CN112114062A - 一种用高效液相色谱检测乳酸链球菌素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于乳酸链球菌素检测领域，具体涉及一种用高效液相色谱检测乳酸链球菌素的方法，包括以下步骤：制备Nisin标准溶液和样品溶液、采用高效液相色谱进行检测、记录峰面积，采用外标法计算样品中Nisin的含量。本方法样品预处理步骤简单，色谱条件温和易控不苛刻，分离分析效果好，检测准确度和灵敏度高，重复性和专属性好，检测效率高且成本低，易推广，Nisin的生产企业和应用企业都可采用。
Description
技术领域
本发明属于乳酸链球菌素检测领域，具体涉及一种用高效液相色谱检测乳酸链球菌素含量的方法。
背景技术
乳酸链球菌素，又称乳球菌肽或乳链菌肽，英文名为Nisin，是乳酸链球菌代谢产物中一种具有活性的抗菌蛋白或多肽，由34个氨基酸残基组成，能够有效抑制大多数引起食品腐败的革兰氏阳性菌和部分革兰氏阴性菌，从而降低食品的灭菌温度，缩短灭菌时间，提高食品品质。
Nisin对蛋白水解酶极敏感，食用后迅速酶解成氨基酸，对人体无如何毒副作用，因此，它是一种世界公认的、安全、高效的天然食品防腐剂，可取代或部分取代化学防腐剂，用于乳制品、罐装食品、肉制品、烘焙食品和饮料等各种食品的防腐保鲜，以满足生产健康、绿色食品的需要。目前已在全球60多个国家和地区广泛使用。
Nisin主要是通过微生物发酵来生产的，其发酵周期很短，一般在16-24h。发酵终点因菌体量、菌体活性和发酵条件的不同而不完全固定，同时Nisin在发酵液条件下不稳定，所以生产者需要在发酵过程中密切关注发酵效价，及时根据效价变化情况调整参数或结束发酵过程以保证最大产量；同时，提取过程也需要根据效价变化情况确定进入下一工序的节点。而在Nisin市场上，有些企业为了低价竞争，降低成本，不惜降低产品纯度，以次充好。令人遗憾的是，绝大部分应用企业的采购人员对Nisin缺乏深入的了解，更由于多数企业没有相应的检测条件，所以采购方对Nisin的纯度认识不足。据第三方检测机构介绍，现在国内市场，不同企业生产的Nisin纯度差异很大，甚至有的产品纯度不足国标要求的一半。所以，无论是Nisin的生产企业还是采购企业，都需要一种快速、准确、简便易行的Nisin定量检测方法。
反观国内外关于Nisin的检测方法，主要有抑菌检测法、免疫检测法和生物荧光检测法等。抑菌检测法包括琼脂扩散法和浊度比色法等，我国目前执行的GB 1886.231《食品添加剂乳酸链球菌素》中采用的方法即为美国FCC琼脂分散法；免疫学法有酶联免疫吸附法、斑点免疫印迹法、多克隆抗体酶联免疫吸附法等；生物荧光法有ATP生物发光测定法、生物传感器检测法等。抑菌检测法和生物荧光检测法都存在操作繁琐、检测时间长、工作量大、影响检测结果因素多、特异性和灵敏性差、准确性及重复性低等缺点，且对操作人员的熟练程度要求高；免疫检测法特异性和灵敏性高，但前期制备抗体过程复杂，成本和技术要求都较高；所以上述方法都不适合快速、连续的Nisin生产过程，更无法在Nisin的应用企业中推广使用。
高效液相色谱简单易操作，精确度高，应用范围广，已在各行业中逐渐普及。应用高效液相色谱检测Nisin的方法也有报道，但多为梯度洗脱法(CN200910045204.6)或质谱联用法(分析测试学报2018，Vol.37，No.7，鲜湿米粉中两种乳酸链球菌素的HPLC-MS/MS检测方法)，检测周期和检测成本仍限制其普遍适用性。
发明内容
本发明为了解决上述现有技术中存在的问题，提供了一种用高效液相色谱检测乳酸链球菌素含量的方法，本方法准确、快速、简便、易推广，适用于生产过程和最终产品的检测。
本发明采用的具体技术方案是：
