇衍生物(磷脂-PEG-NH2)与末端含有羧基的三苯基膦化合物通过酰胺化反应所制得；
进一步地，本技术方案中DP-CpG共聚物是由马来酰亚胺功能化的磷脂聚乙二醇衍生物(磷脂-PEG-MAL)中磷脂为疏水端，而马来酰亚胺(Maleinimide，MAL)为亲水端，与标记有巯基(-SH)的CpG ODN进行迈克尔加成反应生成CpG ODN共聚物。
上述亲脂性阳离子共聚物中疏水端磷脂和DP-CpG共聚物中疏水端磷脂均可通过疏水作用组装到所述纳米载体表面。
本技术方案中聚乙二醇(PEG)的分子量范围为500～5000Da，优选分子量为2000，分子量的单位为道尔顿。
本技术方案中步骤B中制得的纳米载体负载亲脂性阳离子共聚物和免疫佐剂共聚物的顺序不做限定，即可以先吸附亲脂性阳离子共聚物，待亲脂性阳离子共聚物负载于纳米载体上后，再吸附免疫佐剂共聚物，使得免疫佐剂共聚物也负载于纳米载体上，或者也可以先吸附免疫佐剂共聚物，待免疫佐剂共聚物负载于纳米载体上后，再吸附亲脂性阳离子共聚物，使得亲脂性阳离子共聚物也负载于纳米载体上；
具体地，纳米载体负载亲脂性阳离子共聚物和免疫佐剂共聚物的方式如下：
纳米载体负载亲脂性阳离子共聚物：将一定质量的亲脂性阳离子共聚物加入一定浓度的纳米载体溶液中，在室温条件下搅拌10～18小时后，然后将混合溶液经过离心处理，并采用三蒸水充分洗涤沉淀，洗去未负载到纳米载体上的亲脂性阳离子共聚物，经过上述操作将亲脂性阳离子共聚物负载于纳米载体上。
纳米载体吸附免疫佐剂共聚物：将一定质量的免疫佐剂共聚物加入一定浓度的纳米载体溶液中，在室温条件下，摇床培养12～18小时，然后将混合溶液经过离心处理，并采用三蒸水充分洗涤沉淀，洗去未载到纳米载体上的免疫佐剂共聚物，经过上述操作将免疫佐剂共聚物负载于纳米载体上。
技术方案3：
线粒体靶向的纳米光敏免疫复合药物的应用，通过瘤内给药或者静脉给药至生物体内，瘤内给药2～6小时或者静脉给药18～24小时后，采用任一种波长在620～1100nm范围内的激光中照射肿瘤部位，照射时间优选为5～20分钟，照射激光的功率密度优选为0.25～2W/cm2。
作为优选实施方式，近红外激光的波长为808nm；
通过上述操作可实现增强光学治疗(释放单态氧和产生光热效应)的效果，极大提高肿瘤治疗效率。
本发明提供的纳米复合药物可用于治疗的癌症包括但不限于生物体器官表面或者内部出现的各种实体瘤，包括：皮肤癌、恶性黑色素瘤、鼻咽癌、食道癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、喉癌、甲状腺癌，舌癌，前列腺癌、阴茎癌、睾丸肿瘤，阴道恶性肿瘤、外阴恶性肿瘤等。
相比现有技术，本发明的有益效果如下：
本发明利用碳基纳米粒子的平面结构和极大的比表面积，通过π-π共轭和疏水作用对光敏剂、免疫佐剂共聚物和亲脂性阳离子共聚物高效共载，构建了一种集光学治疗和免疫治疗于一体的线粒体靶向型复合药物。通过纳米载体的增强渗透和EPR效应滞留在生物体肿瘤部分，进一步地，亲脂性阳离子赋予纳米复合药物亚细胞器定位功能，进而在近红外激光刺激下，光敏剂启动活性氧自由基介导的线粒体凋亡途径，显著提高了光动力治疗效应、光热效应和肿瘤细胞的免疫原性，并在免疫佐剂发挥治疗作用下，能够进一步有效激发机体的抗肿瘤免疫响应，达到抑制肿瘤的发展转移并清除肿瘤的目的。
本发明纳米复合药物具有高效、低毒、释药可控的优势，联合光学治疗和免疫治疗综合高效治疗肿瘤，并原位刺激机体免疫抗肿瘤应答，使得机体产生肿瘤特异性免疫力，也有利于减少光敏剂的剂量，进一步降低其毒副作用。
本发明纳米复合药物给药具有时空可控性，治疗时采用波长在生物组织近红外透明窗口范围内的激光，能够使用较低剂量光敏剂即可实现激光猝发下良好的肿瘤细胞杀伤效果，从而进一步降低激光对正常组织造成危害的风险。
本发明纳米复合药物制备条件温和，在治疗原位肿瘤甚至转移肿瘤具有广阔的前景，将会成为肿瘤联合增敏治疗的重要策略之一。
附图说明
图1为本发明纳米复合药物的结构示意图。
图2为本发明实施例制备得到DP-CpG ODN共聚物在反应物不同重量比下的非变性聚丙烯凝胶电泳结果。
图3为本发明实施例制备得到线粒体靶向型纳米载体(以下简写为GT)的热重分析曲线。
图4为本发明实施例制得GT的水力粒径表征图。
图5为本发明实施例制得负载有DP-CpG共聚物的线粒体靶向型纳米复合物(以下简写为GT/DP-CpG纳米复合物)的紫外-可见光吸收光谱图。
