CN112125920A - 一类多环苯并双呋喃化合物及其作为抗rsv药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一类具有式(I)的多环苯并双呋喃化合物和其制备方法及作为在抗呼吸道合胞病毒（RSV）药物中的应用。本发明发现的多环苯并双呋喃化合物对呼吸道合胞病毒具有较强的抑制作用，且活性优于现有上市药物利巴韦林。因此，此类化合物在治疗呼吸道合胞病毒感染所引起的相关疾病中具有良好的应用前景。

Description

一类多环苯并双呋喃化合物及其作为抗RSV药物中的应用
技术领域
本发明涉及一类多环苯并双呋喃化合物和其制备方法及作为在抗病毒药物中的应用。更具体而言，本发明涉及一类多环苯并双呋喃化合物在用于作为抗呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)药物中的应用。
背景技术
呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)是单股负链RNA包膜病毒，属副粘病毒科、肺病毒属，根据病毒表面的抗原特性差异可分为A和B两个亚型。RSV可经呼吸道传播，是导致婴幼儿、老年人和免疫力低下的成年人下呼吸道疾病的最常见的病毒性病原体之一。特别是在婴幼儿时期易感，可引起支气管炎和肺炎等严重下呼吸道疾病。
至今，尚无已上市的商品化疫苗可用于预防RSV感染。到目前为止，市场上针对于该病毒的抗病毒药物主要为利巴韦林(Ribavirin)和帕利珠(Palivizumab)。其中，利巴韦林可用于RSV严重感染的治疗，但存在致畸等副作用，且疗效一般。而帕利珠是一种单克隆抗体，可用于预防患有慢性肺部疾病和先天性心脏病等高危儿童以及早产儿感染RSV，但并不能用于已感染RSV患者的治疗，且费用昂贵。由于目前临床上使用的抗RSV药物应用效果并不理想，因此迫切需要开发新型的抗RSV药物，用来预防或治疗RSV感染。
发明内容
本发明为了克服现有技术的上述不足，提供一类具有抗RSV活性的多环苯并双呋喃类化合物及其制备方法和在抗RSV药物中的用途。活性研究结果显示，本发明的多环苯并双呋喃类化合物对多种亚型的RSV病毒(A2株、Long株和B株)均具有显著的抑制活性，不仅可抑制高滴度RSV的感染，还可显著降低病毒基因的转录和表达水平。此外，该系列多环苯并双呋喃类化合物骨架新颖，具有与现有抗RSV药物利巴韦林不同的化学结构类型，有望发展成为一类新型的抗RSV病毒药物。
为了实现上述目的，本发明通过以下方案予以实现：
所述的多环苯并双呋喃化合物具有通式I所示的结构式：
Figure 937000DEST_PATH_IMAGE001
其中：
R1和R3各自独立地选自取代或未取代C1~C6烷基；
R2独立地选自取代或未取代C1~C6烷基、取代或未取代C3~C6环烷基。
在本发明的一个优选的实施方案中，所述的通式I所示的化合物包括，但不限于：
Figure 408433DEST_PATH_IMAGE002
本发明涉及一种药物组合物，其含有治疗有效剂量的通式I所示的多环苯并双呋喃类化合物，或其药学上可接受的盐或其立体异构体或其前药分子，以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
本发明涉及含有治疗有效剂量的通式I所示的多环苯并双呋喃类化合物，或其药学上可接受的盐或其立体异构体或其前药分子，或其药物组合物在制备用于抗RSV药物中的用途。
本发明涉及含有治疗有效剂量的通式I所示的多环苯并双呋喃类化合物，或其药学上可接受的盐或其立体异构体或其前药分子，或其药物组合物在制备用于治疗RSV病毒感染所引起的支气管炎和肺炎等疾病药物中的用途。
除非有相反陈述，在说明书和权利要求书中使用的术语具有下述含义。
本文所用术语“烷基”意指包括具有特定碳原子数目的支链的和直链的饱和脂肪烃基。例如，“C1~C6烷基”中“C1~C6”的定义包括以直链或支链排列的具有1、2、3、4、5或6个碳原子的基团。例如，“C1~C6烷基”具体包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、戊基、己基。术语“环烷基”指具有特定碳原子数目的单环饱和脂肪烃基。例如“环烷基”包括环丙基、环丁基、环戊基或环己基等。术语“烷氧基”指具有-O-烷基结构的基团，如-OCH3、-OCH2CH3、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH(CH3)2、-OCH2CH2CH2CH3、-OCH(CH3)2等。术语“芳基”包括但不限于：咪唑基、三唑基、吡唑基、呋喃基、噻吩基、噁唑基、异噁唑基、吡嗪基、哒嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基。