一种用高效液相色谱检测乳酸链球菌素的方法，关键是：包括以下步骤：
a、制备乳酸链球菌素标准溶液：称取乳酸链球菌素标准品20-250mg，用0.02mol/L稀盐酸溶解定容，得到浓度为2000-15000IU/mL的标准溶液，用微孔滤膜过滤；
b、制备乳酸链球菌素样品溶液：其中发酵样品用盐酸酸化后，沸水浴加热，冷却后离心，取上清液用微孔滤膜过滤；提取预处理样品和菌渣等带渣样品直接离心后取上清液用微孔滤膜过滤，澄清样品和浓缩样品需根据预估效价用稀盐酸稀释至15000IU/mL以下再用微孔滤膜过滤；固体样品需用稀盐酸溶解并稀释至2000-15000IU/mL范围内再用微孔滤膜过滤；
c、使用高效液相色谱进行检测：将乳酸链球菌素标准溶液与样品溶液分别注入高效液相色谱仪，色谱条件如下：
流动相：28％-34％乙腈(V/V)，含0.03％-0.07％三氟乙酸，等度洗脱；
液相色谱仪：带紫外检测器或二极管阵列检测器；
色谱柱：4.6*250mm C18色谱柱或4.6*150mm C18色谱柱；
柱温：25-35℃；
进样量：5-50μL；
波长：205-225nm；
流速：0.9-1.1mL/min；
运行时间：15-35min；
d、记录峰面积，采用外标法计算样品中乳酸链球菌素的含量。
所述乳酸链球菌素标准溶液的浓度为2000-15000IU/mL，所用溶剂为0.02mol/L盐酸溶液。
所述样品溶液的制备方法为：
发酵样品用3-10mol/L的盐酸酸化至pH为1.8-2.5后，沸水浴加热3-15min，冷却至室温后于3000-10000r/min离心5-30min，取上清液用微孔滤膜过滤；
提取预处理样品和菌渣等带渣样品直接于3000-10000r/min离心5-30min后取上清液用微孔滤膜过滤，澄清样品和浓缩样品根据预估效价用0.02mol/L盐酸稀释至15000IU/mL以下再用微孔滤膜过滤；固体样品用0.02mol/L盐酸溶解并稀释至2000-15000IU/mL范围内再用微孔滤膜过滤。
所述流动相为28％-34％乙腈(V/V)，含0.03％-0.07％三氟乙酸，洗脱方式为等度洗脱。
所述检测器为紫外检测器或二极管阵列检测器。
所述色谱柱为4.6*250mm C18色谱柱或4.6*150mm C18色谱柱。
所述柱温为25-35℃，进样量为5-50μL。
所述波长为205-225nm，流速为0.9-1.1mL/min，运行时间为15-35min。
本发明的有益效果是：本方法利用高效液相色谱检测乳酸链球菌素含量，分离分析效果好，准确度高，加标回收率96.5％-100.8％；重复性和专属性好，精密度RSD≤1.5％；检测效率高，运行时间15-35min；且操作条件简单易推广，Nisin的生产企业和应用企业都可采用。
附图说明
图1为实施例1的标准溶液色谱图。
图2为实施例5的发酵液样品色谱图。
图3为实施例3的标准曲线图。
图4为实施例4的检出限浓度色谱图。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步说明：
实施例1
色谱条件：
色谱柱：C18 5.0μm 4.6*250mm 柱温：32℃
进样量：20μL 流速：1.1mL/min
检测器：二极管阵列检测器 波长：207nm
流动相：31％乙腈(V/V)，含0.05％三氟乙酸
a、制备乳酸链球菌素标准溶液：精密称取乳酸链球菌素标准品100mg，用0.02mol/L盐酸溶液定容于25mL容量瓶中，超声溶解，摇匀，用微孔滤膜过滤；
b、制备发酵液样品溶液：样品用6mol/L的盐酸酸化至pH为2.0后，沸水浴加热5min，冷却至室温后于3000r/min离心30min，取上清液用微孔滤膜过滤；
c、测定：将标准溶液和样品溶液分别注入液相色谱仪，进行分离测定；标准溶液平行进样3次，样品溶液各进样1次，记录色谱图25min。
