CN112126612B - 一种大肠杆菌 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种大肠杆菌，属于生物工程技术领域。本发明采用多位点多拷贝的生物学技术手段，将L‑氨基酸氧化酶，葡萄糖脱氢酶和α‑羟基羧酸脱氢酶基因整合到大肠杆菌染色体，使大肠杆菌具有更好的生长特性，高密度培养的菌株比原始菌株最终量可提高35％以上。将所述大肠杆菌应用于以多巴为底物的反应中，制备得到的产物产量可以显著得到提升。

Description

一种大肠杆菌
技术领域
本发明涉及一种大肠杆菌，具体涉及染色体整合表达氨基酸氧化酶，葡萄糖脱氢酶和α-羟基羧酸脱氢酶的大肠杆菌，属于生物工程技术领域。
背景技术
L-氨基酸氧化酶广泛存在于细菌、真菌、哺乳动物细胞、蛇毒、昆虫毒素及藻类中(L-amino acid oxidase as biocatalyst:a dream too far？Appl.Microbiol.Biotechnol.2013,97:9323-41)。绝大部份L-氨基酸氧化酶氧化氨基酸时会产生过氧化氢从而对自身或环境中的细胞产生毒性。自然界中还存在一类不产过氧化氢的氨基酸氧化酶，这些酶来源于变形杆菌属(Proteus sp.)、普罗威登菌属(Providenciasp.)、摩根菌属(Morganella sp.)等。通过相关文献报道这些菌体中的氧化酶从将氨基酸脱氢生成对应酮酸后，电子经过膜呼吸链传递给细胞色素氧化酶，最后与氧结合生成水，这类酶也被称为L-氨基酸脱氢酶或氨基酸脱胺酶。
葡萄糖脱氢酶是短链乙醇脱氢酶家族的一员，在辅酶NAD(P)+等存在时能够催化β-D-葡萄糖转化成D-葡萄糖酸内酯，而反应生成的D-葡萄糖酸内酯会自发地进一步水解成葡萄糖酸。目前，葡萄糖脱氢酶按其辅酶种类不同可分为3种：(1)NAD(P)+依赖型(EC1.1.1.47)，含这类酶的微生物有Gluconobacter suboxydans,Haloferax mediterranei,Bacillus cereus,Bacillus megaterium,Bacillus subtilis等；(2)FAD+依赖型(EC1.1.99.10)，含这类酶的微生物有Aspergillus niger,Burkholderia cepacia等；(3)PQQ依赖型(EC 1.1.5.2)，含这类酶的微生物有Pseudomonas fluorescens,Acinetobactercalcoaceticus,Mythylobacterium extorquens等。FAD+依赖型的会产生过氧化氢损伤细胞、PQQ依赖型的效率较低，而NAD(P)+依赖型的葡萄糖脱氢酶活性高稳定性好通常为全细胞催化反应提供辅酶再生。
α-羟基羧酸脱氢酶是一类分布十分广泛的脱氢酶类，尤其是在乳酸菌中，其是乳酸菌将丙酮酸转化为乳酸的关键酶。根据其催化生成产物的旋光性，可以分为D-乳酸脱氢酶(EC：1.1.1.28)和L-乳酸脱氢酶(EC：1.1.1.27)；乳酸脱氢酶广泛的存在于多种生物体中，随着全基因测序的出现，发现在很多乳酸菌中，不止存在一种乳酸脱氢酶的基因，同时它们的氨基酸序列不同，酶学性质也不同，因此功能也有差异。乳酸脱氢酶广泛分布于乳酸杆菌，芽孢杆菌，芽孢乳杆菌以及明串珠菌属四个菌属；除此以外，还分布在肉杆菌属(Carnobacterium)、片球菌属(Pediococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、链球菌属(Streptococcus)、四联球菌属(Tetragenococcus)、漫游球菌属(Vagococcus)和魏斯氏菌属(Weissella)等。
目前利用L-氨基酸氧化酶，葡萄糖脱氢酶，α-羟基羧酸脱氢酶来构建的工程菌株通常采用质粒表达系统(Biosynthesis of D-danshensu from L-DOPA using engineeredEscherichia coli whole cells.Applied Microbiology and Biotechnology 103(15),6097-6105)，而质粒表达系统需要抗生素来维持质粒的稳定性和诱导剂来诱导基因的表达，昂贵的诱导剂增加了生产成本，抗生素和诱导剂的添加也增加了生产的复杂性。因此，亟需要解决目前存在的这些问题，从而提高大肠杆菌的应用性能，使之符合工业化生产的要求。
发明内容
本发明将L-氨基酸氧化酶，基于NAD(P)+依赖型的葡萄糖脱氢酶和α-羟基羧酸脱氢酶整合到最常用的蛋白表达宿主大肠杆菌上，从而改变大肠杆菌的生长特性，使之具有更强的环境适应能力，更好的应用特性。
本发明提供一种整合有氨基酸氧化酶，葡萄糖脱氢酶和α-羟基羧酸脱氢酶的大肠杆菌重组菌。
本发明的目的之一在于提供一种基因工程菌，所述基因工程菌整合了氨基酸氧化酶，葡萄糖脱氢酶和α-羟基羧酸脱氢酶的基因工程菌，是利用染色体整合技术多位点多拷贝组成型表达L-氨基酸氧化酶，葡萄糖脱氢酶和α-羟基羧酸脱氢酶的大肠杆菌，可使大肠杆菌具有更好的生长特性。
在一种实施方式中，在基因工程菌染色体的一个或多个位点上整合一个或多个拷贝数的氨基酸氧化酶，葡萄糖脱氢酶和α-羟基羧酸脱氢酶基因。
在一种实施方式中，所述染色体的一个或多个位点包括：dkgB、eaeH、lysO、bluF、tam、glsB、rcs、mntH、nupG、pitB、rbsA或pgi中的至少一处。
在一种实施方式中，所述L-氨基酸氧化酶为来自Proteus mirabilis ATCC 29906的L-氨基酸氧化酶(简写为pmaao)、来自Cosenzaea myxofaciens ATCC 19692的L-氨基酸氧化酶(简写为cmaao)。所述葡萄糖脱氢酶为来自Gluconobacter suboxydans ATCC 621的葡萄糖脱氢酶(简写为gsgdh)、来自Haloferax mediterranei ATCC 33500的葡萄糖脱氢酶(简写为hmgdh)。所述α-羟基羧酸脱氢酶为来自Lactobacillus plantarumATCC 14917的D型α-羟基羧酸脱氢酶(简写为ldhD)、来自Lactobacillus fermentum ATCC 14931的L型α-羟基羧酸脱氢酶(简写为ldhL)。