“取代的”指基团中的一个或多个氢原子，优选为最多5个，更优选为1~3个氢原子彼此独立地被相应数目的取代基取代。不言而喻，取代基仅处在它们的可能的化学位置，本领域技术人员能够在不付出过多努力的情况下确定(通过实验或理论)可能或不可能的取代。例如，具有游离氢的氨基或羟基与具有不饱和(如烯属)键的碳原子结合时可能是不稳定的。
“前药”表示在体内转变为本申请所涉及的化合物及其药学可接受的盐的结构的前药。
“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述化合物或其生理学上/可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，以及其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。
“可药用盐”是指本发明化合物的盐，这类盐用于哺乳动物体内时具有安全性和有效性，且具有应有的生物活性。
本发明中化合物的合成方法
为了完成本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
本发明通式I所示的化合物或其药学上可接受的盐或其立体异构体或其前药分子的制备方法，包括以下步骤：
Figure 649927DEST_PATH_IMAGE003
通式Ia的化合物在路易斯酸的条件下，通过傅克反应生成通式Ib的化合物。后者经过还原反应得到通式Ic的化合物，进一步发生氧化反应生成通式Id的化合物。通式Ie的化合物和通式Id的化合物在酸性或碱性条件下反应，得到通式If的化合物。通式If的化合物进一步与通式Ig的化合物在酸性或碱性条件下反应，得到通式I的多环苯并双呋喃化合物。其中：R1、R2和R3如权利要求1中所定义。
附图说明
图1 化合物2对不同病毒滴度RSV的抑制作用
图2 化合物2对RSV的灭活作用
图3 化合物2对RSV复制周期不同时间点的影响
图4 化合物2对RSV蛋白表达的抑制作用
具体实施方式
化合物的结构是通过核磁共振(NMR)或/和质谱(MS)来确定的。NMR位移(δ)以10−6(ppm)的单位给出。NMR的测定是用Bruker AVANCE-400和Bruker AVANCE-500核磁仪，测定溶剂为氘代氯仿(CDCl3)，内标为四甲基硅烷(TMS)。
MS的测定用FINNIGAN LCQAd (ESI)质谱仪(生产商：Thermo，型号：Finnigan LCQadvantage MAX)。
柱层析一般使用烟台黄海硅胶200~300目硅胶为载体。
本发明的已知的起始原料可以采用或按照本领域已知的方法来合成，或可购买自Acros Organics、Aldrich Chemical Company、韶远化学科技(Accela ChemBio Inc)、百灵威、安耐吉、达瑞化学品等公司。
实施例中无特殊说明，反应均在氩气氛或氮气氛下进行。
氩气氛或氮气氛是指反应瓶连接一个约1L容积的氩气或氮气气球。
实施例中无特殊说明，溶液是指水溶液。
实施例中无特殊说明，反应的温度为室温，为20 ºC~30 ºC。
实施例中的反应进程的监测采用薄层色谱法(TLC)，反应所使用的展开剂，分离纯化化合物采用的柱层析的洗脱剂的体系和薄层色谱法的展开剂体系包括：A：二氯甲烷/甲醇体系，B：正己烷/乙酸乙酯体系，C：石油醚/乙酸乙酯体系，D：丙酮，E：二氯甲烷/丙酮体系，F：乙酸乙酯/二氯甲烷体系，G：乙酸乙酯/二氯甲烷/正己烷，H：乙酸乙酯/二氯甲烷/丙酮，溶剂的体积比根据化合物的极性不同而进行调节，也可以加入少量的三乙胺和醋酸等碱性或酸性试剂进行调节。
以下实施例制备得到的具体化合物均包括但不限于出现在前面所述1~4中。
实施例1：化合物7~12的制备
Figure 751875DEST_PATH_IMAGE004
第一步：
室温下，将间苯三酚5溶于硝基甲烷溶液中，先后加入无水三氯化铝和异戊酰氯，并升温至40 ºC。反应5小时后，将反应液缓慢倒入冰水中，加入饱和的酒石酸钾钠溶液后，剧烈搅拌。反应液用乙酸乙酯萃取3次。将有机相合并，并用饱和的NaCl溶液洗涤。无水硫酸钠干燥过滤后，有机相在减压条件下蒸干溶剂。所得粗产物经硅胶柱层析分离纯化得到化合物7(产率为90 %)
第二步：
室温下，将化合物7溶于MeOH溶液中，加入NaOMe的MeOH溶液。室温反应10 min后，向反应体系中加入碘甲烷，升温至55 ºC，反应2小时，降温至0 ºC，用1N HCl酸化处理。乙酸乙酯萃取反应液3次，将有机相合并，并用饱和的NaCl溶液洗涤。无水硫酸钠干燥过滤后，有机相在减压条件下蒸干溶剂。所得粗产物经硅胶柱层析分离纯化得到黄色油状化合物8 (产率为86 %)。
第三步：
将化合物8溶于四氢呋喃溶液中，降至−78 ºC后，逐滴加入二异丙基氢化铝。反应1小时后，加入1N HCl淬灭反应。升至室温，搅拌1小时后，反应液用乙酸乙酯萃取3次。将有机相合并，并用饱和的NaCl溶液洗涤。无水硫酸钠干燥过滤后，有机相在减压条件下蒸干溶剂。所得粗产物经硅胶柱层析分离纯化得到化合物9 (产率为90 %)。
