CN112121039A

CN112121039A - 一种靶向pd-1/pd-l1相互作用的抗肿瘤活性小分子抑制剂及其应用

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Publication number: CN112121039A
Application number: CN202011128388.5A
Authority: CN
Inventors: 姚小军; 王凤玲; 朱永昌; 韩建庭; 刘焕香
Original assignee: Lanzhou University
Current assignee: Lanzhou University
Priority date: 2020-10-20
Filing date: 2020-10-20
Publication date: 2020-12-25

Abstract

本发明涉及一种靶向PD‑1/PD‑L1相互作用的抗肿瘤小分子抑制剂及其应用。本发明所述的小分子抑制剂，N‑[2‑(aminocarbonyl)phenyl][1,1'‑biphenyl]‑4‑carboxamide，可以通过抑制PD‑1/PD‑L1相互作用，重新激活T细胞的免疫应答，进而高效靶向杀伤肿瘤细胞。该小分子抑制剂可以作为新的抗肿瘤药物，具有重要的临床治疗价值。

Description

一种靶向PD-1/PD-L1相互作用的抗肿瘤活性小分子抑制剂及其应用

技术领域：

本发明涉及一种具有PD-1/PD-L1抑制活性的小分子抑制剂及其用途，属于抗肿瘤药物研发与应用技术领域。

背景技术：

肿瘤免疫治疗(Tumor immunotherapy)是通过激活机体自身的免疫系统，从而抑制和杀伤肿瘤细胞(1)，具有治疗多种类型肿瘤的潜力，且具有持久反应和低毒性，可实质性改善患者总生存期，是肿瘤有望治愈的一个开端。由于卓越的疗效和创新性，2013年Science杂志将肿瘤免疫疗法列为年度十大科学突破榜首(2)。免疫检查点抑制剂，通过阻断抗原呈递细胞和T细胞间抑制信号的传递，重新激活T细胞的免疫应答，对肿瘤细胞进行消除(3)，开启了癌症免疫治疗新的里程碑。程序性死亡受体1(programmed death 1,PD-1，CD279)是一种重要的免疫抑制分子，CD28超家族成员，表达于活化的T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞以及树突细胞(4)。PD-L1(B7-H1)和PD-L2(B7-DC)都是PD-1的蛋白配体，PD-L1表达于各种类型的细胞，包括胎盘，胰岛细胞，间充质干细胞和免疫细胞(5)，大量实验表明，肿瘤细胞可以通过上调肿瘤微环境中PD-L1的表达量来摧毁T细胞的免疫反应，已经成为评价药物免疫治疗的一个重要的生物标志物(6,7)。因此，PD-1/PD-L1无疑是目前最有潜力的一个靶点，对此信号通路的阻断是当前免疫治疗研究的一个突破性和创新性方向。

迄今为止，PD-1/PD-L1单克隆抗体在癌症免疫治疗领域已经取得了前所未有的巨大成功，已经有一系列靶向PD-1或PD-L1的单克隆抗体被FDA批准上市或正处于临床研究阶段，而非抗体类的抑制剂包括小分子、多肽和DNA适配体等研究相对滞后，虽然已有相关的文献报导，但是极少进入临床研究。目前，活性较好、作用机理最明确的一类小分子抑制剂由BMS所报导，其核心骨架包含三个芳环：其中两个苯环构成联苯结构，另一个苯环通过亚甲基胺与联苯相连(8)。尽管单克隆抗体在癌症免疫治疗领域取得了前所未有的成功,但是由于单克隆抗体是生物制剂，分子量较高，具有药物生产成本高，免疫源性副作用大等弊端(9)，因此多肽抑制剂和小分子化合物的开发仍具有巨大的发展空间，将为肿瘤免疫治疗提供新的机遇。

本发明从蛋白晶体结构(5J89)出发,基于虚拟筛选的策略发现具有全新骨架结构的活性小分子N-[2-(aminocarbonyl)phenyl][1,1'-biphenyl]-4-carboxamide，并通过体外和体内实验证实其具有良好的机体免疫调节功能和抑制肿瘤生长功能，并且未发现其肝肾毒副作用，可作为具有潜在应用价值的抗肿瘤药物。

参考文献

1.Papaioannou NE,Beniata OV,Vitsos P,Tsitsilonis O,&Samara P(2016)Harnessing the immune system to improve cancer therapy.Ann Transl Med 4(14):261-261.