在一种实施方式中，L-氨基酸氧化酶的氨基酸序列如NCBI上登录号为WP_004244224.1或OAT30925.1所示的序列。葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列如NCBI上登录号为WP_041112217.1或AFK18021.2所示的序列。α-羟基羧酸脱氢酶的氨基酸序列如NCBI上登录号为WP_003643296.1或WP_035430779.1所示的序列。
在一种实施方式中，L-氨基酸氧化酶的核苷酸序列如NCBI上登录号为：NZ_GG668576的第1350390～1351805位，或登录号为：LXEN01000066的第20563～21963位所示。
在一种实施方式中，葡萄糖脱氢酶的核苷酸序列如NCBI上登录号为：NZ_CP004373.1的第2428736～2429536位，或登录号为CP001868.2的第262147～262932所示。
在一种实施方式中，α-羟基羧酸脱氢酶的核苷酸序列如NCBI上登录号为：NZ_GL379761的第533562～534560位所示，或是登录号NZ_GG669901的第45517～46470所示。
在一种实施方式中，所述大肠杆菌的宿主为E.coli BL21、E.coli JM109、E.coliDH5α或E.coli Top10。
在一种实施方式中，所述大肠杆菌的宿主为E.coli BL21。
在一种实施方式中，所述基因工程菌是在dkgB、eaeH、lysO、bluF、tam、glsB、rcs、mntH、nupG、pitB、rbsA或pgi位点上整合；所述dkgB位于染色体第229167～229970处；所述eaeH位于染色体第314357～315244处；所述lysO位于染色体第913958～914857处；所述bluF位于染色体第1214264～1215475处；所述tam位于染色体第1607346～1608104处；所述glsB位于染色体第1612325～1613251处；所述rcs位于染色体第2316177～2316827处；所述mntH位于染色体第2511468～2512706处；所述nupG位于染色体第3105714～3106970处；所述pitB位于染色体第3134872～3136371处；所述rbsA位于染色体第3933778～3935283处；所述pgi位于染色体第4233758～4235407处。
在一种实施方式中，所述基因工程菌是在基因组上rcsB处整合6个拷贝数的pmaao，gsgdh和ldhD，mntH处整合6个拷贝数的pmaao，gsgdh和ldhD，并在pgi处整合9个拷贝数的pmaao，gsgdh和ldhD。
在一种实施方式中，所述大肠杆菌是在基因组上rcsB处整合9个拷贝数的cmaao、hmgdh和ldhL，mntH处整合6个拷贝数的cmaao、hmgdh和ldhL，并在pgi处整合9个拷贝数的cmaao、hmgdh和ldhL。
在一种实施方式中，所述基因工程菌还表达其它目的基因或酶。
本发明的第二个目的在于提供一种所述基因工程菌的构建方法，是将编码L-氨基酸氧化酶，葡萄糖脱氢酶和α-羟基羧酸脱氢酶的基因整合在大肠杆菌BL21(DE3)的染色体上。
在一种实施方式中，所述整合是整合在下述任一位点：dkgB、eaeH、lysO、bluF、tam、glsB、rcs、mntH、nupG、pitB、rbsA、pgi。
在一种实施方式中，所述方法包括如下步骤：
(1)构建氨基酸氧化酶，葡萄糖脱氢酶和α-羟基羧酸脱氢酶基因整合框；所述整合框为：整合位点左臂-氨基酸氧化酶基因-葡萄糖脱氢酶基因-α-羟基羧酸脱氢酶基因-整合位点右臂；
(2)是步骤(1)构建的氨基酸氧化酶，葡萄糖脱氢酶和α-羟基羧酸脱氢酶基因整合框转化至大肠杆菌电转感受态细胞中；所述大肠杆菌为E.coli BL21、E.coli JM109、E.coli DH5α或E.coli Top10。
在一种实施方式中，氨基酸氧化酶基因，葡萄糖脱氢酶基因，α-羟基羧酸脱氢酶基因之间含有核糖体结合位点。
本发明的第四个目的是提供一种全细胞催化剂，所述全细胞催化剂包含所述基因工程菌。
在一种实施方式中，将所述基因工程菌接种于培养体系中，在于25℃培养16～24h后收集细胞，获得全细胞催化剂。
在一种实施方式中，所述培养体系为2×TY培养基、LB培养基或M9培养基。
本发明的第五个目的是提供一种生产丹参素或苯乳酸的方法，以用L-多巴或L-苯丙氨酸为底物，利用所述全细胞催化剂进行微生物转化。
在一种实施方式中，以在rcsB、mntH和pgi位点分别整合6个、6个和9个拷贝数的pmaao、gsgdh和ldhD的基因工程菌为全细胞催化剂，在以L-多巴为底物时，转化生成D-丹参素；在以L-苯丙氨酸为底物时，转化生成D-苯乳酸。
在一种实施方式中，以在rcsB、mntH和pgi位点分别整合9个、6个和6个拷贝数的cmaao、hmgdh和ldhL的基因工程菌为全细胞催化剂，在以L-多巴为底物时，转化生成L-丹参素；在以L-苯丙氨酸为底物时，转化生成L-苯乳酸。
在一种实施方式中，在含有终浓度为100～150mM的葡萄糖、底物浓度为50～150mM的反应体系中，加入终浓度为10～50g/L的基因工程菌的湿细胞，在30～35℃、pH 7.0～7.5，150～200rpm的条件下转化2～4h。
在一种实施方式中，在含有终浓度为150mM的葡萄糖、底物浓度为100mM的反应体系中，加入终浓度为50g/L的基因工程菌的湿细胞，在35℃、pH 7.5，200rpm的条件下转化3h。
本发明的第六个目的是提供所述的基因工程菌在食品、生物领域参与氨基酸为底物反应中的应用。
在一种实施方式中，所述应用是作为细胞催化剂参与全细胞催化反应。
在一种实施方式中，所述应用是以L-多巴或L-苯丙氨酸为底物生产D-丹参素或D-苯乳酸。
在一种实施方式中，所述应用是以L-多巴或L-苯丙氨酸为底物生产L-丹参素或L-苯乳酸。
本发明的第七个目的是提供所述全细胞催化剂或所述生产丹参素或苯乳酸的方法在食品、生物领域参与氨基酸为底物反应中的应用。
在一种实施方式中，所述应用是以L-多巴或L-苯丙氨酸为底物生产D-丹参素或D-苯乳酸。
在一种实施方式中，所述应用是以L-多巴或L-苯丙氨酸为底物生产L-丹参素或L-苯乳酸。