第四步：
室温下，将化合物9溶于甲苯中，用氧气球鼓泡半小时，后用蓝色LED灯(455 nm)照射48小时。有机相在减压条件下蒸干溶剂。所得粗产物经硅胶柱层析分离纯化得到化合物10(产率为80 %)。
第五步：
室温下，将化合物7和10溶于甲苯中，后加入三氟乙酸和分子筛，并升温至110 ºC。反应24小时后，降至室温，加入饱和的碳酸氢钠水溶液淬灭反应，用硅藻土过滤后，反应液用乙酸乙酯萃取3次。将有机相合并，并用饱和的NaCl溶液洗涤。无水硫酸钠干燥过滤后，有机相在减压条件下蒸干溶剂。所得粗产物经硅胶柱层析分离纯化得到化合物11和12 (产率为75%)。
化合物11：1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 13.27 (s, OH), 9.80 (s, OH), 6.07(s, 1H), 4.49 (s, 1H), 2.95 (dd, J = 14.7, 6.6 Hz, 1H), 2.75 (dd, J = 14.7,6.6 Hz, 1H), 2.40 (m, 1H), 2.16 (m, 1H), 1.51 (s, 3H), 1.41 (s, 3H), 1.40 (s,3H), 1.32 (s, 3H), 1.10 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 1.08 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.99(d, J = 6.6 Hz, 3H), 0.97 (d, J = 6.6 Hz, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ211.3, 203.8, 198.4, 179.8, 166.7, 159.9, 159.7, 129.5, 113.2, 104.3, 101.7,99.6, 55.2, 51.6, 45.7, 45.0, 35.4, 26.1, 25.9, 24.5, 24.1, 23.1, 22.9, 22.8,15.8, 15.7; HR-ESI-MS m/z 479.2046 [M + Na]+。
化合物12：1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 14.19 (b, OH), 10.19 (s, OH), 6.07(s, 1H), 4.47 (s, 1H), 3.08 (dd, J = 15.6, 6.4 Hz, 1H), 2.98 (dd, J = 15.6,6.4 Hz, 1H), 2.39 (m, 1H), 2.25 (m, 1H), 1.50 (s, 3H), 1.42 (s, 3H), 1.42 (s,3H), 1.36 (s, 3H), 1.06 (d, J = 7.2 Hz, 3H), 1.04 (d, J = 7.2 Hz, 3H), 0.99(d, J = 6.2 Hz, 3H), 0.98 (d, J = 6.2 Hz, 3H);13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ211.3, 206.5, 198.8, 180.0, 168.6, 163.2, 156.7, 129.5, 113.2, 107.2, 103.9,91.9, 55.1, 53.1, 45.8, 45.1, 35.3, 26.1, 25.2, 24.5, 24.4, 23.4, 23.1, 22.9,15.7, 15.7; HR-ESI-MS m/z 479.2036 [M + Na]+。
实施例2：化合物15和16的制备
Figure 462342DEST_PATH_IMAGE005
第一步：
室温下，将间苯三酚5溶于硝基甲烷溶液中，先后加入无水三氯化铝和对氟苯乙酰氯13，并升温至40 ºC。反应5小时后，将反应液缓慢倒入冰水中，加入饱和的酒石酸钾钠溶液后，剧烈搅拌。反应液用乙酸乙酯萃取3次。将有机相合并，并用饱和的NaCl溶液洗涤。无水硫酸钠干燥过滤后，有机相在减压条件下蒸干溶剂。所得粗产物经硅胶柱层析分离纯化得到化合物14 (产率为80 %)。
第二步：
室温下，将化合物10和14溶于甲苯中，后加入三氟乙酸和分子筛，并升温至110 ºC。反应24小时后，降至室温，加入饱和的碳酸氢钠水溶液淬灭反应，用硅藻土过滤后，反应液用乙酸乙酯萃取3次。将有机相合并，并用饱和的NaCl溶液洗涤。无水硫酸钠干燥过滤后，有机相在减压条件下蒸干溶剂。所得粗产物经硅胶柱层析分离纯化得到化合物15和16 (产率为70 %)。
