CN118048332B - 一种高催化性能葡萄糖脱氢酶突变体及在nmnh合成中的应用 - Google Patents
一种高催化性能葡萄糖脱氢酶突变体及在nmnh合成中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN118048332B CN118048332B CN202410452498.9A CN202410452498A CN118048332B CN 118048332 B CN118048332 B CN 118048332B CN 202410452498 A CN202410452498 A CN 202410452498A CN 118048332 B CN118048332 B CN 118048332B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- nicotinamide mononucleotide
- beta
- reduced
- whole cell
- mutant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108010050375 Glucose 1-Dehydrogenase Proteins 0.000 title claims abstract description 30
- XQHMUSRSLNRVGA-TURQNECASA-N NMNH Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O1 XQHMUSRSLNRVGA-TURQNECASA-N 0.000 title description 19
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 title description 13
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 82
- FZAQROFXYZPAKI-UHFFFAOYSA-N anthracene-2-sulfonyl chloride Chemical compound C1=CC=CC2=CC3=CC(S(=O)(=O)Cl)=CC=C3C=C21 FZAQROFXYZPAKI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 42
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims abstract description 18
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 17
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 claims abstract description 17
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 17
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 14
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 14
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 4
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 42
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 20
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 18
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 16
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 13
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 4
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims 1
- 102200068503 rs121964997 Human genes 0.000 abstract description 17
- 102220023191 rs387907511 Human genes 0.000 abstract description 16
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 abstract description 10