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3.Topalian Suzanne L,Drake Charles G,&Pardoll Drew M(2015)ImmuneCheckpoint Blockade:A Common Denominator Approach to Cancer Therapy.CancerCell 27(4):450-461.

4.Chen L&Flies DB(2013)Molecular mechanisms of T cell co-stimulationand co-inhibition.Nature Reviews Immunology 13(4):227-242.

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6.Gatalica Z,et al.(2014)Programmed Cell Death 1(PD-1)and Its Ligand(PD-L1)in Common Cancers and Their Correlation with Molecular CancerType.Cancer Epidemiology Biomarkers&amp；amp；Prevention 23(12):2965.

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9.Konstantinidou M,Zarganes-Tzitzikas T,Magiera-Mularz K,Holak TA,&

A(2018)Immune Checkpoint PD-1/PD-L1:Is There Life Beyond Antibodies？Angewandte Chemie International Edition 57(18):4840-4848.

发明内容：

本发明的目的在于通过分析hPD-1/hPD-L1蛋白晶体结构(5J89)，利用PD-L1作为抗肿瘤靶点，采用虚拟筛选方法，从Specs数据库中筛选出一种具有高抗肿瘤活性的优势小分子抑制剂，该小分子化合物通过阻断PD-1/PD-L1通路，可以显著促进T细胞的免疫激活，促进肿瘤浸润T淋巴细胞的功能，进而有效抑制了肿瘤的生长，为靶向肿瘤免疫治疗提供了全新的方向。

本发明所述的具有抗肿瘤活性的PD-1/PD-L1小分子抑制剂，N-[2-(aminocarbonyl)phenyl][1,1'-biphenyl]-4-carboxamide，(SPECS No.AG-690/11449006，APBC)，其结构通式如(I)所示：

本发明所述的通式化合物可以通过现有常规方法合成。可通过将本发明化合物作为活性成分与一种或多种药学上可接受的固体或液体赋形剂和/或辅剂结合，制备成适于人或动物适用的任何剂型抗肿瘤药物，如可用来制备抗黑色素瘤,结肠癌，肺癌，乳腺癌、宫颈癌、神经胶质瘤或肝癌的药物。

本发明化合物或含有其它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、肌肉注射、皮下注射、直肠等，优选注射剂。

与现有技术相比，相对于现有的技术具有如下特点和优势：

1.申请人利用虚拟筛选手段，高通量的筛选出可以靶向PD-L1的具有全新骨架的小分子抑制剂，主要通过机体免疫激活进而抑制肿瘤细胞的增殖。通过体外体内实验验证，发现该小分子化合物非常显著的抑制肿瘤的生长。

2.本发明APBC小分子化合物属于联苯酰胺类，具有良好的血浆稳定性并且肝肾毒性非常低(尚未发现对机体具有毒副作用)。

3.本发明化合物的抗癌谱较广，适用多种癌症如黑色素瘤，神经胶质瘤，结肠癌等。

综上所述，本发明所公开的化合物在肿瘤免疫治疗领域具有很好的应用前景，并将为基于PD-1/PD-L1的药物开发提供新思路和新方法。

附图说明：

图1为SPR实验鉴定APBC与PD-L1的亲和力结果图。

图2为HTRF实验鉴定APBC对hPD-1和hPD-L1相互作用抑制的结果图。

图3为流式细胞分析鉴定APBC对hPD-L1/hPD-1相互作用抑制的结果图。

图4为ELISA实验鉴定APBC对T淋巴细胞活性影响的结果图。

(A)APBC对与NCI-H1975细胞共培养的CD4⁺T细胞分泌IFN-γ的影响。

(B)APBC对与NCI-H1975细胞共培养的CD4⁺T细胞分泌TNF-α的影响。

图5为APBC对荷B16F10-hPD-L1瘤C57BL/6小鼠的抗肿瘤活性的影响。

(A)和(B)为流式分析鉴定构建的B16F10-hPD-L1细胞膜表面mPD-L1和hPD-L1的表达情况。

(C)是各组荷瘤小鼠皮下肿瘤图像。

(D)和(E)是APBC对荷瘤小鼠瘤体积和重量变化的影响结果图。

(F)APBC对荷瘤小鼠脾脏重量的影响结果图。

图6为流式细胞检测APBC对荷B16F10-hPD-L1瘤C57BL/6小鼠脾脏T淋巴细胞亚群分布和细胞因子产生的影响。

图7为免疫组化检测APBC对荷B16F10-hPD-L1瘤C57BL/6小鼠脾脏T淋巴细胞亚群的影响。

图8为免疫组化检测APBC对荷B16F10-hPD-L1瘤C57BL/6小鼠肿瘤浸润T淋巴细胞亚群的影响。

图9为血液生化分析检测APBC对荷瘤小鼠的肝功能影响。

图10为分子对接鉴定APBC与hPD-L1的相互作用模式。

具体实施方式：

以下通过具体实施例对本发明进行进一步描述，但不应将此理解为本发明上述主体的范围仅限于以下实施例。凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。