化合物15：1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 12.97 (s, OH), 9.88 (s, OH), 7.23(m, 2H), 7.01 (m, 2H), 6.11 (s, 1H), 4.50 (s, 1H), 4.40 (d, J = 15.8 Hz, 1H),4.18 (d, J = 15.8 Hz, 1H), 2.44 (m, 1H), 1.52 (s, 3H), 1.42 (s, 3H), 1.41 (s,3H), 1.33 (s, 3H), 1.10 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 1.02 (d, J = 6.8 Hz, 3H); 13C NMR(100 MHz, CDCl3) δ 211.1, 200.6, 198.5, 179.8, 166.9, 163.2, 160.8, 160.3,159.8, 131.2, 131.1, 130.4, 130.3, 129.7, 115.5, 115.3, 113.2, 104.5, 101.4,99.8, 55.2, 48.0, 45.8, 44.9, 35.5, 26.0, 24.6, 24.3, 23.3, 15.8, 15.8; HR-ESI-MS m/z 509.1972 [M + H]+。
化合物16：1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 13.85 (s, OH), 10.45 (s, OH), 7.23(m, 2H), 7.00 (m, 2H), 6.09 (s, 1H), 4.48 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 4.47 (s, 1H),2.40 (m, 1H), 1.51 (s, 3H), 1.43 (s, 3H), 1.42 (s, 3H), 1.36 (s, 3H), 1.06(d, J = 6.8 Hz, 3H), 1.04 (d, J = 6.8 Hz, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ211.4, 203.4, 198.9, 180.1, 168.8, 163.7, 163.1, 160.7, 156.6, 131.6, 131.5,131.1, 131.1, 129.6, 115.3, 115.1, 113.2, 106.7, 104.2, 92.1, 55.1, 49.4,45.8, 45.0, 35.4, 26.1, 24.5, 24.4, 23.3, 15.7, 15.7; HR-ESI-MS m/z 509.1974[M + H]+。
实施例3：化合物19和20的制备
Figure 954110DEST_PATH_IMAGE006
第一步：
室温下，将间苯三酚5溶于硝基甲烷溶液中，先后加入无水三氯化铝和环己甲酰氯17，并升温至40 ºC。反应5小时后，将反应液缓慢倒入冰水中，加入饱和的酒石酸钾钠溶液后，剧烈搅拌。反应液用乙酸乙酯萃取3次。将有机相合并，并用饱和的NaCl溶液洗涤。无水硫酸钠干燥过滤后，有机相在减压条件下蒸干溶剂。所得粗产物经硅胶柱层析分离纯化得到化合物18 (产率为75 %)。
第二步：
室温下，将化合物10和18溶于甲苯中，后加入三氟乙酸和分子筛，并升温至110 ºC。反应24小时后，降至室温，加入饱和的碳酸氢钠水溶液淬灭反应，用硅藻土过滤后，反应液用乙酸乙酯萃取3次。将有机相合并，并用饱和的NaCl溶液洗涤。无水硫酸钠干燥过滤后，有机相在减压条件下蒸干溶剂。所得粗产物经硅胶柱层析分离纯化得到化合物19和20 (产率为70 %)。
化合物19：1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 13.33 (s, OH), 9.74 (s, OH), 6.11(s, 1H), 4.50 (s, 1H), 3.39 (m, 1H), 2.39 (m, 1H), 1.87 (m, 4H), 1.74 (m,2H), 1.52 (s, 3H), 1.46 (m, 2H), 1.41 (s, 3H), 1.41 (s, 3H), 1.37 (m, 2H),1.34 (s, 3H), 1.12 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 1.11 (d, J = 6.8 Hz, 3H); 13C NMR (100MHz, CDCl3) δ 211.3, 207.3, 198.4, 179.8, 167.2, 159.6, 159.6, 129.4, 113.4,104.4, 101.0, 99.9, 55.3, 49.1, 45.7, 45.1, 35.5, 29.8, 29.1, 26.3, 26.2,26.1, 26.1, 24.5, 24.2, 23.2, 15.9, 15.9; HR-ESI-MS m/z 483.2382 [M + H]+。