- 230000035772 mutation Effects 0.000 abstract description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 4
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 abstract description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 43
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 9
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 7
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-O NAD(+) Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-O 0.000 description 5
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 4
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 229950006238 nadide Drugs 0.000 description 4
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 4
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 4
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 108090000698 Formate Dehydrogenases Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 108010067588 nucleotide pyrophosphatase Proteins 0.000 description 3
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 240000000220 Panda oleosa Species 0.000 description 2
- 235000016496 Panda oleosa Nutrition 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000301512 Bacillus cereus ATCC 14579 Species 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 229910021380 Manganese Chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L Manganese chloride Chemical compound Cl[Mn]Cl GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 208000012839 conversion disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 239000011565 manganese chloride Substances 0.000 description 1
- 235000002867 manganese chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 239000002351 wastewater Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Abstract
本发明提出一种高催化性能葡萄糖脱氢酶突变体和一种还原型β‑烟酰胺单核苷酸的制备方法。对葡萄糖脱氢酶的定点突变为R41Q/V73A/A98K/I195R。将突变体质粒转移至大肠杆菌获得重组工程菌E.coli BL21(DE3)‑BcGDH（R41Q/V73A/A98K/I195R），重组工程菌通过发酵进行蛋白表达，获得含有目标蛋白的重组工程菌全细胞，利用重组工程菌全细胞悬浮液或对应全细胞量破碎所得粗酶液催化将β‑烟酰胺单核苷酸转化成还原型β‑烟酰胺单核苷酸。优化催化工艺，最佳反应工艺为：10 g/L全细胞悬浮液、400 mMβ‑烟酰胺单核苷酸、480 mM葡萄糖、100 mM甘氨酸/氢氧化钠，反应温度为30℃，pH值为9.0±0.5，实现了2 h内β‑烟酰胺单核苷酸转化率达到100%的高效催化。