本发明的有益效果：本发明构建的大肠杆菌工程菌株将目的基因整合于染色体，不需要通过添加抗生素以维持菌株的质粒稳定性，减少了操作步骤和生产成本。且整合了氨基酸氧化酶，葡萄糖脱氢酶和α-羟基羧酸脱氢酶以后的菌株生长量高于原始大肠杆菌菌株，高密度培养的菌株比原始菌株最终量多了30％以上。将所述工程菌应用于D型丹参素或苯乳酸的生产，D型丹参素或苯乳酸产量分别可达98.14mM和97.83mM，同时也能够很好地生产L型丹参素或苯乳酸，L型丹参素或苯乳酸的产量分别可达96.22mM和97.28mM。
具体实施方式
本发明所涉及的菌株及质粒：
购自美国菌种保藏中心ATCC的Proteus mirabilis ATCC 29906、Cosenzaeamyxofaciens ATCC 19692，Gluconobacter suboxydans ATCC 621、Haloferaxmediterranei ATCC 33500、Lactobacillus plantarumATCC 14917、Lactobacillusfermentum ATCC 14931。购自Novagen的pETDuet-1、pKD3、PCP20质粒和TaKaRa的T-VectorpMD109(Simple)用于染色体整合质粒的构建。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
实施例1：染色体整合位点的筛选
1、将总序列长度为4.6Mbp的大肠杆菌BL21(DE3)的染色体分为六个区域，并在每个区域选择两个位点进行L-氨基酸氧化酶、葡萄糖脱氢酶和α-羟基羧酸脱氢酶的整合，然后对各位点整合有L-氨基酸氧化酶、葡萄糖脱氢酶和α-羟基羧酸脱氢酶的菌株进行活性测定，以此来确定最佳的整合位点。所分组的区域和位点分别为0～0.76Mbp(dkgB，eaeH)，0.76～1.53Mbp(lysO，bluF)，1.53～2.28Mbp(tam，glsB)，2.28～3.04Mbp(rcs，mntH)，3.04～3.8Mbp(nupG，pitB)，3.8～4.6Mbp(rbsA，pgi)。
(1)质粒的提取
质粒提取按照上海捷瑞公司的质粒小提试剂盒上的说明书进行操作。
(2)pIn-LA-cat-RA质粒的构建
在构建过程中使用引物被列于表1。用引物ApaI-EcoRV-cat(F)和cat-AflII-AvrII-XbaI(R)从pKD3质粒中扩增出氯霉素抗性基因。将扩增出的氯霉素抗性基因连接于T-Vector pMD19(Simple)载体，将质粒命名为pIn-cat。
以Escherichia coli BL21(DE3)基因组为模板，分别使用引物ApaI-SmaI-LA1(F)和LA1-EcoRV(R)，ApaI-SmaI-LA2(F)和LA2-EcoRV(R)，ApaI-SmaI-LA3(F)和LA3-EcoRV(R)，ApaI-SmaI-LA4(F)和LA4-EcoRV(R)，ApaI-SmaI-LA5(F)和LA5-EcoRV(R)，ApaI-SmaI-LA6(F)和LA6-EcoRV(R)，ApaI-SmaI-LA7(F)和LA7-EcoRV(R)，ApaI-SmaI-LA8(F)和LA8-EcoRV(R)，ApaI-SmaI-LA9(F)和LA9-EcoRV(R)，ApaI-SmaI-LA10(F)和LA10-EcoRV(R)，ApaI-SmaI-LA11(F)和LA11-EcoRV(R)，ApaI-SmaI-LA12(F)和LA12-EcoRV(R)扩增各整合位点左边1000bp的基因片段，扩增获得的基因片段分别被命名为LA1，LA2，LA3，LA4，LA5，LA6，LA7，LA8，LA9，LA10，LA11，LA12。以Escherichia coli BL21(DE3)基因组为模板，分别使用引物AvrII-RA1(F)和RA1-SmaI-XbaI(R)，AvrII-RA2(F)和RA2-SmaI-XbaI(R)，AvrII-RA3(F)和RA3-SmaI-XbaI(R)，AvrII-RA4(F)和RA4-SmaI-XbaI(R)，AvrII-RA5(F)和RA5-SmaI-XbaI(R)，AvrII-RA6(F)和RA6-SmaI-XbaI(R)，AvrII-RA7(F)和RA7-SmaI-XbaI(R)，AvrII-RA8(F)和RA8-SmaI-XbaI(R)，AvrII-RA9(F)和RA9-SmaI-XbaI(R)，AvrII-RA10(F)和RA10-SmaI-XbaI(R)，AvrII-RA11(F)和RA11-SmaI-XbaI(R)，AvrII-RA12(F)和RA12-SmaI-XbaI(R)扩增各整合位点左边1000bp的基因片段，扩增获得的基因片段被分别命名为RA1，RA2，RA3，RA4，RA5，RA6，RA7，RA8，RA9，RA10，RA11，RA12。将左边同源臂LA1～12和载体pIn-cat用ApaI和EcoRV内切酶进行酶切，然后分别将酶切后的LA1～12分别连接于酶切后的载体pIn-cat，所得的质粒分别命名为pIn-LA1-cat，pIn-LA2-cat，pIn-LA3-cat，pIn-LA4-cat，pIn-LA5-cat，pIn-LA6-cat，pIn-LA7-cat，pIn-LA8-cat，pIn-LA9-cat，pIn-LA10-cat，pIn-LA11-cat，pIn-LA12-cat。将后边的同源臂RA通过AvrII和XbaI酶切后分别连接于载体pIn-LA1-cat，pIn-LA2-cat，pIn-LA3-cat，pIn-LA4-cat，pIn-LA5-cat，pIn-LA6-cat，pIn-LA7-cat，pIn-LA8-cat，pIn-LA9-cat，pIn-LA10-cat，pIn-LA11-cat，pIn-LA12-cat的AvrII和XbaI位点之间，获得的质粒分别命名为pIn-LA1-cat-RA1，pIn-LA2-cat-RA2，pIn-LA3-cat-RA3，pIn-LA4-cat-RA4，pIn-LA5-cat-RA5，pIn-LA6-cat-RA6，pIn-LA7-cat-RA7，pIn-LA8-cat-RA8，pIn-LA9-cat-RA9，pIn-LA10-cat-RA10，pIn-LA11-cat-RA11，pIn-LA12-cat-RA12。
在实验操作过程中酶切体系为：10×cut buffer 3μl，DNA 4μl，内切酶各0.5μl，无菌水2μl共30μl。37℃水浴中切1h。将DNA片段克隆到质粒上，并转化到E.coli DH5α感受态细胞中。连接体系：10×DNA ligase buffer 2.5μl，DNA片段8μl，载体DNA 2μl，T4 DNAligase 1μl，无菌水11.5μl共25μl。16℃水浴下连接12h-16h。
表1引物名称与序列
2、不同位点处整合片段的获取
(1)质粒的提取
质粒提取按照上海捷瑞公司的质粒小提试剂盒上的说明书进行操作。
(2)整合质粒的构建
在构建过程中使用引物被列于表2。L-氨基酸氧化酶pmaao使用引物BamHI-pmaao(F)和pmaao-EcoRI(R)来扩增，然后连接于质粒pETDuet-1的BamHI和EcoRI位点处，获得的质粒被命名为pET-pmaao。带有rbs的葡萄糖脱氢酶gsgdh使用引物SacI-rbs-gsgdh(F)和gsgdh-HindIII(R)来扩增，然后连接于质粒pET-pmaao的SacI和HindIII位点处，获得的质粒被命名为pET-pmaao-gsgdh。α-羟基羧酸脱氢酶ldhD使用引物EcoRV-ldhD(F)和ldhD-KpnI(R)来扩增，然后连接于质粒pET-pmaao-gsgdh的EcoRV和KpnI位点处，获得的质粒被命名为pET-pmaao-gsgdh-ldhD。
(3)整合片段的获得
在构建过程中使用引物被列于表2。含有左臂、右臂、卡那抗生素基因、pmaao基因，gsgdh基因和ldhD基因的整合片段被获得,使用引物AflII-T7-pmaao-gsgdh-ldhD(F)和T7-pmaao-gsgdh-ldhD-AvrII(R)扩增pET-pmaao-gsgdh-ldhD，获得含有T7启动子，核糖体结合位点和T7终止子的pmaao(序列如NCBI Reference Sequence:WP_004244224.1)，gsgdh(序列如NCBI Reference Sequence:WP_041112217.1)和ldhD(序列如NCBI ReferenceSequence:WP_003643296.1)片段T7-rbs-pmaao-rbs-gsgdh-T7-rbs-ldhD-Tm，然后将T7-rbs-pmaao-rbs-gsgdh-T7-rbs-ldhD-Tm分别连接入质粒pIn-LA1-cat-RA1，pIn-LA2-cat-RA2，pIn-LA3-cat-RA3，pIn-LA4-cat-RA4，pIn-LA5-cat-RA5，pIn-LA6-cat-RA6，pIn-LA7-cat-RA7，pIn-LA8-cat-RA8，pIn-LA9-cat-RA9，pIn-LA10-cat-RA10，pIn-LA11-cat-RA11，pIn-LA12-cat-RA12的AflII和AvrII位点处。所得的质粒分别被命名为pIn-LA1-cat-pmaao-gsgdh-ldhD-RA1，pIn-LA2-cat-pmaao-gsgdh-ldhD-RA2，pIn-LA3-cat-pmaao-gsgdh-ldhD-RA3，pIn-LA4-cat-pmaao-gsgdh-ldhD-RA4，pIn-LA5-cat-pmaao-gsgdh-ldhD-RA5，pIn-LA6-cat-pmaao-gsgdh-ldhD-RA6，pIn-LA7-cat-pmaao-gsgdh-ldhD-RA7，pIn-LA8-cat-pmaao-gsgdh-ldhD-RA8，pIn-LA9-cat-pmaao-gsgdh-ldhD-RA9，pIn-LA10-cat-pmaao-gsgdh-ldhD-RA10，pIn-LA11-cat-pmaao-gsgdh-ldhD-RA11，pIn-LA12-cat-pmaao-gsgdh-ldhD-RA12。
表2引物名称与序列
3、L-氨基酸氧化酶，葡萄糖脱氢酶和α-羟基羧酸脱氢酶的整合
通过使用限制性内切酶SmaI分别对质粒pIn-LA1-cat-pmaao-gsgdh-ldhD-RA1，pIn-LA2-cat-pmaao-gsgdh-ldhD-RA2，pIn-LA3-cat-pmaao-gsgdh-ldhD-RA3，pIn-LA4-cat-pmaao-gsgdh-ldhD-RA4，pIn-LA5-cat-pmaao-gsgdh-ldhD-RA5，pIn-LA6-cat-pmaao-gsgdh-ldhD-RA6，pIn-LA7-cat-pmaao-gsgdh-ldhD-RA7，pIn-LA8-cat-pmaao-gsgdh-ldhD-RA8，pIn-LA9-cat-pmaao-gsgdh-ldhD-RA9，pIn-LA10-cat-pmaao-gsgdh-ldhD-RA10，pIn-LA11-cat-pmaao-gsgdh-ldhD-RA11，pIn-LA12-cat-pmaao-gsgdh-ldhD-RA12进行酶切处理。然后获得含有左臂、右臂、卡那抗生素基因、pmaao基因、gsgdh基因和ldhD基因的整合片段。然后通过电转的方式将该整合片段转入制备好的大肠杆菌电转感受态细胞中进行λ-Red同源重组，然后进行阳性菌株的筛选及菌落PCR验证。通过37℃过夜培养的方式来移除温度敏感型的pKD46质粒。最终得到如下菌株：E.coli BL21(dkgB)，E.coli BL21(eaeH)，E.coli BL21(lysO)，E.coli BL21(bluF)，E.coli BL21(tam)，E.coli BL21(glsB)，E.coliBL21(rcsB)，E.coli BL21(mntH)，E.coli BL21(nupG)，E.coli BL21(pitB)，E.coli BL21(rbsA)和E.coli BL21(pgi)。
4、不同位点整合pmaao、gsgdh和ldhD基因的菌株丹参素产量测定
将E.coli BL21染色体不同位点整合pmaao、gsgdh和ldhD。将菌株接种于试管中过夜培养，然后以1％的接种量接种于50mL新鲜的LB培养基中，将其放入震荡摇床，在25℃、200转条件下培养24小时。24小时后，4℃、8000转离心10min，然后收集细胞。以50mM、pH7.5的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠溶液作为反应的缓冲液，全细胞催化反应体系为：50g/L湿细胞、35℃、3g/L L-多巴，转化时间为5h。转化后，通过高效液相色谱法(HPLC)测定丹参素产量，丹参素产量如表3所示。