化合物20：1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 14.19 (s, OH), 10.20 (s, OH), 6.08(s, 1H), 4.48 (s, 1H), 3.76 (m, 1H), 2.39 (m, 1H), 1.99 (m, 1H), 1.83 (m,4H), 1.71 (m, 1H), 1.50 (s, 3H), 1.46 (m, 2H), 1.42 (s, 3H), 1.42 (s, 3H),1.38 (m, 2H), 1.36 (s, 3H), 1.06 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 1.04 (d, J = 6.8 Hz,3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 211.3, 210.3, 198.8, 179.9, 168.9, 163.1,156.4, 129.5, 113.3, 106.4, 104.1, 92.1, 55.1, 49.8, 45.8, 45.2, 35.4, 30.4,29.1, 26.4, 26.3, 26.0, 25.9, 24.4, 24.4, 23.5, 15.7, 15.7; HR-ESI-MS m/z 483.2373 [M + H]+。
实施例4：化合物1和2的制备
Figure 66423DEST_PATH_IMAGE007
室温下，将化合物10和11溶于甲苯中，后加入三氟乙酸和分子筛，并升温至110 ºC。反应24小时后，降至室温，加入饱和的碳酸氢钠水溶液淬灭反应，用硅藻土过滤后，反应液用乙酸乙酯萃取3次。将有机相合并，并用饱和的NaCl溶液洗涤。无水硫酸钠干燥过滤后，有机相在减压条件下蒸干溶剂。所得粗产物经制备HPLC分离纯化得到化合物1和2 (产率为50%)。
化合物1：1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 13.31 (s, OH), 4.75 (s, 1H), 4.71(s, 1H), 2.97 (dd, J = 14.6, 6.8 Hz, 1H), 2.74 (dd, J = 14.6, 6.8 Hz, 1H),2.36 (m, 1H), 2.29 (m, 1H), 2.17 (m, 1H), 1.47 (s, 3H), 1.45 (s, 3H), 1.43(s, 3H), 1.40 (s, 3H), 1.36 (s, 3H), 1.36 (s, 3H), 1.30 (s, 3H), 1.26 (s,3H), 1.09 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 1.05 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 1.04 (d, J = 6.8 Hz,3H), 1.01 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.99 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.97 (d, J = 6.8 Hz,3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 211.7, 211.6, 204.1, 193.3, 192.5, 176.5,176.4, 161.8, 160.8, 159.1, 129.8, 129.0, 113.0, 112.9, 107.7, 103.4, 100.4,56.3, 55.8, 52.1, 46.1, 45.7, 45.6, 45.5, 35.3, 35.1, 25.9, 25.4, 25.1, 24.7,24.7, 24.3, 24.0, 23.9, 23.4, 22.9, 22.8, 16.0, 15.9, 15.6, 15.6; HR-ESI-MSm/z 703.3474 [M + H]+。