Description
技术领域
本申请涉及基因突变及酶催化技术领域，尤其是涉及脱氢酶突变体应用于还原型β-烟酰胺单核苷酸（NMNH）合成领域。
背景技术
还原型β-烟酰胺单核苷酸（简称NMNH），是β-烟酰胺单核苷酸（简称NMN）的还原形式，最新研究文献显示，NMNH提升烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（简称NAD+）水平速度更快，浓度更高，平均是NMN的5倍。目前其合成路线主要分为酶法和化学法合成。化学合成对设备的要求较高，生产废水对环境不友好，反应转化率不高，成本高。相对于化学法合成，生物酶法合成具有低成本，高产量的优点，符合绿色发展理念。
目前已报道合成NMNH的主要途径为：（1）化学法合成NMNH：NMN溶液加入10%氨水（v/v）、1.2当量二氧硫脲，在40 ℃、pH 9.0 的条件下搅拌反应1 h，NMN转化率大于等于90%。（2）酶法合成NMNH：1）以5 mM 还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）为原料，加入MnCl2和NADH焦磷酸酶，在pH 8.0、37℃条件下搅拌反应45 min，NADH的转化率为70%左右；2）以100 mM NMN和200 mM甲酸为原料，加入甲酸脱氢酶，在pH 7.0-8.0、30 ℃条件下反应4 h，NMN转化率最高可为69.8%。
酶法合成NMNH中，一方面酶法合成途径一所用到原料NADH价格昂贵且不稳定，不易储存，转化效率低；另一方面这两种酶法合成所用酶可耐碱性能力不强，反应催化pH较低，该条件下NMNH极不稳定，会快速降解，未有更高活性、高稳定性且耐较高pH的用于合成NMNH的脱氢酶报道。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种高催化性能葡萄糖脱氢酶突变体和一种还原型β-烟酰胺单核苷酸的制备方法。
一种高催化性能葡萄糖脱氢酶突变体，与葡萄糖脱氢酶亲本的氨基酸相比，突变体的突变为R41Q/V73A/A98K/I195R。原催化NAD(P)+还原为NAD(P)H的野生型葡萄糖脱氢酶经过突变改造后，可高效催化还原β-烟酰胺单核苷酸为还原型β-烟酰胺单核苷酸。
一种还原型β-烟酰胺单核苷酸的制备方法，用葡萄糖脱氢酶突变体催化β-烟酰胺单核苷酸转化成还原型β-烟酰胺单核苷酸。
优选地，以β-烟酰胺单核苷酸和葡萄糖为底物，Tris或者甘氨酸为缓冲液，将含葡萄糖脱氢酶突变体基因的质粒转移至大肠杆菌获得重组工程菌，重组工程菌通过发酵进行蛋白表达，获得含有目标蛋白的重组工程菌全细胞悬浮液，利用重组工程菌的全细胞悬浮液或对应全细胞量破碎所得粗酶液，催化将β-烟酰胺单核苷酸转化成还原型β-烟酰胺单核苷酸。
粗酶液催化效果与全细胞催化效果差异小，但从储存稳定性、便利性及制备工序角度考虑，全细胞催化相较于粗酶液催化更优。
优选地，pH值为8.0~9.5，最佳pH值为9.0。
由于还原型β-烟酰胺单核苷酸在pH 较高的条件下（pH 9.0-10.0）稳定性更高，相比于现有技术的甲酸脱氢酶和NADH焦磷酸酶需要在pH为8.0的低pH值条件催化，本发明所用葡萄糖脱氢酶可在高的pH值下实现高效催化，进一步增加了还原型β-烟酰胺单核苷酸的稳定性，减少了还原型β-烟酰胺单核苷酸的降解，减少了反应液中大量降解副产物的引入，也为后期工业化减轻了纯化负担。
优选地，反应温度为25℃~40 ℃，最佳反应温度为30 ℃。
优选地，底物β-烟酰胺单核苷酸浓度为200~1000 mM，最佳β-烟酰胺单核苷酸底物浓度为1000 mM。
优选地，底物葡萄糖投料量相对于β-烟酰胺单核苷酸为1/1.0~1.5当量，葡萄糖:β-烟酰胺单核苷酸为1.2:1的投料比为最优投料比。
优选地，重组工程菌的全细胞悬浮液为5~10 g/L，最佳重组工程菌的全细胞悬浮液为10 g/L。
优选地，10 g/L全细胞悬浮液、400 mM β-烟酰胺单核苷酸、480 mM葡萄糖、100 mM甘氨酸/氢氧化钠，反应温度为30 ℃，pH值为9.0 ± 0.5。实现了2 h内β-烟酰胺单核苷酸转化率达到100 %的高效催化。
经过一系列工艺优化后，以低全细胞用量，于高pH下催化高浓度β-烟酰胺单核苷酸反应，实现2 h内高达100% β-烟酰胺单核苷酸转化率。所用最低全细胞用量可为8 g/L，最高β-烟酰胺单核苷酸浓度可为1000 mM（334 g/L），反应最适pH为9.0。
一种重组工程菌，其特征在于，将突变体转化至E.coli BL21(DE3)获得重组工程菌。
本发明以野生型葡萄糖脱氢酶DNA序列导入大肠杆菌表达质粒载体pET-28a (+)上，并利用定点突变PCR方法对野生型基因序列进行突变，通过多轮定点突变PCR获得4个位点突变（R41Q、V73A、A98K、I195R）的葡萄糖脱氢酶质粒，并将其转化入BL21(DE3)菌株中，获得重组工程菌。
有益效果