在本发明中，申请人基于hPD-L1与小分子BMS-202复合物的晶体结构(5J89)，利用薛定谔软件(

LLC,New York,United States,2015)从Specs化合物库中进行小分子药效团的筛选和分子对接，遴选出对接的优势结构进行实验验证，最终筛选出本发明的APBC小分子化合物(PECS,No.AG-690/11449006)具有较好hPD-1/hPD-L1抑制活性，属于联苯酰胺类。申请人委托上海陶素生化科技有限公司合成该小分子化合物。

本发明所涉及的实验方法和结果如下：

1.表面等离子体共振(SPR)实验鉴定APBC与PD-L1的亲和性

SPR实验通过将PD-L1蛋白偶联固定在CM5芯片上，使用Biacore X100 plus(GEHealthcare)仪器，25℃测定。具体过程如下：

a)进行System check：Tools->More Tools->Test Tools->System Check

b)去吸附(Desorb)和除菌(Sanitize)：Tools->More Tools->MaintenanceTools->Desorb and Sanitize

c)最佳偶联pH值的确定：使用Find Immobilization pH中Immobilization pHScouting模块确定PD-L1蛋白偶联的最佳pH值。分别用pH为5.5、5.0、4.5和4.0的10mM醋酸钠缓冲溶液稀释蛋白至终浓度为50μg/ml，依次进样180s，同时使用50mM NaOH溶液作为清洗液，最后选择响应值高及峰图陡峭的pH作为最终偶联蛋白的pH条件。

d)PD-L1蛋白偶联到CM5芯片上：以最适PH的10mM醋酸钠溶液稀释蛋白至终浓度为50μg/ml，在Immobilize模块中将蛋白溶液通过氨基偶联法固定到CM5(Series S SensorChip CM5,GE Healthcare)芯片的Flow Cell 2样品通道中，并以空白Flow Cell 1作为参比通道，设置最高PD-L1蛋白的偶联水平为8000RU。以HBS-EP(GE Healthcare)作为工作液进行偶联，首先，CM5芯片表面用0.2M EDC和0.05M NHS等体积混合溶液活化，以10μl/min流速进样7min后，注射蛋白溶液到活化表面，使之与CM5芯片表面充分结合；然后用1Methanolamine封闭液进样7min，使过量的反应基团失活并封闭活化的芯片表面。

e)溶剂校正：在测定用DMSO溶解的化合物的结合作用时需要扣除DMSO的影响。配制DMSO浓度处于4.5％到5.8％之间的一系列溶液，并测定其SPR响应值，然后在BiacoreX100 Evaluation软件中通过加入溶剂校正曲线扣除所测定样品中DMSO的响应影响。

f)结合亲和力(kinetic and affinity)测定：使用1.05×PBS溶液及DMSO(待测化合物溶液中DMSO终浓度为5％)配制APBC浓度梯度(100μM，50μM，25μM，12.5μM，6.25μM，3.125μM)进行结合亲和力测定。使用含5％DMSO的1.05×PBS溶液作为缓冲液，以30μl/min速度进样，设定结合和解离时间分别为60s，Evaluation软件中加入溶剂校正结果，得到结合饱和时期的RU，通过Biacore T200 Evaluation软件，使用单一位点相互作用模型拟合得到化合物与PD-L1蛋白的结合亲和力。

通过SPR实验检测到APBC与PD-L1的亲和活性如图1，随着APBC浓度的增加，导致SPR信号增大，表明APBC可以与hPD-L1可以有效的结合，其K_D值为49.5μM。

2.均相时间分辨荧光(HTRF)实验鉴定APBC对hPD-1/hPD-L1的抑制活性

使用PD1/PD-L1结合HTRF试剂盒(Cisbio,Part#64ICP01PEG)，具体步骤如下：

a)用Dilution Buffer稀释小分子化合物，配置10倍工作浓度的一系列浓度梯度化合物；Tag1-PD-L1和Tag2-PD1重组蛋白分别用Dilution Buffer稀释至25nM和250nM；anti-Tag1-EuK和anti-Tag2-XL665分别用Detection Buffer稀释为1X。

b)384孔板每孔依次加入，2μl小分子化合物，4μl Tag1-PD-L1,4μl Tag2-PD1,室温孵育15min。

c)取同体积anti-Tag1-Eu K和anti-Tag2-XL665预混合，384孔板每孔加入10μl抗体混合液。封膜室温孵育2h。

d)酶标仪检测等时间点的665nm及620nm的吸光度值，根据665nm/620nm的值计算化合物在不同浓度下对PD-1/PD-L1结合的抑制效应。

结果如图2，APBC可以有效的抑制hPD-1/hPD-L1的结合，其IC₅₀值为27.82μM，在100μM浓度下对人源PD-1/PD-L1的抑制率为65.1％。

3.流式细胞实验鉴定APBC对hPD-1/hPD-L1的抑制活性

a)构建稳定高表达PD-1的Jurkat T细胞系(由本实验室构建)，10％FBS、RPMI1640培养基，37℃、5％CO₂条件培养，传代两次，收集悬浮细胞用PBS调整细胞浓度至4x 10⁶个/mL。

b)使用PBS配置4倍工作浓度的APBC化合物分别为200和100μM。并使用PBS配置4倍工作浓度的蛋白溶液，10ug/mL hPD-L1-his(Sino Biological Inc.，10084-H08H)。

将不同浓度APBC小分化合物加入50μL/管，再依次加入10ug/mL hPD-L1-his蛋白50μL/管4℃孵育30min。随后将细胞悬液100μL/管加入各样本管中，最终实验组每孔4x10⁵个细胞，50μL化合物，50μL 10ug/ml h-PD-L1-his蛋白，并且实验设置阴性对照组(100μL细胞悬液+100μL PBS)，阳性对照(100μL细胞悬液+50μL PBS+50μL hPD-L1-his蛋白)轻柔混匀后4℃或冰上避光孵育60min。

c)每孔加入200μL PBS，1500r，4℃离心5min，弃上清，再加入200μL PBS，离心洗涤2次。

d)弃上清，每管加入50μL anti-his-APC抗体(1:50稀释)，4℃孵育20min。用PBS洗涤2次。

e)使用流式细胞仪收集细胞及结果分析。

结果如图3，APBC可以有效的抑制hPD-L1蛋白与高表达PD-1的Jurkat T细胞的结合，其在50μM浓度下的抑制率为37.3％,在25μM浓度下的抑制率为10.2％。

4.ELISA实验鉴定APBC对T淋巴细胞活性影响

a)2×10⁶个人源CD 4⁺T淋巴细胞(Leide Biosciences)接种于15％FBS,500IU/mLIL-2(R&D,202-IL-010),RPMI-1640培养基中，加入T-activator CD3/CD28免疫磁珠(Gibco,11131D；磁珠：细胞＝1:1)，扩增培养7d后，收集部分冻存备用。

b)非小细胞肺腺癌细胞株NCI-H1975用完全培养基调整其浓度为1×10⁵个/mL，分别接种于96孔细胞培养板中(100μL/孔)，培养24h。

c)96孔板弃培养液，加入CD4⁺T细胞100μL/well(2×10⁴cells)，两者按效应细胞:靶细胞(2:1)的效靶比混合，加入激发型anti-CD3 mAb(ACRO，CDE-M120a，5μg/ml),50μL/孔,同时加入梯度稀释的小分子化合物50μL/孔，1000rpm，离心2min，细胞培养板置于5％CO₂，37℃的培养箱中共培养48h。

d)将各孔吸取T细胞培养上清，应用商品化的IFN-γ(Invitrogen,88-7316-22)和TNF-αELISA试剂盒(Invitrogen,88-7346-88)检测各组细胞的细胞因子分泌量，具体实验操作方法按试剂盒说明书进行。

结果如图4，APBC可以消除肿瘤细胞对T细胞的免疫功能抑制，显著提高T淋巴细胞的活性，使其恢复IFN-γ和TNF-α的分泌能力并且具有梯度依赖性。

5.荷瘤小鼠体内实验

购买C57BL/6型小鼠(维通利华)于无病原菌的条件下饲养，选6-8周龄小鼠备用。小鼠黑色素瘤细胞系B16F10-hPD-L1(高表达人源PD-L1，由本实验室构建)，10％FBS、DMEM，37℃，5％CO₂培养。B16F10-hPD-L1细胞用PBS重悬，调整浓度为2.5×10⁷/ml。取200μl细胞悬液经皮下注射入C57BL/6小鼠右腹侧。持续观察瘤体生长情况，待肿瘤体积长到50-100mm³，将造模小鼠随机分为4组(n≥5)，包括：阴性对照组(Vehicle，生理盐水含8％乙醇和8％甘油)，小分子处理组(高，低剂量)，阳性对照组(PD-L1单克隆抗体Atezolizumab)。而后经腹腔注射给药，分别给予Vehicle，小分子化合物组每2天一次，阳性药经尾静脉给药，每3天一次。每两天测量一次小鼠肿瘤的长(a)短(b)径，并按公式(肿瘤体积＝1/2×a×b²,a是瘤长,b是瘤宽)计算肿瘤体积并绘制肿瘤生长曲线。14天后处死小鼠，收集血液，剥除肿瘤，脾脏，检测肿瘤体积和重量以及小鼠重量。组织样本一部分多聚甲醛固定制作石蜡切片，一部分-80度保存做进一步免疫功能分析。

a)脾脏淋巴细胞分离

乙醚麻醉小鼠，断颈处死，75％乙醇浸泡10min；将分离的脾脏组织浸泡在干净的PBS溶液中。在一个培养皿中加入10mL的RPMI 1640含10％FBS,放一个细胞筛，取一个干净的注射器，用其按压处的末端对组织进行碾压，膜内细胞会慢慢游离出来，经过70μm细胞筛后，悬浮在培养皿溶液中。1640-10％FBS冲洗滤网，室温、2000rpm离心15min；20mL红细胞裂解液重悬沉淀，室温5min，2000rpm离心15min，重复破红一次；1640-10％FBS重悬沉淀，2000rpm离心10min，重复清洗一次；1640-10％FBS重悬5mL，除去其中不可溶的组织纤维，并进行细胞计数，调整细胞浓度至2.5×10⁶cells/mL，备用。

每支流式检测管中加入100uL细胞悬液(5-10x 10⁵细胞/管)，PBS洗一次，加入适量荧光标记抗体FITC anti-mouse CD3(BioLegend,Cat.100203)，分别与PE anti-mouseCD4(BioLegend,Cat.100407)和PE anti-mouse CD8(BioLegend,Cat.100707)双染，冰上避光孵育15-20min，PBS洗两遍，加入500μL FACS buffer，流式细胞仪检测。在进行胞内染色之前(Perforin)，可根据BioLegend细胞表面荧光染色方案染表面标记CD3，然后用固定液(BioLegend,Cat.420801)固定细胞，室温避光孵育20min,离心弃上清，加入破膜剂(BioLegend,Cat.No.421002)重悬细胞，350g离心5-10minutes，弃上清，2次重复，加入APCanti-mouse Perforin(BioLegend,Cat.154303)室温避光孵育20min。用破膜剂洗涤细胞两次，350g离心5minutes，弃上清，FACS buffer重悬上机(Beckman Coulter，CytoFLEX S)检测分析。

对于胞内因子IFN-γ和TNF-α的检测采用如下方案：重悬各组脾脏淋巴细胞，2x10⁶个细胞接种于6孔板，加入活化因子Cocktail(BioLegend,Cat.423301)以及brefeldin A(BioLegend,Cat.No.420601)，37℃刺激3-4h,收集细胞，进行胞膜和胞内IFN-γ(BioLegend,Cat.505809)和TNF-α(BioLegend,Cat.506328)，上机检测分析。

b)免疫组化实验

将前期固定的各组脾脏和肿瘤样本制备石蜡切片，脱蜡前将切片置于60℃恒温箱中烘烤1h，而后置于二甲苯及梯度醇中进行脱蜡和水化，PBS洗2～3次，3％H₂O₂室温孵育5-10分钟,而后在抗原修复液中进行抗原修复，PBS洗2～3次，将切片在0.3％BSA封闭缓冲液中封闭，加入一抗工作液CD4(Abcam),CD8(Abcam)和FOXP3(Abcam)，4℃孵育过夜，PBS洗2～3次，加入生物素标记的二抗工作液，37℃孵育10-30min，PBS洗2～3次，滴加S-A/HRP作用20min,DAB显色，苏木素复染2min，最后脱水、透明、封片、镜检,并通过Image J软件统计分析。

c)血液生化项目检测

取不同处理后的荷瘤小鼠，摘除眼球取血，室温静置2h，3500r/min离心15min后，取上清血清样，按相应试剂盒说明书，使用生化分析仪(日本富士)分别检测ALB，ALP，GPT，GOT等的含量。