d、结果计算：按外标法计算出样品中乳酸链球菌素的含量：
校正因子
样品中乳酸链球菌素的效价(IU/mL)＝F×A样×n＝5063IU/mL。
实施例2：
色谱条件：
色谱柱：C18 5.0μm 4.6*150mm 柱温：28℃
进样量：5μL 流速：0.9mL/min
检测器：紫外检测器 波长：205nm
流动相：34％乙腈(V/V)，含0.07％三氟乙酸
a、制备乳酸链球菌素标准溶液：精密称取乳酸链球菌素标准品150mg，用0.02mol/L盐酸溶液定容于10mL容量瓶中，超声溶解，摇匀，用微孔滤膜过滤；
b、制备提取浓缩液样品溶液：浓缩液样品用0.02mol/L盐酸溶液稀释5倍后用微孔滤膜过滤；
c、测定：将标准溶液和样品溶液分别注入液相色谱仪，进行分离测定；标准溶液平行进样3次，样品溶液各进样1次，记录色谱图35min。
d、结果计算：按外标法计算出样品中乳酸链球菌素的含量：
校正因子
样品中乳酸链球菌素的效价(IU/mL)＝F×A样×n＝58427IU/mL。
实施例3：
色谱条件：
色谱柱：C18 5.0μm 4.6*250mm 柱温：35℃
进样量：10μL 流速：1.0mL/min
检测器：二极管阵列检测器 波长：215nm
流动相：30％乙腈(V/V)，含0.03％三氟乙酸
a、制备乳酸链球菌素标准溶液：精密称取乳酸链球菌素标准品80mg，用0.02mol/L盐酸溶液定容于10mL容量瓶中，超声溶解，摇匀，用微孔滤膜过滤；
b、制备固体样品溶液：精密称取乳酸链球菌素产品80mg，用0.02mol/L盐酸溶液定容于10mL容量瓶中，超声溶解，摇匀，用微孔滤膜过滤；
c、测定：将标准溶液和样品溶液分别注入液相色谱仪，进行分离测定；标准溶液平行进样3次，样品溶液各进样1次，记录色谱图15min。
d、结果计算：按外标法计算出样品中乳酸链球菌素的含量：
校正因子
样品中乳酸链球菌素的效价(IU/mg)＝F×A样×n＝963IU/mg。
实施例4：
色谱条件：
色谱柱：C18 5.0μm 4.6*150mm 柱温：30℃
进样量：50μL 流速：1.1mL/min
检测器：紫外检测器 波长：220nm
流动相：28％乙腈(V/V)，含0.05％三氟乙酸
a、制备乳酸链球菌素标准溶液：精密称取乳酸链球菌素标准品20mg，用0.02mol/L盐酸溶液定容于10mL容量瓶中，超声溶解，摇匀，用微孔滤膜过滤；
b、制备发酵液样品溶液：样品用10mol/L的盐酸酸化至pH为1.8后，沸水浴加热3min，冷却至室温后于10000r/min离心5min，取上清液用微孔滤膜过滤；
c、测定：将标准溶液和样品溶液分别注入液相色谱仪，进行分离测定；标准溶液平行进样3次，样品溶液各进样1次，记录色谱图20min。
d、结果计算：按外标法计算出样品中乳酸链球菌素的含量：
校正因子
样品中乳酸链球菌素的效价(IU/mL)＝F×A样×n＝2158IU/mL。
实施例5：
色谱条件：
色谱柱：C18 5.0μm 4.6*150mm 柱温：25℃
进样量：30μL 流速：1.0mL/min
检测器：二极管阵列检测器 波长：225nm
流动相：32％乙腈(V/V)，含0.05％三氟乙酸
a、制备乳酸链球菌素标准溶液：精密称取乳酸链球菌素标准品250mg，用0.02mol/L盐酸溶液定容于25mL容量瓶中，超声溶解，摇匀，用微孔滤膜过滤；
b、制备发酵液样品溶液：样品用3mol/L的盐酸酸化至pH为2.5后，沸水浴加热15min，冷却至室温后于5000r/min离心20min，取上清液用微孔滤膜过滤；
c、测定：将标准溶液和样品溶液分别注入液相色谱仪，进行分离测定；标准溶液平行进样3次，样品溶液各进样1次，记录色谱图25min。