1、与葡萄糖脱氢酶亲本的相比，突变位点为R41Q/V73A/A98K/I195R，获得葡萄糖脱氢酶突变体。
2、原催化NAD(P)+还原为NAD(P)H的野生型葡萄糖脱氢酶经过突变改造后，可高效催化还原NMN为NMNH，并经过一系列工艺优化后，以低全细胞用量，实现2 h内高达100% NMN转化率。所用最低全细胞用量可为8 g/L，最高NMN浓度可为1000 mM(334 g/L)，反应最适pH为9.0。
3、由于NMNH在pH 较高的条件下（pH 9.0-10.0）稳定性更高，相比于现有的甲酸脱氢酶和NADH焦磷酸酶需要在pH为8.0的低pH值条件催化，本发明所用葡萄糖脱氢酶可在如此高的pH值下，进一步增加了NMNH的稳定性，减少了NMNH的降解，减少了反应液中大量降解副产物的引入，也为后期工业化减轻了纯化负担。
4、本发明所用的原料稳定，价格较低廉，且可直接用全细胞进行催化反应，全细胞用量低，相较于现有技术的NMNH合成方法，生产成本低，具有很大的工业化应用潜力。
附图说明
图1 NMN反应0 h示例图-260 nm。
图2 NMNH标品示例图-340 nm。
图3结束反应2 h后测试结果示例图-260 nm。
图4结束反应2 h后测试结果示例图-340 nm。
具体实施方式
为了使本发明容易理解，下面将结合具体实施例，详细说明本发明。但在详细描述本发明前，应当理解本发明不限于描述的具体实施方式。还应当理解，本文中使用的术语仅为了描述具体实施方式，而并不表示限制性的。
除非另有定义，本文中使用的所有术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。虽然与本文中描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料也可以在本发明的实施中使用，但是现在描述了优选的方法和材料。
TB培养基：酵母粉23.6 g/L，胰蛋白胨11.8 g/L，磷酸氢二钾9.4 g/L，磷酸二氢钾2.2 g/L，甘油4 mL/L。
LB培养基：蛋白胨10 g/L，氯化钠10 g/L，酵母提取物5 g/L。
PCR反应体系：含MgSO4 的10x高保真缓冲液 5μL、10 mM dNTP 混合液 1μL、上游引物溶液 1μL、下游引物溶液 1μL、模板质粒溶液 1μL、高保真DNA聚合酶，2.5 U/µl 1.2μL、ddH2O 39.8μL。
PCR设置程序：初始变性95℃ 3 min，变性95℃ 30 s，退火60℃ 1 min，延伸68℃12 min，18 cycles，最终延伸68℃ 10 min，保存12℃。
实施例1 葡萄糖脱氢酶定点突变
（1）采用全质粒定点突变PCR的方法对野生型葡萄糖脱氢酶（氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示）进行突变，以带有Bacillus cereus ATCC 14579来源野生型葡萄糖脱氢酶基因的质粒pET-28a(+)-BcGDH为模板，以R41Q_F/R41Q_R为引物对进行第一轮定点突变PCR，设计引物如下：
R41Q_F：’- GTGATTAACTATCGCAGCCAGGAAAGCGAAGCGAACG -3’
R41Q_R：’- CGTTCGCTTCGCTTTCCTGGCTGCGATAGTTAATCAC -3’
PCR完成后，加入1 μL DPn I酶充分混匀后，37 ℃温育1 h消解模板质粒，随后向DH5α感受态细胞中加入5 μL PCR反应液，冰上静置30 min，42℃水浴锅中热激60 s，立即放回冰上冷却3 min，在超净工作台中加入500 μL无抗LB培养基培养（37℃，220 rpm，60min），菌液离心（12000rpm，5 min），弃上清500 μL，剩余100 μL用枪头吹吸重悬细胞，在超净工作台中用移液枪移取100 μL菌液加入到含有Kana抗性的LB固体培养基上，用无菌涂布棒轻轻涂匀，待菌液被吸收后，将平板倒置，于37℃过夜培养，每个平板各挑取单个菌落分别接种于含有50 μg/L Kana的5 mL LB培养基中培养（37 ℃，220 rpm，6 h）后送样测序，测序完成后服务公司返回正确突变质粒pET-28a(+)-BcGDH（R41Q）。
（2）以pET-28a(+)-BcGDH（R41Q）为模板质粒，以V73A_F/V73A_R为引物对进行第二轮定点突变，设计引物如下：
V73A_F：5’-GTGGAAAGCGATGTGGCGAACCTGATTC -3’
V73A_R：5’-GCCACATCGCTTTCCACGGTCACATC -3’
其余步骤如（1），获得突变质粒pET-28a(+)-BcGDH（R41Q//V73A）。
（3）以pET-28a(+)-BcGDH（R41Q/V73A）为模板质粒，以A98K_F/A98K_R为引物对进行第三轮定点突变，设计引物如下：
A98K_F：’-CAACGCGGGCATTGAAAACAAAGTGCCGAGCCATGAAATG -3’