图6为本发明实施例制得负载有DP-CpG共聚物和光敏剂IR820的线粒体靶向型纳米复合物(以下简写为GT/DP-CpG/IR820)的紫外-可见光吸收光谱图。
图7为本发明实施例制得GT/DP-CpG/IR820的载药率和包封率。
图8为本发明实施例分别制得GT/DP-CpG纳米复合物和负载有CpG ODN的线粒体靶向型纳米复合物(以下简写为GT/CpG ODN纳米复合物)的载药率及包封率对比图。
图9为本发明实施例制得GT/DP-CpG/IR820和光敏剂IR820的体外单态氧产率对比图，其中：图A为光敏剂IR820激光照射不同时间下的单态氧荧光图谱，图B为本实施例制得GT/DP-CpG/IR820光敏剂激光照射不同时间下的单态氧荧光图谱。
图10为本发明实施例制得GT、光敏剂IR820、靶向型纳米光敏药物(以下简写为GT/IR820)、GT/DP-CpG和GT/DP-CpG/IR820)的光热曲线。
图11为本发明实施例制得GT/DP-CpG/IR820的细胞摄取及亚细胞器定位的共聚焦荧光图。
图12为本发明采用ELISA法检测DP-CpG、GT和制得GT/DP-CpG的免疫刺激活性检测结果图；其中，图(A)为DP-CpG、GT和GT/DP-CpG分别与RAW264.7细胞孵育后检测所得TNF-α的分泌水平对比图；图(B)为DP-CpG、GT和GT/DP-CpG分别与RAW264.7细胞孵育后检测所得TNF-γ的分泌水平对比图。
图13为本发明实施例制得GT/IR820与非靶向性纳米光敏药物(以下简写为GP/IR820)的体外光疗结果对比图；其中，图(A)为激光照射条件的细胞存活率结果图，图(B)为无光照条件的细胞存活率结果图。
图14为本发明实施例制得GT/DP-CpG/IR820的体内抗肿瘤测试结果；其中，图(A)为空白对照组、光照组、光敏剂IR820组、DP-CpG组、GT组、GT/IR820组+光照和GT/DP-CpG/IR820+光照组肿瘤的生长曲线，图(B)为疗程结束后空白对照组、光照组、光敏剂IR820组、DP-CpG组、GT组、GT/IR820+光照组和GT/DP-CpG/IR820+光照组小鼠肿瘤重量比较结果图；图(C)为疗程中空白对照组、光照组、光敏剂IR820组、DP-CpG组、GT组、GT/IR820+光照组和GT/DP-CpG/IR820+光照组的小鼠体重变化结果图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和实施例对本发明进行详细阐述：
如图1所示为本发明纳米光敏免疫复合药物的结构示意图，采用片状具有巨大表比面积的纳米氧化石墨烯作为纳米载体，同时纳米氧化石墨烯自身具有免疫刺激效应，能够显著激活巨噬细胞并引发促炎细胞因子的生产，具有免疫佐剂的作用；通过采用由磷脂聚乙二醇衍生物分别对亲脂性阳离子和CpG ODN共修饰形成亲脂性阳离子共聚物和DP-CpG共聚物，其中疏水端磷脂通过疏水作用与纳米载体结合，使得亲脂性阳离子和CpG ODN负载于纳米载体表面，并且通过π-π堆积作用将光敏剂自组装于水溶性碳基纳米粒子表面。
实施例1：
一种线粒体靶向的纳米光敏免疫复合药物的制备方法：
本实施中磷脂采用二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(以下简写为DSPE)，亲脂性阳离子基团采用苯基膦基团，具体地，含有苯基膦基团的亲脂性化合物采用5-羧基戊基三苯基溴化磷，光敏剂采用IR820，免疫佐剂采用CpG ODN 1826；
本实施中先将亲脂性阳离子共聚物负载于纳米载体上制得靶向型纳米载体(以下简写为GT)，然后再将免疫佐剂共聚物负载于GT上，最后负载光敏剂制得光敏免疫复合药物；
以下为本实施例的具体操作：
步骤1：合成亲脂性阳离子共聚物DSPE-PEG-TPP及DP-CpG共聚物；
制备亲脂性阳离子共聚物：
精确称取20.0mg 5-羧基戊基三苯基溴化磷溶解于0.5mL氯仿中，磁力搅拌使得5-羧基戊基三苯基溴化磷充分溶解，然后加入29.5mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、17.5mg N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和0.05mL三乙胺，在室温下反应4小时，再加入25.0mg氨基修饰的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺聚乙二醇衍生物(以下简称为DSPE-PEG-NH2)，磁力搅拌均匀，室温下反应24小时，待反应完成后，将混合溶液转入旋蒸瓶中，在37℃下旋蒸蒸干，然后用2mL三蒸水溶解样品，并置于2KDa透析袋内透析三天后，取出溶液，冷冻干燥，称重，密封保存，得到亲脂性阳离子共聚物；