化合物2：1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 13.39 (s, OH), 4.73 (s, 1H), 4.70(s, 1H), 2.91 (dd, J = 15.0, 6.8 Hz, 1H), 2.80 (dd, J = 15.0, 6.8 Hz, 1H),2.51 (m, 1H), 2.37 (m, 1H), 2.19 (m, 1H), 1.45 (s, 3H), 1.45 (s, 3H), 1.38(s, 3H), 1.35 (s, 3H), 1.34 (s, 3H), 1.29 (s, 3H), 1.26 (s, 3H), 1.17 (s,3H), 1.09 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 1.07 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 1.07 (d, J = 6.8 Hz,3H), 1.02 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.99 (d, J = 6.6 Hz, 3H), 0.98 (d, J = 6.6 Hz,3H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 212.6, 212.5, 204.1, 193.1, 192.5, 176.4,175.9, 161.7, 160.8, 159.3, 129.8, 129.1, 113.1, 112.9, 107.8, 103.2, 100.4,56.3, 56.0, 52.1, 45.5, 45.4, 45.4, 45.3, 35.1, 34.7, 25.6, 25.5, 24.8, 24.5,24.4, 24.4, 24.0, 23.9, 23.1, 22.9, 22.9, 16.0, 16.0, 15.9, 15.9; HR-ESI-MSm/z 703.3478 [M + H]+。
实施例5：化合物3的制备
Figure 136010DEST_PATH_IMAGE008
室温下，将化合物10和15溶于甲苯中，后加入三氟乙酸和分子筛，并升温至110 ºC。反应24小时后，降至室温，加入饱和的碳酸氢钠水溶液淬灭反应，用硅藻土过滤后，反应液用乙酸乙酯萃取3次。将有机相合并，并用饱和的NaCl溶液洗涤。无水硫酸钠干燥过滤后，有机相在减压条件下蒸干溶剂。所得粗产物经制备HPLC分离纯化得到化合物3 (产率为23 %)。
化合物3：1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 12.99 (s, OH), 7.23 (m, 2H), 6.99(m, 2H), 4.74 (s, 1H), 4.69 (s, 1H), 4.41 (d, J = 15.7 Hz, 1H), 4.16 (dd, J =15.7 Hz, 1H), 2.41 (m, 1H), 2.31 (m, 1H), 1.47 (s, 3H), 1.45 (s, 3H), 1.43(s, 3H), 1.40 (s, 3H), 1.36 (s, 3H), 1.36 (s, 3H), 1.30 (s, 3H), 1.25 (s,3H), 1.08 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 1.02 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 1.00 (d, J = 6.8 Hz,3H), 1.00 (d, J = 6.8 Hz, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 211.6, 211.5, 200.7,193.3, 192.4, 176.5, 176.4, 163.2, 161.7, 160.8, 160.7, 159.5, 131.3, 131.2,130.3, 130.2, 129.9, 129.3, 115.5, 115.3, 112.9, 112.9, 107.8, 105.1, 103.1,100.5, 56.2, 55.7, 48.3, 46.0, 45.6, 45.5, 45.5, 35.3, 35.1, 25.2, 25.1,24.8, 24.7, 24.3, 24.1, 23.8, 23.7, 16.0, 15.9, 15.6, 15.5; HR-ESI-MS m/z 755.3229 [M + H]+。
实施例6：化合物4的制备
Figure 333773DEST_PATH_IMAGE009
室温下，将化合物10和19溶于甲苯中，后加入三氟乙酸和分子筛，并升温至110 ºC。反应24小时后，降至室温，加入饱和的碳酸氢钠水溶液淬灭反应，用硅藻土过滤后，反应液用乙酸乙酯萃取3次。将有机相合并，并用饱和的NaCl溶液洗涤。无水硫酸钠干燥过滤后，有机相在减压条件下蒸干溶剂。所得粗产物经制备HPLC分离纯化得到化合物4 (产率为25 %)。
化合物4：1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 13.28 (s, OH), 4.74 (s, 1H), 4.70(s, 1H) , 3.36 (m, 1H), 2.35 (m, 1H), 2.29 (m, 1H), 1.85 (m, 4H), 1.72 (m,2H), 1.47 (s, 3H), 1.45 (s, 3H), 1.43 (s, 3H), 1.41 (m, 2H), 1.39 (s, 3H),1.38 (m, 2H), 1.36 (s, 3H), 1.36 (s, 3H), 1.30 (s, 3H), 1.25 (s, 3H), 1.10(d, J = 6.8 Hz, 3H), 1.07 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 1.03 (d, J = 6.6 Hz, 3H), 1.01(d, J = 6.6 Hz, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 211.7, 211.7, 207.5, 193.3,192.4, 176.4, 176.4, 161.4, 160.9, 158.8, 129.8, 128.8, 113.0, 113.0, 107.8,102.7, 100.4, 56.3, 55.8, 49.6, 46.1, 45.7, 45.6, 45.5, 35.3, 35.1, 29.9,29.8, 28.9, 26.3, 26.1, 26.1, 25.3, 25.0, 24.6, 24.3, 24.0, 23.9, 23.6, 16.0,15.9, 15.6, 15.6; HR-ESI-MS m/z 729.3636 [M + H]+。
实施例7：多环苯并双呋喃类化合物的体外抗RSV活性评价
(1)病毒、细胞和实验材料
人呼吸道合胞病毒(RSV，A2株、Long株和B株)、人喉表皮样癌细胞(HEp-2)。细胞生长在含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中，病毒接种到HEp-2细胞后进行扩增，培养液为含2%FBS的DMEM培养基。
(2)实验方法
多环苯并双呋喃类化合物对HEp-2细胞的毒性实验：将HEp-2细胞以1.0×104个细胞/孔接种于96孔板中，培养过夜形成单层细胞，分别加入浓度为80 μM、40 μM、20 μM、10 μM、5μM、6.25 μM的多环苯并双呋喃类化合物，每组设置3个复孔，并设置不加化合物的细胞对照组，置于37 ºC、5% CO2培养箱中，培养48小时后，弃去培养基，每孔加入100 μL含10% CCK-8试剂的DMEM，培养箱避光孵育2小时，震荡混匀后，于酶标仪450 nm下检测吸光值(OD)。细胞存活率(%)=加药组OD值/细胞对照组OD值×100%。根据存活率，于Graph prism 5.0软件拟合，计算出化合物的半数毒性浓度CC50。
多环苯并双呋喃类化合物的体外抗RSV活性测试：将HEp-2细胞以1.2×104个细胞/孔接种于96孔板中，培养过夜形成单层细胞，以化合物的最大无毒浓度作为起始浓度，用含2% FBS的DMEM稀释化合物，每个化合物设置6个两倍稀释的浓度，每孔加入50 μL含不同浓度化合物的培养基，随后加入100 TCID50的病毒50 μL，同时设置不加化合物的病毒对照组和两者均不加的细胞对照组，每组3个复孔。将细胞置于37 ºC、5% CO2培养箱中培养，3~4天后检测细胞病变效应(CPE)程度，根据CPE结果统计出化合物的IC50值。
(3)实验结果
本发明中化合物的抗RSV活性通过以上的实验方法测定，测得化合物体外抗RSV多个病毒株的活性IC50值及分别对HEp-2细胞的细胞毒性CC50值见表1。如表1中所示，所有化合物均显示出了良好的抗RSV活性，其活性均强于阳性对照药利巴韦林(Ribavirin)，其中化合物2的抗病毒活性最为显著。
Figure 130697DEST_PATH_IMAGE010
实施例8 ：化合物2对不同滴度RSV的抑制作用
实验方法：将HEp-2细胞以1.0×104个细胞/孔接种于96孔板中，培养过夜形成单层细胞，加入稀释后的病毒液，病毒感染复数MOI为0.1、0.5、1、2，且加入不同浓度的化合物，每组3个复孔，并设置不加化合物的病毒对照组和两者均不加的细胞对照组，置于37 ºC、5%CO2培养箱中，培养72小时后，收集病毒上清液，通过空斑减数的方法检测上清液中的病毒滴度。空斑减数方法：将HEp-2细胞以1.5×105个细胞/孔接种于24孔板中，培养过夜形成单层细胞，加入稀释后的病毒液，在37 ºC培养2小时后，将病毒液吸掉，加入500 μL维持培养基(含2% FBS)稀释的1.5% 琼脂糖，待琼脂糖冷却凝固后，加入500 μL维持培养基覆盖。在培养箱中培养4天后，向各培养孔中加入1 mL 4%甲醛溶液，固定4~6小时后，弃上层培养基和琼脂糖，加入结晶紫溶液进行染色，统计各孔中的空斑个数，并与病毒感染组进行比对，计算化合物对空斑形成的抑制率。
图1实验结果显示：化合物2对不同滴度的RSV A2均显示出了显著的抑制作用，病毒滴度越低，其抑制效果更显著，且呈明显的浓度依赖性。当化合物浓度为10 μM时，化合物2对各个滴度的RSV的抑制作用均高于80%。