A98K_R：’-CATTTCATGGCTCGGCACTTTGTTTTCAATGCCCGCGTTG-3’
其余步骤如（1），获得突变质粒pET-28a(+)-BcGDH（R41Q/V73A/A98K）。
（4）以pET-28a(+)-BcGDH（R41Q/V73A/A98K）为模板质粒，以I195R_F/I195R_R为引物对进行第四轮定点突变，设计引物如下：
I195R_F：’-GATTAACACCCCGCGCAACGCGGAAAAATTTGCCGATC -3’
I195R_R：’-GATCGGCAAATTTTTCCGCGTTGCGCGGGGTGTTAATC -3’
其余步骤如（1），获得突变质粒pET-28a(+)-BcGDH（R41Q/V73A/A98K/I195R），突变后葡萄糖脱氢酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
实施2 重组工程菌构建
将突变质粒pET-28a(+)-BcGDH（R41Q/V73A/A98K/I195R）转化至E.coli BL21(DE3)获得重组工程菌E.coli BL21(DE3)-BcGDH（R41Q/V73A/A98K/I195R）。重组工程菌接种到含有卡那霉素的5 mL LB培养基的摇管中，在摇床上37 ℃恒温培养5 h，转速220 rpm。再将培养菌液按1％接种量接入含有200 mL诱导培养基TB的摇瓶中，于220rpm，37 ℃培养2.5 h，待OD600达到0.6左右时加入终浓度为0.25 mM IPTG，转25 ℃，诱导16 h。次日离心收集菌体，获得重组工程菌E.coli BL21(DE3)-BcGDH（R41Q/V73A/A98K/I195R）全细胞悬浮液，置于-20 ℃冰箱，可用于后续生物催化制备NMNH。
实施例3催化制备NMNH
配制2份50 mL终浓度为200 mM NMN、300 mM葡萄糖、100 mM Tris缓冲液的反应液，调节pH至8.0。取样50 μL作为反应0 h样品，随后加入使终浓度为10 g/L重组工程菌E.coli BL21(DE3)-BcGDH（R41Q/V73A/A98K/I195R）全细胞悬浮液或对应全细胞量破碎所得粗酶液，30 ℃水浴搅拌反应，用10 M氢氧化钠调节pH使其保持于8.0 ±0.5之间，分别在10 min/20 min/30 min/1.0 h取反应液50 μL，加0.1 M NaHCO3 稀释250倍，过0.22 μm微滤膜，作为液相样品HPLC上样检测。
时间10 min/20 min/30 min/1.0 h，反应NMN的转化率如下表所示：
从上表可知，BcGDH（R41Q/V73A/A98K/I195R）突变体粗酶液催化效果与全细胞催化效果差异小，但从储存稳定性、便利性及制备工序角度考虑，全细胞催化相较于粗酶液催化更优。
在后续的反应条件优化中，不再使用全细胞破碎所得粗酶液催化，仅用重组工程菌E.coli BL21(DE3)-BcGDH（R41Q/V73A/A98K/I195R）全细胞悬浮液进行催化反应条件的优化。
实施例4反应pH优化
配制4份50 mL终浓度为200 mM NMN、300 mM葡萄糖、100 mM对应pH下缓冲液的反应液，调节pH。取样50 μL作为反应0 h样品，随后加入使终浓度为10 g/L全细胞悬浮液，30℃水浴搅拌反应，用10 M氢氧化钠调节pH使其保持相应pH，分别在5 min/15 min/30 min/1.0 h取反应液50 μL，加0.1 M NaHCO3 稀释250倍，过0.22 μm微滤膜，作为液相样品HPLC上样检测。
pH 8.0/8.5/9.0/9.5，反应NMN的转化率如下表所示：
Tris:用于缓冲pH 8-8.5的体系，甘氨酸：用于缓冲pH 9-9.5的体系。
从上表可知，所用葡萄糖脱氢酶全细胞催化的最佳反应pH值为9.0时， 反应1 h，NMN的转化率最高，为100%。
实施例5温度优化
分别配制4份50 mL终浓度为200 mM NMN、300 mM葡萄糖、100 mM 甘氨酸/氢氧化钠缓冲液的反应液，调节pH至9.0。取样50 μL作为反应0 h样品，随后加入使终浓度为10 g/L全细胞悬浮液，不同温度下水浴搅拌反应，用10 M氢氧化钠调节pH使其保持于9.0 ±0.5之间，分别在5 min/15 min/30 min/1.0 h取反应液50 μL，加0.1 M NaHCO3 稀释250倍，过0.22 μm微滤膜，作为液相样品HPLC上样检测。
温度25/30/37/40℃，反应NMN的转化率如下表所示：
从上表可知，所用葡萄糖脱氢酶全细胞催化，30/37/40 ℃这三个温度点反应1 h后底物基本都消耗完毕，NMN转化率在反应过程中温度越高转化率也越高，但是相差不大，越高温底物和产物越不稳定，综合分析30 ℃为最优反应温度。
实施例6底物投料量优化