本实施例通过紫外分光光度表征并计算DSPE-PEG的TPP的接枝率约为80％(W/W％)；
制备DP-CpG共聚物：
采用10mM pH为8的Tris-HCl缓冲液分别溶解巯基功能化的CpG ODN1826和马来酰亚胺功能化的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺聚乙二醇衍生物(以下简称DSPE-PEG-MAL)制得浓度为0.66mg/mL的CpG ODN1826溶液和浓度为10.0mg/mL的DSPE-PEG-MAL溶液；
分别取四份均为100μL的CpG ODN1826溶液分别与6.6μL、13.2μL、33.0μL和66.0μLDSPE-PEG-MAL溶液混合于2mL棕色离心管，得到四组混合溶液；将四份混合溶液置于转速为200rpm的摇床在室温下反应4小时，待反应结束后，使用3KD超滤管在转速为8000rpm的条件下离心分离5分钟，然后除去未反应的CpG ODN1826，超滤过后定容至100μL；
本实施例采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳表征迈克尔加成反应得到由二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺聚乙二醇衍生物修饰的CpG ODN1826(以下简称DP-CpG共聚物)，如附图2所示，当CpG ODN1826与DSPE-PEG-MAL的质量比为1：10时DP-CpG共聚物的产率为90％。
步骤2：合成GT；
取2.0mL浓度为0.5mg/mL分散均匀的纳米氧化石墨烯(GO)溶液，用1M NaOH溶液和1M HCl溶液调节上述溶液pH至7左右，然后加入1.0mg步骤1制得的DSPE-PEG-TPP，在室温下搅拌过夜反应，然后将上述混合溶液在转速为15000rpm的条件下离心分离30分钟，然后用三蒸水洗涤三次去除未反应物，再定容至2mL；
本实施例采用热重分析法分析GO和GT的重量变化，二者的差值则DSPE-PEG-TPP在GO载体上的质量百分比，如图3所示，DSPE-PEG-TPP在温度区间300～400摄氏度间，GT发生显著失重，由此估算DSPE-PEG-TPP在GT中所占的质量百分比为34％，经过计算得到TPP负载率为12％；本实施例采用动态光散射对GT粒径进行表征，如图4所示，GT的水力直径为200nm左右。
步骤3：负载免疫佐剂及光敏剂；
取0.5mL步骤2制得的浓度0.5mg/mL的GT溶液于棕色离心管中，加入20μL浓度为0.22mg/mLDP-CpG共聚物溶液，然后将混合溶液置于转速为200rpm恒温摇床，在室温反应12小时；反应结束后，将溶液转移到10.0mL离心管中，在转速为15000rpm的条件下离心分离30分钟，然后采用超纯水反复洗涤三次以除去未负载上的DP-CpG共聚物，再用超纯水定容至500mL，4℃储存，得到纳米氧化石墨烯上负载有DP-CpG共聚物和DSPE-PEG-TPP的纳米复合物(以下简称GT/DP-CpG纳米复合物)；
本实施例通过荧光探针FAM标记CpG，然后采用紫外可见光谱对GT/DP-CpG纳米复合物表征，通过荧光发射光谱分别检测上清中CpG的荧光强度，表征结果如图5所示：通过紫外-可见吸收光谱检测得纳米复合药物显示有自由DSPE-PEG-CpG的荧光标记探针FAM在480nm处的特征吸收峰，表明DSPE-PEG-CpG的成功负载。
取4.0mL上述操作配制所得浓度为0.5mg/mL的GT/DP-CpG溶液，均分为八组，各组均置于10mL棕色离心管中，再向八组棕色离心管中分别加入体积分别为5μL、12.5μL、25μL、50μL、75μL、100μL、125μL和150μL浓度为1.0mg/mL的IR820溶液进行混合，通过超声分散使各组溶液充分混合均匀，将八组混合溶液均放置于转速为200rpm的恒温培养振荡器中，在25℃下反应12小时，反应结束后将所得的八组溶液分别转移至八个1.5mL的棕色离心管中，均放置于同一高速离心机中，在15000rpm的条件下离心30分钟，然后用超纯水反复洗涤三次以除去未负载的光敏剂分子，最后用超纯水定容至500L，4℃下储存，即得到八组纳米氧化石墨烯上负载有DP-CpG、DSPE-PEG-TPP和光敏剂IR820的纳米复合物溶液(以下简称GT/DP-CpG/IR820)。
本实施采用紫外可见光谱对GT/DP-CpG/IR820进行表征，如图6所示，可以看出：纳米复合药物的光谱图中不但显示有自由DSPE-PEG-DP-CpG的荧光标记探针FAM在480nm处的特征吸收峰，同时还显示有IR820在近红外区(680～980nm)的吸收峰，表明IR820的成功负载。
通过紫外光谱检测所得八组纳米复合药物上清液中自由IR820的吸光度，利用标准曲线可以计算上清液中IR820的量，通过差减法得到连接至纳米复合药物上IR820的量，结果如图7所示，从图中可以看出最大载药率可达到25％。
实施例2：
取0.5mL步骤2制得的浓度0.5mg/mL的GT溶液于棕色离心管中，加入20μL浓度为0.22mg/mL CpG ODN 1826溶液，然后将混合溶液置于转速为200rpm恒温摇床，在室温反应12小时；反应结束后，将溶液转移到10mL离心管中，在转速为15000rpm的条件下离心分离30分钟，然后采用超纯水反复洗涤三次以除去未负载上的CpG ODN 1826，再用超纯水定容至0.25mL，4℃储存，得到纳米氧化石墨烯上负载有CpG ODN 1826的纳米复合物(以下简称GT/CpG ODN纳米复合物)；
为对比本实施例制得GT/CpG ODN纳米复合物和实施例1中步骤3制得GT/DP-CpG纳米复合物的包封率(EE)和载药率(DLR)，本实施例通过荧光探针FAM分别标记两种纳米复合物溶液中的CpG，通过荧光发射光谱分别检测两种纳米复合物溶液上清液中CpG的荧光强度，并利用标准曲线分别计算得到两种纳米复合物上清液中CpG的残余量，通过差减法分别得到连接在GT/DP-CpG纳米复合物和GT/CpG ODN纳米复合物上CpG的量，将测得的荧光强度值代入CpG的标准曲线方程，计算CpG的浓度，分别通过以下公式计算GT/DP-CpG纳米复合物和GT/CpG ODN纳米复合物上CpG的包封率(EE)和载药率(DLR)：
EE(％)＝(起始投药量-上清未负载药物的量)/起始投药量×100％
DLR(％)＝(起始投药量-上清未负载药物的量)/纳米复合物的量×100％
结果如图8所示，GT/DP-CpG纳米复合物的载药率和包封率远远高于GT/CpG ODN纳米复合物的载药率。
实施例3：
本实施例对本发明实施例1制得GT/DP-CpG/IR820进行光动力-光热性质测试，主要通过以下方法进行测评：
(1)体外单线态氧产率测定：
本实施例采用绿色单线态氧探针(SOSG)检测GT/DP-CpG/IR820和光敏剂IR820的单线态氧产率；
检测原理如下：无单线态氧存在时，SOSG分子内的电子转移淬灭了生色团的荧光，而存在单线态氧时，SOSG形成内过氧化物，导致电子转移发生改变，生色团的荧光在530nm处得到恢复。因此，SOSG在530nm处的荧光强度的上升量直接反映了单线态氧的产量。
单线态氧产率测定的具体操作如下：向1mL浓度为10μg/mL的GT/DP-CpG/IR820水溶液中，加入1μL单线态氧荧光探针SOSG母液，混合均匀，混合溶液中SOSG终浓度为2.5μM，测量混合溶液在530nm处的荧光强度；
然后采用波长为808nm的激光以功率密度为0.5W/cm2的光强持续照射20分钟，测量混合溶液经光照后在530nm处的荧光强度；
通过分析图9所示结果可以得到GT/DP-CpG/IR820和光敏剂IR820的单线态氧产生情况：光敏剂IR820和纳米复合药物GT/DP-CpG/IR820产生单线态氧的能力随着光照时间的延长逐渐增强，但在相同光照时长下，纳米复合药物GT/DP-CpG/IR820的单线态氧产率相较于自由光敏剂IR820低，这是由于石墨烯载体与光敏剂IR820之间发生能量转移所致，但本实施纳米复合物GT/DP-CpG/IR820仍可进一步用于光动力治疗。
(2)体外光热性能检测：
将实施例1制得的GT配制成浓度为100μg/mL的溶液，将光敏剂IR820配制成浓度为10μg/mL的溶液，然后通过实施例1方法制备GT浓度为100μg/mL、光敏剂IR820浓度为10μg/mL的线粒体靶向型复合物GT/IR820；GT浓度为100μg/mL、DP-CpG浓度为2μg/mL的免疫复合物GT/DP-CpG；光敏剂IR820浓度为10μg/mL、DP-CpG浓度为2μg/mL的光敏免疫GT/DP-CpG/IR820；然后分别取上述制得溶液各一份，每一份均为0.2mL，加入到96孔板中，使用波长为808nm的近红外激光，在功率密度0.5W/cm2照射5分钟，采用与计算机连接的热电偶测试溶液温度上升情况，并设置一组超纯水的温度上升作为对照；
如图10所示，由于GT和光敏剂IR820在波长范围为700～1100nm的近红外区域具有较强的吸收，所以两者的光热效应均显示出明显地浓度依赖；在相同光照时长下，复合药物GT/IR820显示出比载体和IR820增强的光热效应，可进一步用于光热治疗。
实施例4：
本实施例通过以下操作检测本发明实施例1制得GT/DP-CpG/IR820的亚细胞器定位能力：
采用1640培养基培养小鼠乳腺癌细胞EMT-6(以下简称EMT6)，将处于生长对数期的EMT6细胞接种于35mm的玻璃底培养皿(密度为6.5×104个/孔)，培养24小时；然后将根据本发明实施例1制得浓度为200μg/mL的GT/DP-CpG/IR820纳米复合药物加至两组培养皿，两组培养皿中相应的DP-CpG的终浓度均为4μg/mL，相应的IR820的终浓度均为35μg/mL，然后将两组培养皿置于二氧化碳孵箱中继续培养2小时和4小时；
孵育结束后采用PBS溶液将细胞洗涤三遍，细胞加入溶酶体探针(Lyso-TrackerGreen，LTG)工作液(200nM)或线粒体探针(mito-Tracker Green，MTG)染色工作液(200nM)，孵育30分钟；去除染液，用PBS洗涤三次，室温条件用4％的多聚甲醛溶液固定20分钟，再用PBS洗涤三次，向每个培养皿中加入1.0mL的细胞核染液(DAPI染液)，室温下进行避光染色5分钟后，弃掉DAPI染液，用PBS缓冲液再次反复清洗三次；最后加入1mL PBS缓冲液浸没细胞，将其置于激光共聚焦显微镜下观察，设置DAPI的激发波长为405nm，在该激发波长下DAPI呈现蓝色荧光，IR820的激发波长分别为630nm，在该激发波长下DAPI呈现红色荧光，Lysotracker Green和Mito-Tracker Green激发波长为488nm，在该激发波长下DAPI呈现绿色荧光，得到如图11(A)所示结果GT/DP-CpG/IR820与细胞孵育2小时后，IR820的红色荧光和LTG的绿色荧光重合成黄色荧光，而孵育4小时后，IR820的红色荧光和LTG的绿色荧光不重合，表明GT/DP-CpG/IR820在2小时存在与细胞溶酶体中，而在4小时逃离溶酶体；如图12(B)所示GT/DP-CpG/IR820与细胞孵育2小时后，IR820的红色荧光和MTG的绿色荧光不重合，而孵育4小时后，IR820的红色荧光和MTG的绿色荧光重合成黄色荧光,表明GT/DP-CpG/IR820在2小时未位于线粒体上，而4小时则与线粒体共定位。
上述结果显示了纳米复合物的细胞摄取和亚细胞器定位情况，可以看出：GT/DP-CpG/IR820能够较好的被细胞摄取，并且具有较好的溶酶体逃逸能力，2小时内分布在细胞的溶酶体，4小时后逃离溶酶体定位于线粒体中。本实施例能够说明纳米复合药物GT/DP-CpG/IR820具有很好的线粒体靶向定位作用。
实施例5：
本实施例通过以下操作检测本发明实施例1制得GT/DP-CpG纳米免疫复合物的免疫刺激能力：
将小鼠单核巨噬细胞RAW264.7接种于96孔板(密度为1×105个/孔)，用细胞培养液稀释根据本发明实施例1制得浓度为1mg/mL的GT/DP-CpG纳米复合物至[GT]为100μg/mL，[DP-CpG]为2.0μg/mL，然后加入孔中，继续培养8小时后收集上次清液，用酶联免疫吸附实验(ELISA)试剂盒测定TNF-α的分泌水平；与细胞孵育24小时后再次收集上次清液，用ELISA试剂盒测定IFN-γ的分泌水平；
如图12所示为GT/DP-CpG纳米复合物在细胞摄取后诱导分泌白细胞介素TNF-α、IFN-γ的结果。结果显示：石墨烯纳米载体本身和DO-CpG会使细胞产生一定水平的促炎细胞因子，而根据实施例1制得的中GT/DP-CpG纳米复合物则显示出非常显著的促炎细胞因子分泌水平。
实施例6：
本实施例通过以下操作测定GT/IR820与GP/IR820体外靶向肿瘤光疗效果：
将小鼠乳腺癌EMT6细胞接种在96孔板中，细胞密度为104个/孔，取负载有相同质量光敏剂的GP/IR820和GT/IR820分别分散于相同体积DMEM培养液，加入96孔板中，GT终浓度为100μg/mL，IR820终浓度分别为0，2.5，5，10，15μg/mL，共培养4小时后，弃去孔板中含有纳米复合物的旧培养液，用PBS缓冲液反复清洗三次，向孔板中加入新鲜的细胞培养液；
采用波长为808nm激光在功率密度为0.5W/cm2下分别照射每个孔5分钟，激光处理结束后，将培养板放置于细胞培养箱继续培养24小时；吸出孔板中旧培养液，用PBS缓冲液反复清洗三次，再向每孔中加入100μL CCK8工作液，将培养板置于细胞培养箱中继续培养45分钟；打开酶标仪预热，设置参数后将孔板放置于酶标仪中，检测细胞在450nm处的吸光度(OD值)并计算细胞存活率。
通过纳米光敏复合物处理过的细胞的活细胞与空白对照液的活细胞相比的百分数表示细胞毒性。
如图13为靶向性光敏复合药物GT/IR820和非靶向性GP/IR820的体外抗肿瘤效应图，两者对肿瘤细胞的杀伤能力具有浓度依赖性，与自由IR820相比，靶向性光敏复合药物GT/IR820比非靶向性GP/IR820具有更强的体外抗肿瘤效应；例如，结合IR820(10μg/mL)的GP/IR820复合物可将细胞存活率由自由IR820的58％降低到30％；而IR820(10μg/mL)携载到靶向性载体上后，细胞的存活率进一步下降到19％，具有显著的统计学差异，这充分说明线粒体靶向性载体能够显著增强肿瘤光疗效果。
实施例7：
本实施例通过以下操作研究纳米光敏免疫复合药物体内联合抗肿瘤效果，包括以下步骤：
步骤1：选用多只5～6周龄，体重18～22g的雌性Balb/c小鼠，将EMT6细胞接种于Balb/c小鼠右腿后背部，接种大约一周左右，待接种肿瘤长到一定大小时得到所需异种移植荷瘤小鼠模型；
步骤2：将接种肿瘤成功的小鼠随机分为7组，分别记为1～7组，标记第1组为生理盐水组，第2组为生理盐水加激光照射组，第3组为GT组，第4组为IR820组，第5组为DP-CpG组，第6组为GT/IR820加激光照射组，第7组为GT/DP-CpG/IR820加激光照射组；
步骤3：标记3～7组的药物采用实施例1制得药物，将其分别溶解分散于生理盐水中制成各组所用药品溶液，给药方式采用瘤内注射，生理盐水的剂量为50μL/只，CpG ODN的剂量为10μL/只，IR820剂量为50μL/只，GT/IR820和GT/CpG/IR820的剂量为100μL；
将小鼠脱毛，暴露出光照区，给药后2小时，使用功率密度为0.5W/cm2，波长为808nm的近红外激光照射第2组、第6组和第7组小鼠的肿瘤部位10分钟，同时用红外热像仪检测肿瘤部位的温度变化，隔日通过游标卡尺测量肿瘤两个维度的大小，检测荷瘤鼠的体重；
本实验各组小鼠给药为每周给药一次，一共给3次药，观察记录各组肿瘤大小、小鼠体重变化情况，第22天，处死小鼠，分离出瘤块并称重。
肿瘤体积计算公式如下：
V＝WL2/2
其中，W代表肿瘤的长径，L代表肿瘤的短径。
图14显示了实施例六的体内联合抗肿瘤结果，从图中可以看出：与GT/IR820处理组和DP-CpG处理组相比，纳米光敏免疫复合物GT/DP-CpG/IR820表现出极为明显的肿瘤抑制效果，最终肿瘤体积和重量最小；并且在整个治疗过程中，小鼠的体重无明显变化，表明GT/DP-CpG/IR820具有很好的生物安全性。
以上结合附图对本发明的实施例进行了阐述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。

Claims (5)

1.一种线粒体靶向的纳米光敏免疫复合药物，其特征在于，包括纳米载体，以及分别与纳米载体连接的线粒体靶向共聚物、免疫佐剂共聚物和光敏剂，所述纳米载体为水溶性碳基纳米粒子，所述线粒体靶向共聚物为由磷脂聚乙二醇修饰的亲脂性阳离子共聚物，所述免疫佐剂共聚物为由磷脂聚乙二醇修饰的CpG ODN共聚物，所述光敏剂为近红外光激发下具有光动力及光热效应的有机染料，其中：磷脂的疏水脂肪链与水溶性碳基纳米粒子之间通过疏水作用力结合使得线粒体靶向共聚物和免疫佐剂共聚物负载于水溶性碳基纳米粒子上，光敏剂通过π-π堆积作用自组装于水溶性碳基纳米粒子表面；
所述水溶性碳基纳米粒子为纳米氧化石墨烯；
由磷脂聚乙二醇修饰的亲脂性阳离子共聚物中的亲脂性阳离子基团为苯基膦阳离子；
由磷脂聚乙二醇修饰的亲脂性阳离子共聚物是由氨基功能化的磷脂聚乙二醇与末端含有羧基的三苯基膦化合物通过酰胺反应所制得；
由磷脂聚乙二醇修饰的CpG ODN共聚物是由马来酰亚胺功能化的磷脂聚乙二醇中磷脂为疏水端，聚乙二醇-马来酰亚胺为亲水端，与标记有巯基的CpG ODN进行迈克尔加成反应生成；
所述磷脂为磷脂酰乙醇胺。