d、结果计算：按外标法计算出样品中乳酸链球菌素的含量：
校正因子
样品中乳酸链球菌素的效价(IU/mL)＝F×A样×n＝10358IU/mL。
(一)通过方法学验证，证明了本发明的有益效果是：本方法利用高效液相色谱检测乳酸链球菌素含量，系统适用性、专属性、线性、精密度、准确度、检出限和定量限及稳定性、耐用性等验证项目的验证参数都达到了检测要求。
(1)在所述条件下连续5次进样标准溶液，主峰面积RSD<2.0％，主峰保留时间RSD<1.0％；主峰与相邻峰分离度R>1.5，达到基线分离；主峰对称因子f在0.9-1.1范围内，对称性良好；理论塔板数N>3000。如图1所示，主峰的分离度R为2.45，对称因子f为1.01，理论塔板数N为3795。
(2)发酵液样品色谱图中目标峰与前后杂质峰都能分离，证明发酵培养基和副产物等成分峰对目标峰无干扰，专属性好。如图2所示。
(3)在520-20797IU/mL效价范围内得到线性回归方程为：y＝0.004x+0.1734，线性相关系数R2为0.9999，大于0.999，证明效价与峰面积线性关系良好。如图3所示。
(4)样品加标回收率为96.5％-100.8％，重复性和中间精密度RSD<2.0％，证明方法的准确度和精密度较高。
(5)方法的检出限为111IU/mL；定量限为315IU/mL，证明方法的灵敏度较高。
(6)柱温、柱长、流速、检测波长、流动相比例和加酸量在所述范围内改变时，系统适用性参数都能达到药典要求，检测结果也无明显变化，说明该方法的耐用性较好，操作条件温和易控、不苛刻。
(二)与国标的琼脂扩散法相比，本发明最突出的有益效果是检测效率高，运行时间仅15-35min(国标法需24-36小时)；检测干扰因素少，发酵样品、提取过程样品和成品都适用；且操作条件简单易推广，Nisin的生产企业和应用企业都可采用；具有快速、准确、简便、稳定的优势。
同时，为了与法定检测方法对标，将本方法与国标的琼脂扩散法进行了多批样品的对比检测，结果得到二者的对应关系：提取阶段样品(包括固体和液体)生物效价与液相效价的平均比值为1.07(对比样品数量n＝15)；发酵样品生物效价与液相效价的平均比值为0.91(对比样品数量n＝20)。由此，通过测定液相效价即可计算出样品的生物效价，偏差在10％以内。
(三)与文献报道的其他液相检测方法相比，本发明的有益效果在于检测成本低，更具通用性。本发明所述方法使用紫外检测器或二极管阵列检测器，比质谱检测器(刘珈伶等.鲜湿米粉中两种乳酸链球菌素的HPLC-MS/MS检测方法[J].分析测试学报，2018，37(7):820-824)成本低约60万元；使用等度洗脱，与梯度洗脱方法(高彩红等.高效液相色谱仪法检测食品中防腐剂——乳酸链球菌素[J].农业科技与装备，2011，203(5):26-28)相比，仪器由双泵运行改为单泵运行，直接降低了仪器配置要求和仪器成本(一台泵价格5-10万元)；同时，等度洗脱只需配制单相流动相，简化了流动相配制步骤，提高了工作效率；而且无盐体系、等度洗脱比缓冲盐体系(胡小立等.肉类工业，2019，(4):43-48)和梯度洗脱减少了平衡时间，检测效率翻倍，且仪器运行更稳定；最主要的是，无盐体系、等度洗脱、单泵运行可明显降低基线噪声，分离、分析效果更好，并提高检测灵敏度。如图4所示，检出限低至111IU/mL，且基线平稳。
以上实施例只是用来说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于此。
Claims (8)
1.一种用高效液相色谱检测乳酸链球菌素的方法，其特征在于：包括以下步骤：
a、制备乳酸链球菌素标准溶液：称取乳酸链球菌素标准品20-250mg，用0.02mol/L稀盐酸溶解定容，得到浓度为2000-15000IU/mL的标准溶液，用微孔滤膜过滤；
b、制备乳酸链球菌素样品溶液：其中发酵样品用盐酸酸化后，沸水浴加热，冷却后离心，取上清液用微孔滤膜过滤；提取预处理样品和菌渣等带渣样品直接离心后取上清液用微孔滤膜过滤，澄清样品和浓缩样品需根据预估效价用稀盐酸稀释至15000IU/mL以下再用微孔滤膜过滤；固体样品需用稀盐酸溶解并稀释至2000-15000IU/mL范围内再用微孔滤膜过滤；
c、使用高效液相色谱进行检测：将乳酸链球菌素标准溶液与样品溶液分别注入高效液相色谱仪，色谱条件如下：
流动相：28％-34％乙腈(V/V)，含0.03％-0.07％三氟乙酸，等度洗脱；
液相色谱仪：带紫外检测器或二极管阵列检测器；
色谱柱：4.6*250mm C18色谱柱或4.6*150mm C18色谱柱；
柱温：25-35℃；
进样量：5-50μL；
波长：205-225nm；
流速：0.9-1.1mL/min；
运行时间：15-35min；
d、记录峰面积，采用外标法计算样品中乳酸链球菌素的含量。
2.根据权利要求1所述的一种用高效液相色谱检测乳酸链球菌素的方法，其特征在于：所述乳酸链球菌素标准品的称取质量为20-250mg，标准溶液的浓度为2000-15000IU/mL，所用溶剂为0.02mol/L盐酸溶液。
3.根据权利要求1所述的一种用高效液相色谱检测乳酸链球菌素的方法，其特征在于：所述样品溶液的制备方法为：
发酵样品用3-10mol/L的盐酸酸化至pH为1.8-2.5后，沸水浴加热3-15min，冷却至室温后于3000-10000r/min离心5-30min，取上清液用微孔滤膜过滤；
提取预处理样品和菌渣等带渣样品直接于3000-10000r/min离心5-30min后取上清液用微孔滤膜过滤，澄清样品和浓缩样品根据预估效价用0.02mol/L盐酸稀释至15000IU/mL以下再用微孔滤膜过滤；固体样品用0.02mol/L盐酸溶解并稀释至2000-15000IU/mL范围内再用微孔滤膜过滤。
4.根据权利要求1所述的一种用高效液相色谱检测乳酸链球菌素的方法，其特征在于：所述流动相为28％-34％乙腈(V/V)，含0.03％-0.07％三氟乙酸，洗脱方式为等度洗脱。
5.根据权利要求1所述的一种用高效液相色谱检测乳酸链球菌素的方法，其特征在于：所述检测器为紫外检测器或二极管阵列检测器。
6.根据权利要求1所述的一种用高效液相色谱检测乳酸链球菌素的方法，其特征在于：所述色谱柱为4.6*250mm C18色谱柱或4.6*150mm C18色谱柱。
7.根据权利要求1所述的一种用高效液相色谱检测乳酸链球菌素的方法，其特征在于：所述柱温为25-35℃，进样量为5-50μL。
8.根据权利要求1所述的一种用高效液相色谱检测乳酸链球菌素的方法，其特征在于：所述波长为205-225nm，流速为0.9-1.1mL/min，运行时间为15-35min。
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Citations (2)
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| US5173297A (en) * | 1991-07-01 | 1992-12-22 | Quest International Flavors & Food Ingredients Company Division Of Indopco, Inc. | Bacteriocin from lactococcus lactis subspecies lactis |
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