实施例9 ：化合物2对RSV的作用方式研究
实验方法：采用直接灭活实验，研究化合物2对RSV是否具有直接灭活作用。用维持培养基将化合物2和RSV A2稀释成不同的浓度梯度(5 μM、10 μM、20 μM、40 μM、80 μM)，随后将两者以1:1混合，病毒对照组为维持培养基与化合物稀释液混合，将混合液置于37ºC孵育2小时。随后，将化合物与病毒的混合液稀释1000倍，加入到预先培养好的HEp-2细胞中，用PBS清洗1遍，加入200 μL预先混合好的病毒与化合物混合液，在37 ºC培养箱中培养2小时。设置不加化合物的病毒对照组和不感染病毒的细胞对照组。2小时后弃除板内液体，沿孔壁加入500 μL含1.5%琼脂糖的维持培养基，待琼脂糖冷却凝固后，加入500 μL维持培养基，于37ºC、5% CO2培养箱培养4天后，加入4%甲醛溶液，固定4~6小时后，弃上层培养基和琼脂糖，加入结晶紫溶液进行染色，统计各孔中的空斑个数，计算病毒感染率。
图3实验结果显示：化合物2在远高于IC50的浓度对RSV无明显的灭活作用。
实施例10：化合物2对RSV复制周期的影响
实验方法：采用时间点加入实验，研究化合物2对病毒复制各个阶段的抑制作用。将HEp-2细胞以1.0×104个细胞/孔接种于96孔板中，培养过夜形成单层细胞。弃细胞上清液，加入用维持培养基稀释后的RSV A2 (MOI = 0.5)，并在病毒感染后的不同时间点(0、2、6、10、16、24、32小时)加入化合物2。在加入病毒后的第36小时，将细胞裂解并离心，收集上清病毒液，通过空斑减数方法检测上清液中的病毒滴度。
图2实验结果显示：化合物2对RSV的抑制作用主要在病毒进入细胞后，而在病毒感染后的第10小时加入，其对RSV的抑制作用显著降低，直至感染后的第24小时，其抑制作用降至最低，表明化合物2对RSV的抑制作用主要在病毒进入细胞后，且在病毒组装释放前。
实施例11：化合物2对RSV蛋白表达水平的抑制作用
实验方法：采用免疫荧光标记的方法，研究化合物2对RSV蛋白表达水平的抑制作用。将HEp-2细胞接种于培养板中，培养过夜形成单层细胞，加入稀释后的RSV A2，同时加入用维持培养基稀释后的化合物2。培养48小时后，用0.1% Triton X-100将细胞破膜处理10分钟，PBS清洗2次后，加入4%多聚甲醛于室温固定15分钟，PBS清洗后，用特异性抗体标记RSV融合蛋白(F)，在室温下孵育2小时，用PBS清洗后，加入PBS稀释后的荧光二抗(1:500)，室温孵育2小时，加入DAPI溶液标记细胞核，在荧光显微镜下观察荧光强度。
图4实验结果显示：在感染RSV的细胞中加入化合物2 (10 μM)，在荧光显微镜下几乎检测不到绿色荧光(图4)，表明化合物2可显著降低RSV F蛋白基因的表达水平。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (6)

1.具有通式I所示结构的多环苯并双呋喃化合物或其药学上可接受的盐或其立体异构体或其前药分子：
Figure 66021DEST_PATH_IMAGE001
其中：
R1和R3各自独立地选自取代或未取代C1~C6烷基；
R2独立地选自取代或未取代C1~C6烷基、取代或未取代C3~C6环烷基。
2.根据权利要求1所述的通式I所示的化合物，所述的化合物选自：
Figure 770164DEST_PATH_IMAGE002
。
3.一种制备根据权利要求1所述的通式I所示的化合物的方法，该方法包括：
Figure 815481DEST_PATH_IMAGE003
通式Ia的化合物在路易斯酸的条件下，通过傅克反应生成通式Ib的化合物；后者经过还原反应得到通式Ic的化合物，进一步发生氧化反应生成通式Id的化合物；通式Ie的化合物和通式Id的化合物在酸性或碱性条件下反应，得到通式If的化合物；通式If的化合物进一步与通式Ig的化合物在酸性或碱性条件下反应，得到通式I的多环苯并双呋喃化合物，其中：R1、R2和R3如权利要求1中所定义。
4.根据权利要求1~2中任一项所述的多环苯并双呋喃化合物或其药学上可接受的盐或其立体异构体或其前药分子，以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂所组成的药物组合物。
5.根据权利要求1~2中任一项所述的多环苯并双呋喃化合物或其药学上可接受的盐或其立体异构体或其前药分子或根据权利要求4所述的药物组合物在制备用于抗呼吸合胞病毒(RSV)药物中的应用。
6.根据权利要求1~2中任一项所述的多环苯并双呋喃化合物或其药学上可接受的盐或其立体异构体或其前药分子或根据权利要求4所述的药物组合物在制备用于治疗RSV病毒感染所引起的支气管炎和肺炎等疾病药物中的用途。
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