结果如图5，APBC对小鼠B16F10肿瘤的生长有极显著的抑制作用，P<0.01。两给药组的瘤重(10mg/kg，0.90±0.186g；15mg/kg，0.40±0.123g)与对照组比较(2.17±0.242g)均显著减小，p值均小于0.01,且在一定浓度范围内，APBC浓度越大，对肿瘤生长抑制越显著。同对照组相比，APBC治疗组小鼠体重正常，并且对照组有显著的脾肿大现象(P<0.05)，用药组正常，由此可见，APBC不仅具有显著的抗肿瘤效果，而且毒副作用较小。图6和7结果显示，APBC治疗组和对照组相比小鼠脾脏CD3⁺T,CD4⁺T,CD8⁺T细胞数显著增多，而且脾脏T淋巴细胞分泌细胞因子的能力包括穿孔素perforin，TNF-α和IFN-γ显著增强。图8结果显示，APBC治疗组小鼠肿瘤内CD4⁺和CD8⁺T细胞浸润数量显著增加，而FOXP3是调节性T细胞(Treg)的标志性分子，在APBC治疗组和对照组中表达量差异不显著。图9血液生化指标证实，APBC治疗剂量和高剂量均对肝功能无毒副影响，并且因为其肿瘤治疗作用，反而肝功能指标显著优于对照组。

6.分子对接

从蛋白质数据库(https://www.rcsb.org/pdb/home/home.do,Protein DataBank)中下载得到PD-L1与小分子BMS202复合物的晶体结构(5J89)，在薛定谔软件(Schrodinger)Protein Preparation Wizard模块中对蛋白结构进行加氢、质子化、去水及补全缺失的氨基酸残基侧链，以晶体结构中共结晶配体所在位置为基点，在Receptor GridGeneration模块中生成用于对接的格点文件，格点产生过程中采用程序默认的参数。在Ligand Preparation Wizard中对APBC化合物进行准备，产生配体的各种异构体以及不同的质子化状态，通过Glide模块将APBC与PD-L1结合位点对接，生成对接打分结果，利用Pymol观察其结合模式。

对接结果(图10)表明，APBC能够嵌合在由两个PD-L1单体形成的柱状疏水袋中，蛋白中对小分子结合有贡献的热点残基，包括Q66，Y56，M115，A121，D122，I116等，其中APBC可以与关键残基D122形成重要的氢键，同时与残基Y56形成π-π堆积，有助于稳定复合物结构，另外APBC与周围残基之间形成的疏水接触也有助于小分子与PD-L1的结合。进一步分析发现这些与APBC有相互作用的热点残基与文献中报道的参与BMS 202作用的残基有部分是一致的，如Y56，D122和A121等。这意味着APBC可能通过与BMS202相似的机制来诱导了PD-L1形成同源二聚体。

以上研究结果均证实APBC是一种具有全新骨架的可以靶向PD-L1的抗肿瘤小分子化合物，本研究首次证明APBC通过阻断PD-1/PD-L1通路，可以显著促进T细胞的免疫激活，促进肿瘤浸润T淋巴细胞的功能，进而有效抑制了肿瘤的生长，为靶向肿瘤免疫治疗提供了全新的方向。

Claims

1.具有靶向PD-1/PD-L1相互作用的小分子化合物N-[2-(aminocarbonyl)phenyl][1,1'-biphenyl]-4-carboxamide，其特征在于其结构如下：

2.由权利要求1所述的具有PD-1/PD-L1靶向性的小分子化合物在制备抗肿瘤药物分子中的应用。治疗的肿瘤包括黑色素瘤、结肠癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、食管癌、宫颈癌、神经胶质瘤或肝癌等肿瘤。

3.由权利要求2所述的制备抗肿瘤药物分子可通过现有常规方法合成。可通过将本发明化合物作为活性成分与一种或多种药学上可接受的固体或液体赋形剂和/或辅剂结合，制备成适于人或动物适用的任何剂型抗肿瘤药物。

4.由权利要求2所述的制备抗肿瘤药物分子可通过本发明化合物或含有其它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、肌肉注射、皮下注射、直肠等，优选注射剂。