分别配制5份50 mL不同浓度 NMN和葡萄糖、100 mM 甘氨酸/氢氧化钠缓冲液的反应液，调节pH至9.0。取样50 μL作为反应0 h样品，随后加入使终浓度为10 g/L全细胞悬浮液，30 ℃水浴搅拌反应，用10 M氢氧化钠调节pH使其保持于9.0 ± 0.5之间，分别在15min/30 min/1.0 h/1.5 h取反应液50 μL，加0.1 M NaHCO3 稀释500倍，过0.22 μm微滤膜，作为液相样品HPLC上样检测。
NMN投料量200/400/600/800/1000 mM，反应NMN的转化率如下表所示：
从上表可知，所用葡萄糖脱氢酶全细胞催化，NMN底物浓度为1000 mM时反应在1 h内转化率仍可达99%，酶催化效率极高。
实施例7葡萄糖与NMN投料比优化
分别配制6份50 mL不同浓度 NMN、葡萄糖、100 mM 甘氨酸/氢氧化钠缓冲液的反应液，调节pH至9.0。取样50 μL作为反应0 h样品，随后加入使终浓度为10 g/L全细胞悬浮液，30 ℃水浴搅拌反应，用10 M氢氧化钠调节pH使其保持于9.0 ± 0.5之间，分别在15min/30 min/1.0 h/1.5 h取反应液50 μL，加0.1 M NaHCO3 稀释500倍，过0.22 μm微滤膜，作为液相样品HPLC上样检测。
葡萄糖投料量相对于NMN为1.0/1.1/1.2/1.3/1.4当量，反应NMN的转化率如下表所示：
从上表可知，所用葡萄糖脱氢酶全细胞催化，不同底物投料比下，催化前期反应速率相差不大，葡萄糖:NMN比例越低后期反应速率越慢，综合考虑葡萄糖:NMN为1.2:1的投料比为最优投料比。
实施例8全细胞用量优化
分别配制3份50 mL终浓度为400 mM NMN、480 mM葡萄糖、100 mM甘氨酸/氢氧化钠缓冲液的反应液，调节pH至9.0。取样50 μL作为反应0 h样品，随后分别加入不同终浓度全细胞悬浮液，30 ℃水浴搅拌反应，用10 M氢氧化钠调节pH使其保持于9.0 ± 0.5之间，分别在15 min/30 min/1 h/1.5 h/2.0 h取反应液50 μL，加0.1 M NaHCO3 稀释500倍，过0.22 μm微滤膜，作为液相样品HPLC上样检测。
全细胞用量分别为5/8/10 g/L，NMN的转化率如下表所示：
从上表可知，所用葡萄糖脱氢酶全细胞催化，10、8、5 g/L这三个全细胞用量，反应2 h后，底物NMN实现完全转化，全细胞用量少。
实施例9 1 L放大实验
配制2份1 L终浓度为400 mM NMN、480 mM葡萄糖、100 mM 甘氨酸/氢氧化钠缓冲液的反应液，调节pH至9.0。取样50 μL作为反应0 h样品，随后加入终浓度为10 g/L全细胞悬浮液，30 ℃水浴搅拌反应，用10 M氢氧化钠时时调节pH使其保持于9.0 ± 0.5之间，分别在15 min/30 min/1 h/1.5 h/2.0 h取反应液50 μL，加0.1 M NaHCO3 稀释500倍，过0.22 μm微滤膜，作为液相样品HPLC上样检测，检测波长为260 nm和340 nm。
催化结果如下表所示：
从上表可知，所用葡萄糖脱氢酶全细胞催化，1 L放大实验，反应2 h后，底物NMN实现完全转化。
Claims (10)
1.一种高催化性能葡萄糖脱氢酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQID NO.2所示。
2.一种还原型β-烟酰胺单核苷酸的制备方法，其特征在于，用如权利要求1所述的葡萄糖脱氢酶突变体催化β-烟酰胺单核苷酸转化成还原型β-烟酰胺单核苷酸。
3.根据权利要求2所述的一种还原型β-烟酰胺单核苷酸的制备方法，其特征在于，以β-烟酰胺单核苷酸和葡萄糖为底物，将权利要求1所述的突变体的基因转移至大肠杆菌获得重组工程菌的全细胞悬浮液或对应全细胞量破碎所得粗酶液，催化将β-烟酰胺单核苷酸转化成还原型β-烟酰胺单核苷酸。
4.根据权利要求3所述的一种还原型β-烟酰胺单核苷酸的制备方法，其特征在于，pH值为8.0～9.5。
5.根据权利要求3所述的一种还原型β-烟酰胺单核苷酸的制备方法，其特征在于，反应温度为25℃～40℃。
6.根据权利要求3所述的一种还原型β-烟酰胺单核苷酸的制备方法，其特征在于，所述底物中β-烟酰胺单核苷酸浓度为200～1000mM。
7.根据权利要求3所述的一种还原型β-烟酰胺单核苷酸的制备方法，其特征在于，所述底物中葡萄糖投料量相对于β-烟酰胺单核苷酸为1/1.0～1.5当量。
8.根据权利要求3所述的一种还原型β-烟酰胺单核苷酸的制备方法，其特征在于，所述重组工程菌的全细胞悬浮液的浓度为5～10g/L。
9.根据权利要求3所述的一种还原型β-烟酰胺单核苷酸的制备方法，其特征在于，配制终浓度为10g/L全细胞悬浮液、400mMβ-烟酰胺单核苷酸、480mM葡萄糖、100mM甘氨酸/氢氧化钠缓冲液的反应液，反应温度为30℃，pH值为9.0±0.5。