2.根据权利要求1所述的一种线粒体靶向的纳米光敏免疫复合药物，其特征在于，水溶性碳基纳米粒子的粒径为150nm～500nm。
3.根据权利要求1所述的一种线粒体靶向的纳米光敏免疫复合药物，其特征在于，所述光敏剂包括：吲哚菁绿、新吲哚菁绿或吲哚七甲川菁。
4.一种权利要求1-3任一项所述的一种线粒体靶向的纳米光敏免疫复合药物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤A：分别制备线粒体靶向共聚物及免疫佐剂共聚物，具体操作如下：
制备线粒体靶向共聚物：
将含有苯基膦基团和羧基基团的亲脂性化合物溶解于氯仿中，搅拌条件下加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、N-羟基丁二酰亚胺和三乙胺，室温下反应2～6小时，再加入氨基功能化的磷脂聚乙二醇，搅拌均匀，室温下反应18～24小时，待反应完成后，将混合溶液经过旋转蒸发处理，旋转蒸发温度28～39℃，待旋转蒸发完成得到样品，然后用蒸馏水溶解样品得到亲脂性阳离子共聚物溶液；
制备免疫佐剂共聚物：
将巯基功能化的CpG ODN和马来酰亚胺功能化的磷脂聚乙二醇分别溶解于Tris-HCl缓冲液制得浓度为8～15mg/mL的CpG ODN溶液和浓度为0.5～1mg/mL的马来酰亚胺功能化的磷脂聚乙二醇溶液，上述所用Tris-HCl缓冲液的pH在为6.8～8.5范围内，然后将巯基功能化的CpG ODN溶液和马来酰亚胺功能化的磷脂聚乙二醇溶液混合均匀，得到混合溶液中巯基功能化的CpG ODN与马来酰亚胺功能化的磷脂聚乙二醇的质量比为1∶1～1∶10，将混合溶液在室温下避光反应4～8小时，反应完成后进行离心处理，离心处理完成后通过清洗操作去除多余的反应物，制得免疫佐剂共聚物溶液；所述磷脂为磷脂酰乙醇胺；
步骤B：将水溶性碳基纳米粒子超声溶解于水中，调节溶液的pH值在6.8～8.5范围内，制得纳米载体溶液，然后将步骤A制得的线粒体靶向共聚物和免疫佐剂共聚物分别与所述纳米载体溶液中反应进行吸附，其中：线粒体靶向共聚物与水溶性碳基纳米载体的质量比为：1∶1，免疫佐剂共聚物与水溶性碳基纳米载体的质量比为：1∶40～1∶60，制得负载有线粒体靶向共聚物和免疫佐剂共聚物的纳米载体溶液；所述水溶性碳基纳米粒子为纳米氧化石墨烯；
步骤C：在避光条件下，将光敏剂溶解于水或二甲亚砜制得光敏剂溶液，然后将光敏剂溶液加入到完成步骤B后负载有线粒体靶向共聚物和免疫佐剂共聚物的纳米载体溶液中，充分混合后，在室温下振荡培养10～18小时，反应完成后，将溶液离心处理后清洗以除去多余光敏剂，制得负载有线粒体靶向共聚物、免疫佐剂共聚物和光敏剂的纳米载体溶液，经冷冻干燥即可得到线粒体靶向的纳米光敏免疫复合药物。
5.线粒体靶向的纳米光敏免疫复合药物在制备药物中的应用，其特征在于，基于权利要求1-3任一项所述的线粒体靶向的纳米光敏免疫复合药物实现，通过瘤内给药或者静脉给药至生物体内，采用波长为620～1100nm的激光中任一种照射5～20分钟，照射激光的功率密度为0.25～2W/cm2。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4027412A4 (en) * 2020-08-10 2023-11-15 Lg Energy Solution, Ltd. CATHODE COATING FOR LITHIUM SECONDARY BATTERY, METHOD FOR MANUFACTURING SAME, AND ANODE AND LITHIUM SECONDARY BATTERY EACH COMPRISING THE SAME COATING

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108619532B (zh) * 2018-05-22 2021-03-16 电子科技大学 一种用于肿瘤原位可视化治疗的核壳型纳米药物及其制备方法
CN109481675A (zh) * 2018-10-11 2019-03-19 湖北大学 一种用于光动治疗的原位荧光成像引导的内源光敏剂合成增强方法
CN109529046B (zh) * 2018-11-09 2020-10-27 北京大学 一种靶向线粒体的自组装蛋白质纳米颗粒的制备与应用
CN111358811A (zh) * 2018-12-26 2020-07-03 深圳先进技术研究院 细菌-光热纳米颗粒复合物及制备方法和应用
CN110987583B (zh) * 2019-11-25 2022-05-13 中国人民解放军第四军医大学 一种用sosg检测mc540单线态氧产量的方法
CN111234030A (zh) * 2020-01-19 2020-06-05 吉林大学 一种线粒体靶向光敏剂Sarm1-mtKR及其制备方法和应用
CN111135293B (zh) * 2020-02-26 2023-11-03 汕头大学 一种基于ova蛋白修饰的氧化铁锰杂化纳米药物与制备方法
CN113425840B (zh) * 2020-03-23 2022-10-14 国家纳米科学中心 一种纳米佐剂及其制备方法和应用
CN111514306B (zh) * 2020-04-23 2022-05-13 中国科学院化学研究所 一种增强抗肿瘤免疫治疗的富勒烯纳米颗粒
CN111821436B (zh) * 2020-08-04 2021-10-08 电子科技大学 肿瘤原位产氧增敏光动力疗效的靶向穿透型纳米诊疗复合物及其构建方法
CN113577040A (zh) * 2021-07-19 2021-11-02 河北工程大学附属医院 负载中药单体的纳米载体及在制备抗肿瘤药物中的应用
CN116983427A (zh) * 2023-07-05 2023-11-03 东华大学 一种多功能声激活型半导体聚合物纳米免疫药物及制备方法及应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105833289A (zh) * 2016-05-30 2016-08-10 上海交通大学 一种线粒体靶向的纳米药物递送系统及其制备方法与应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105833289A (zh) * 2016-05-30 2016-08-10 上海交通大学 一种线粒体靶向的纳米药物递送系统及其制备方法与应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A graphene oxide based smart drug delivery system for tumor mitochondria-targeting photodynamic therapy;Yanchun Wei et al.;《Nanoscale》;20160111;第8卷;第3530-3538页 *
Immunostimulatory oligonucleotides-loaded cationic graphene oxide with photothermally enhanced immunogenicity for photothermal/immune cancer therapy;Yu Tao et al.;《Biomaterials》;20140915;第35卷;第9963-9971页 *
Metronomic Doses of Temozolomide Enhance the Efficacy of Carbon Nanotube CpG Immunotherapy in an Invasive Glioma Model;Mao Ouyang et al.;《PLoS ONE》;20160201;第11卷(第2期);第1-20页 *
Mitochondria-Targeting Ceria Nanoparticles as Antioxidants for Alzheimer’s Disease;Hyek Jin Kwon et al.;《ACS Nano》;20160204;第10卷;第2860-2870页 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4027412A4 (en) * 2020-08-10 2023-11-15 Lg Energy Solution, Ltd. CATHODE COATING FOR LITHIUM SECONDARY BATTERY, METHOD FOR MANUFACTURING SAME, AND ANODE AND LITHIUM SECONDARY BATTERY EACH COMPRISING THE SAME COATING

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