表3各位点整合菌株丹参素产量及菌体湿重
如表3所示，E.coli BL21中的rcsB，mntH，pgi处整合有L-氨基酸氧化酶、葡萄糖脱氢酶和α-羟基羧酸脱氢酶的菌株转化产生的丹参素量明显高于其他菌株，而且整合有L-氨基酸氧化酶、葡萄糖脱氢酶和α-羟基羧酸脱氢酶的菌株比原始的E.coli BL21菌株生长的更好。
5、大肠杆菌电转感受态的制备
(1)接种已经导入pKD46的E.coli BL21(DE3)于含有20mL LB培养基的50mL摇瓶中，25℃、200rpm/min培养过夜。
(2)按1％接种量接种于50mL LB培养基中，25℃培养至OD600约0.15(约2～3h)，向培养基中加入500μL 10M的L-阿拉伯糖，继续25℃培养至OD600约0.6。
(3)将菌液转移到50mL预冷的离心管中，冰上放置5min，5000rpm/min、4℃离心5min。
(4)弃上清，加入10mL预冷的去离子水，使菌体悬浮，5000rpm/min、4℃离心5min。
(5)弃上清，加入10mL预冷的10％甘油，使菌体悬浮，冰上放置5min，5000rpm/min、4℃离心5min，重复2次。
(6)弃上清，加入1.5mL预冷的10％甘油，轻轻悬浮菌体，然后100μL分装到1.5mL离心管中，-80℃冰箱保藏备用。
6、电转转化
步骤：
(1)在将整合或敲除基因盒分别加入100μL导入pKD46的BL21(DE3)感受态离心管中，轻混匀，冰浴10min。
(2)将混合后的溶液放入电转杯电击转化：转化的电压为1.8KV，电转化时间在4.5～6.0ms之间。
(3)迅速向电击杯中加入1mL SOC培养基，轻轻吹打混匀，转移到无菌的1.5mL EP管中，30℃恒温水浴摇床200rpm/min，复苏2～3小时。30℃倒置培养16～20小时。
(4)挑取阳性克隆并通过测序验证。
实施例2
本实施例为在所筛选的最佳整合位点rcsB处整合不同组合的L-氨基酸氧化酶(pmaao，cmaao)、葡萄糖脱氢酶(gsgdh，hmgdh)和α-羟基羧酸脱氢酶(ldhD，ldhL)，将不同组合的整合菌株接种于试管中过夜培养，然后以1％的接种量接种于50mL新鲜的LB培养基中，将其放入震荡摇床，在25℃、200转条件下培养24小时。24小时后，4℃、8000转离心10min，然后收集细胞。以50mM、pH7.5的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠溶液作为反应的缓冲液，全细胞催化反应体系为：50g/L湿细胞、35℃、3g/L L-多巴，转化时间为5h。转化后，通过高效液相色谱法(HPLC)测定丹参素产量。丹参素产量如表4所示。
表4不同基因组合菌株丹参素产量及菌体湿重
如表4所示，E.coli BL21中的rcsB处整合有L-氨基酸氧化酶pmaao，葡萄糖脱氢酶gsgdh和α-羟基羧酸脱氢酶ldhD的菌株转化产生的D-丹参素量明显高于其他产D-丹参素的菌株，而且菌体湿重也略高于同条件下的其他产D-丹参素的菌株。E.coli BL21中的rcsB处整合有L-氨基酸氧化酶cmaao，葡萄糖脱氢酶hmgdh和α-羟基羧酸脱氢酶ldhL的菌株转化产生的L-丹参素量明显高于其他产L-丹参素的菌株，而且菌体湿重也略高于同条件下的其他产L-丹参素的菌株。
实施例3
(1)本实施例为在所筛选的最佳整合位点rcsB，mntH，pgi多拷贝整合L-氨基酸氧化酶pmaao、葡萄糖脱氢酶gsgdh和α-羟基羧酸脱氢酶ldhD，并测试多位点多拷贝整合pmaao、gsgdh和ldhD后菌株转化L-多巴生成丹参素的产量。
依次在实施例1所筛选的位点处整合不同拷贝数的基因，多拷贝整合按照FLP重组法(rapid and reliable strategy for chromosomal integration of gene(s)withmultiple copies.Scientific Reports 2015,5.)。将E.coli BL21整合pmaao、gsgdh和ldhD不同拷贝数后的菌株接种于试管中过夜培养，然后以1％的接种量接种于50mL新鲜的LB培养基中，将其放入震荡摇床，在25℃、200转条件下培养24小时。24小时后，4℃、8000转离心10min，然后收集细胞。以50mM、pH7.5的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠溶液作为反应的缓冲液，全细胞催化反应体系为：10g/L湿细胞、35℃、3g/L L-多巴，转化时间为2h。转化后，通过高效液相色谱法(HPLC)测定丹参素产量。丹参素产量如表5所示。
表5各位点整合pmaao、gsgdh和ldhD拷贝数及整合菌株丹参素产量
注：“-”表示该位点不整合表达pmaao、gsgdh和ldhD基因。
如表5所示，E.coli BL2.9在rcsB处整合了6个拷贝数的pmaao、gsgdh和ldhD，mntH处整合了6个拷贝数的pmaao、gsgdh和ldhD，pgi处整合了9个拷贝数的pmaao、gsgdh和ldhD，丹参素的产量达1.96g/L。
(2)基因cmaao、hmgdh、ldhL在rcsB位点处进行多位点多拷贝的整合实验。
表6各位点整合cmaao、hmgdh和ldhL拷贝数及整合菌株丹参素产量
如表6所示，E.coli BL3.10在rcsB处整合了9个拷贝数的cmaao、hmgdh和ldhL，mntH处整合了6个拷贝数的cmaao、hmgdh和ldhL，pgi处整合了9个拷贝数的cmaao、hmgdh和ldhL，丹参素的产量达1.85g/L。
实施例4：菌体生长情况比较
将实施例3中构建的E.coli BL2.9菌株接种于试管中过夜培养，然后以1％的接种量接种于50mL新鲜的LB、2×YT(上海索莱宝)和M9培养基中，将其放入震荡摇床，在25℃、200rpm条件下培养24小时。24小时后，4℃、8000转离心10min，然后收集细胞。菌体的湿重如表7所示。
表7摇瓶培养后菌体湿重
由表7可以看出，整合菌体在2×TY培养基的生长情况最好，其次是LB培养基，最后是M9培养基。染色体整合L-氨基酸氧化酶之后的菌株在各培养基中的生长情况均优于原始菌株E.col BL21(DE3)。
实施例5：高密度培养比较
以甘油为底物和E.coli BL2.9作为出发菌株在5升发酵罐中进行高密度培养，培养基组成如文献所示(Simple fed-batch technique for high cell densitycultivation of Escherichia coli.Journal of Biotechnology 1995,39:59-65)，在25℃发酵培养24h后，各菌株的最终菌体量如表8所示。
表8不同整合型菌株菌体密度比较
菌株 菌体湿重(g/L)
E.coli BL2.9 146.31
E.coli BL3.10 137.74
E.col BL21(DE3) 101.53
由表8可以明显看出，使用营养丰富的培养基在5升发酵罐中进行高密度培养后，菌体相较于实施例4中的普通培养基在摇瓶中进行培养有了极大的提升，整合有pmaao、bsgdh和ldhD后的菌株比E.col BL21(DE3)菌株有更高的菌体湿重。
实施例6：不同大肠杆菌出发菌的比较
分别在BL21，JM109、DH5α、Top10大肠杆菌中进行多拷贝的pmaao、gsgdh和ldhD整合，即分别在大肠杆菌BL21，JM109、DH5α、Top10的染色体进行整合，分别为：在glsB处整合6个拷贝数的pmaao、gsgdh和ldhD，nupG处整合6个拷贝数的pmaao、gsgdh和ldhD，并在pitB处整合9个拷贝数的pmaao、gsgdh和ldhD。使用LB(胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L)培养基在25℃条件下200rpm培养24h。将整合pmaao、gsgdh和ldhD不同拷贝数后的菌株接种于试管中过夜培养，然后以1％的接种量接种于50mL新鲜的LB培养基中，将其放入震荡摇床，在25℃、200转条件下培养24小时。24小时后，测定最终湿菌体的量。然后4℃、8000转离心10min，收集细胞。以50mM、pH7.5的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠溶液作为反应的缓冲液，全细胞催化5ml反应体系为：10g/L湿细胞、35℃、3g/L L-多巴，转化时间为2h。转化后，丹参素产量如表9所示。
表9不同整合pmaao、gsgdh和ldhD宿主菌株的湿菌体量及丹参素产量
宿主菌株 OD600 丹参素(g/L)
BL21 3.96 2.04
JM109 3.42 1.65
DH5α 3.64 1.87
Top10 3.88 1.55
实施例7：整合有L-氨基酸氧化酶，葡萄糖脱氢酶和α-羟基羧酸脱氢酶菌株的应用
(1)将E.coli BL2.9细胞作为全细胞催化剂，然后以L-多巴或L-苯丙氨酸作为底物进行全细胞转化。
细胞的制备：将E.coli BL2.9菌株接种于试管中过夜培养，然后以1mL/100mL的接种量接种于50mL新鲜的LB培养基中，将其放入震荡摇床，在25℃、200转条件下培养24小时。24小时后，4℃、8000转离心10min，然后收集细胞。
全细胞催化反应体系为：终浓度为50g/L的湿细胞、35℃、100mM L-多巴(转化生成D-丹参素)或L-苯丙氨酸(转化生成D-苯乳酸)、150mM葡萄糖、pH7.5，200rpm的条件下转化3h。转化后测定D-丹参素或D-苯乳酸的浓度(如表10所示)。
表10全细胞生物催化后产物产量
底物 产物产量(mM)
L-多巴 98.14
L-苯丙氨酸 97.83
由表10可以看出，该菌株能够很好的生产D-丹参素和D-苯乳酸。
(2)将E.coli BL3.10细胞作为全细胞催化剂，然后以L-多巴或L-苯丙氨酸作为底物进行全细胞转化。
细胞的制备：将E.coli BL3.10菌株接种于试管中过夜培养，然后以1％的接种量接种于50mL新鲜的LB培养基中，将其放入震荡摇床，在25℃、200转条件下培养24小时。24小时后，4℃、8000转离心10min，然后收集细胞。
全细胞催化反应体系为：终浓度为50g/L的湿细胞、35℃、100mM的L-多巴(转化生成L-丹参素)或L-苯丙氨酸(转化生成L-苯乳酸)、终浓度为150mM的葡萄糖、pH 7.5，200rpm的条件下转化3h。转化后测定L-丹参素或L-苯乳酸的浓度(如表11所示)。
表11全细胞生物催化后产物产量
底物 产物产量(mM)
L-多巴 96.22
L-苯丙氨酸 97.28
由表11可以看出，该菌株能够很好的生产L-丹参素和L-苯乳酸。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 陕西鸿道生物分析科学技术研究院有限公司
<120> 一种大肠杆菌
<130> BAA200969A
<160> 58
<170> PatentIn version 3.3
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<213> 人工序列
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
gccctaggtg ccctaacact gctgattctt c 31
<210> 16
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
gccccgggtc tagataacaa tccagggtaa tgggtg 36
<210> 17
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
gcgggccccc cggggatgta ttaatgtgta cgcgcggc 38
<210> 18
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
gcgatatctt ttttactccc gtcagcgcg 29
<210> 19
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
gccctaggat atcacgtcag ctggtaatga cg 32
<210> 20
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
gccccgggtc tagagtaggt aatttgtaag tagcgtc 37
<210> 21
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
gcgggccccc cgggtgcagt ctctcgatcc actcttc 37
<210> 22
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
gcgatatcac agtcagatgt tgtgtctgtt tc 32
<210> 23
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
gccctaggtc ttgcaggtaa cggctactta c 31
<210> 24
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
gccccgggtc tagatttcta ctcctggacc gcaggtctg 39
<210> 25
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
gcgggccccc cgggcgcggc gatcgcgatg ccttacg 37
<210> 26
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
gcgatatcgt aataggctac cttgctacag c 31
<210> 27
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
gccctaggtc acctgtaggc cagataagac gcg 33
<210> 28
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
gccccgggtc tagatttacc gtgcgtattc cgttgtac 38
<210> 29
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
gcgggccccc cgggttgaat gagcgtcgca tctggcac 38
<210> 30
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
gcgatatctg tttaaagggc tggatgagat g 31
<210> 31
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
gccctaggtc ttcactggca tcaacacggt aag 33
<210> 32
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
gccccgggtc tagacttgtg cctctaaaac atagcc 36
<210> 33
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
gcgggccccc cgggacctgc cgcgcatttg cgccgggc 38
<210> 34
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
gcgatatcgt taatttcctc acatcgtgat gc 32
<210> 35
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
gccctaggtt acgcaaagaa aaacgggtcg cc 32
<210> 36
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
gccccgggtc tagacactgg atgttaacgc caaaattc 38
<210> 37
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
gcgggccccc cgggccttcc tgaaaatgcc cggtcc 36
<210> 38
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
gcgatatcgt cgatttacct gaaccatcac 30
<210> 39
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
gccctaggat gcaggacaaa gatatcgagg 30
<210> 40
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
gccccgggtc tagatatatt agattacgcc attttg 36
<210> 41
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
gcgggccccc cgggcctttg cgctgatgca taacc 35
<210> 42
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
gcgatatcga cggcctcaga acgtcacgcc 30
<210> 43
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
gccctaggaa aaatgacaac ccagactgtc tc 32
<210> 44
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
gccccgggtc tagagttcat attcaagatg tcctgtag 38
<210> 45
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
gcgggccccc cgggatatct ggctctgcac gaccaaatc 39
<210> 46
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
gcgatatcta gcaatactct tctgattttg ag 32
<210> 47
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
gccctaggtc atcgtcgata tgtaggccgg 30
<210> 48
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
gccccgggtc tagatagggc atattttgaa tatcatc 37
<210> 49
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 49
gcgggcccga tatcgccatg gtccatatga atatcctc 38
<210> 50
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 50
gccttaagcc taggtctaga gattgcagca ttacacgtct tgag 44
<210> 51
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 51
gcggatccat gaatatttct cgccgtaaac 30
<210> 52
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 52
gcgaattctt acttcttgaa acggtcaagt g 31
<210> 53
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 53
gcgagctcaa ggagatatac catgcctgcc ccttacaaag acc 43
<210> 54
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 54
gcaagctttt acgaggacca gttgttttcg 30
<210> 55
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 55
gcgatatcat gacactattt agagacgatc tc 32
<210> 56
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 56
gcggtacctt agttgataca gttagcaggt tc 32
<210> 57
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 57
gccttaaggc gtccggcgta gaggatcgag atc 33
<210> 58
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 58
gccctaggca ttcgccaatc cggatatagt tcc 33

Claims (8)

1.一种基因工程菌，其特征在于，在大肠杆菌染色体的rcsB、mntH、pgi位点上整合3~12个拷贝数的L-氨基酸氧化酶，葡萄糖脱氢酶和α-羟基羧酸脱氢酶基因；所述rcsB位于染色体的2316177~2316827处；所述L-氨基酸氧化酶来源于Proteus mirabilis ATCC 29906或Cosenzaea myxofaciens ATCC 19692；所述葡萄糖脱氢酶来源于Gluconobacter suboxydans ATCC 621或Haloferax mediterranei ATCC 33500的葡萄糖脱氢酶；所述α-羟基羧酸脱氢酶为来自Lactobacillus plantarum ATCC 14917的D型α-羟基羧酸脱氢酶、来自Lactobacillus fermentum ATCC 14931的L型α-羟基羧酸脱氢酶；所述整合是通过整合框整合所述L-氨基酸氧化酶，葡萄糖脱氢酶和α-羟基羧酸脱氢酶基因；所述整合框包括：整合位点左臂- L-氨基酸氧化酶基因、葡萄糖脱氢酶基因、α-羟基羧酸脱氢酶基因-整合位点右臂。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌的宿主为E. coliBL21、E. coli JM109、E. coli DH5α或E. coli Top10。
3.根据权利要求1或2所述的基因工程菌，其特征在于，还表达L-氨基酸氧化酶、葡萄糖脱氢酶和α-羟基羧酸脱氢酶参与的代谢途径中相关的基因。
4.一种全细胞催化剂，其特征在于，含有权利要求1~3任一所述的基因工程菌；将所述基因工程菌接种于培养体系中，于22~30℃培养不少于16 h后，收集得到全细胞催化剂。
5.一种生产丹参素或苯乳酸的方法，其特征在于，
以L-多巴为底物，应用权利要求4所述的全细胞催化剂进行微生物转化制备得到丹参素；
以L-苯丙氨酸为底物，应用权利要求4所述的全细胞催化剂进行微生物转化制备得到苯乳酸。
6.一种构建权利要求1~3任一所述基因工程菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）构建L-氨基酸氧化酶，葡萄糖脱氢酶和α-羟基羧酸脱氢酶基因整合框；所述整合框为：整合位点左臂- L-氨基酸氧化酶基因，葡萄糖脱氢酶基因，α-羟基羧酸脱氢酶基因-整合位点右臂；所述整合位点为rcsB、mntH、pgi；
（2）将步骤（1）构建的L-氨基酸氧化酶，葡萄糖脱氢酶和α-羟基羧酸脱氢酶基因整合框转化至大肠杆菌电转感受态细胞中。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述大肠杆菌为E. coli BL21、E. coli JM109、E. coli DH5α或E. coli Top10。
8.权利要求1~3任一所述基因工程菌，或权利要求4所述全细胞催化剂在食品、生物领域参与氨基酸为底物反应中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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