10.一种重组工程菌，其特征在于，将含有编码如权利要求1所述突变体的基因的质粒转化至E.coliBL21(DE3)获得重组工程菌。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410452498.9A CN118048332B (zh) | 2024-04-16 | 一种高催化性能葡萄糖脱氢酶突变体及在nmnh合成中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410452498.9A CN118048332B (zh) | 2024-04-16 | 一种高催化性能葡萄糖脱氢酶突变体及在nmnh合成中的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN118048332A CN118048332A (zh) | 2024-05-17 |
| CN118048332B true CN118048332B (zh) | 2024-06-21 |
Family
ID=
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Engineering a nicotinamide mononucleotide redox cofactor system for biocatalysis;William B. Black 等;《Nature Chemical Biology》;20191125;第16卷;摘要，第87-94页 * |
| 葡萄糖脱氢酶基因的重组和表达研究;徐军 等;《检验医学与临床》;20071231(第2期);摘要，第81-82页 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11781118B2 (en) | Preparation of L-amino acid deaminase mutant and application thereof | |
| CN107299072B (zh) | 一种工程菌及其应用 | |
| CN109055324B (zh) | 一种改进的酮还原酶及其应用 | |
| WO2022127310A1 (zh) | 一种制备(s)-2-(3-吡啶)-吡咯烷的方法 | |
| CN108949652B (zh) | 一种工程菌及其生产咖啡酸的应用 | |
| CN107287144B (zh) | 一种代谢改造的枯草芽孢杆菌生物转化细胞及其制备方法与应用 | |
| CN118048332B (zh) | 一种高催化性能葡萄糖脱氢酶突变体及在nmnh合成中的应用 | |
| CN117535256A (zh) | 一种羰基还原酶及其在玻色因合成中应用 | |
| CN108949649B (zh) | 一种工程菌及其在生产左旋多巴中的应用 | |
| CN118048332A (zh) | 一种高催化性能葡萄糖脱氢酶突变体及在nmnh合成中的应用 | |
| CN112175892B (zh) | 一种共表达l-苏氨酸醛缩酶与plp合酶的工程菌及应用 | |
| CN111172143B (zh) | D-木糖酸脱水酶及其应用 | |
| CN113122563A (zh) | 构建r-3-氨基丁酸生产菌的方法 | |
| CN108949656B (zh) | 一种工程菌及其在生产丙酮酸中的应用 | |
| CN114438052B (zh) | 一种烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体及其应用 | |
| CN114277013B (zh) | 一种nad激酶突变体及其应用 | |
| CN110804634A (zh) | 酶催化法制备2,4-二氨基丁酸的工艺 | |
| CN111575258B (zh) | 一种羰基还原酶EbSDR8突变体及其构建方法和应用 | |
| CN113913403B (zh) | 一种nadh激酶突变体、编码基因及其应用 | |
| CN115896061A (zh) | 一种烟酸磷酸核糖基转移酶突变体、编码基因及应用 | |
| CN118222525A (zh) | 葡萄糖脱氢酶突变体、核酸分子、重组载体、工程菌及应用 | |
| CN117402849A (zh) | 一种新型转氨酶突变体及其制备方法与应用 | |
| CN116606845A (zh) | 一种适用于高温反应的葡萄糖异构酶及应用 | |
| WO2022245340A1 (en) | Engineered biosynthetic pathways for production of deoxyhydrochorismic acid by fermentation | |
| CN116622691A (zh) | 一种适用于低pH条件的葡萄糖异构酶及应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant |