CN1121112A - 一种由核糖核酸连续酶水解制5′一核苷酸的方法 - Google Patents

Abstract

一种由核糖核酸连续酶水解制5′-核苷酸的方法，其特征在于：将核酸酶首先注入超滤膜反应器；再连续泵入RNA缓冲液，保持温度60～70℃，泵入速度0.5～1.5ml/min；收集渗透液并经分离、浓缩、结晶，得到5′-核苷酸产品。本发明能连续生产，操作方便，成本低，水解率高。

Description

一种由核糖核酸连续酶水解制5′-核苷酸的方法

本发明涉及生物化学和生物化学工程领域，具体地说是核糖核酸的水解反应。

核糖核酸(简称RNA)是一种生命物质，其分解产物5′-核苷酸可作为食品增解剂，医药中间体、生物化学试剂等，在食品工业，医药和生化领域有广泛的应用。

目前一般采用核酸酶P₁水解RNA来制备5′-核苷酸，即在间歇式反应釜中将核酸酶P₁和RNA缓冲溶液混和，在加温情况下搅拌水解，经较长时间水解后，再用沉淀剂将酶P₁和RNA沉淀使5′-核苷酸分离出来，或采用超滤膜将5′-核苷酸与RNA和酶P₁分离，将分离后的5′-核苷酸经离子交换树脂柱分离，浓缩、结晶，即得到5′-腺苷酸，5′-乌苷酸，5′-胞苷酸和5′-尿苷酸。Enzyme Engineering，3，469-475，1975报道了一种固定化核酸酶P₁填充柱连续水解RNA技术，但由于该酶填充柱的制备成本高，制备过程复杂，长时间使用活性下降等限制了其使用。

本发明的目的在于提供一种RNA的酶水解方法，能够连续生产，操作方便，低成本，高水解率，水解和分离同步进行。

本发明提供了一种由核糖核酸连续酶水解制5′-核苷酸的方法，其特征在于：在水解过程中使用了超滤膜反应器，工艺过程如下：

——将核酸酶P₁注入膜反应器(5)的反应腔中，其中核酸酶P₁的浓度为100～10,000μ/ml，反应器的膜采用聚砜超滤膜，膜截留分子量为5000～10,000；

——保持膜反应器(5)温度在60～70℃，并连续泵入浓度为1～10％的RNA醋酸缓冲液，其PH＝5.0～6.0，缓冲液中还含有0.01～0.1mM的ZnSO₄，泵入速度在0.5～1.5ml/min之间；

——收集渗透液分离、浓缩、结晶，最终得到5′-胞苷酸，5′-乌苷酸，5′-腺苷酸和5′-尿苷酸。

采用的膜反应器可以是中空纤维膜反应器，板式叠法膜反应器，卷式膜反应器等，可以将1～100个一到三种膜反应器串联使用。

在经长时间使用后，操作压力升高，即说明有部分膜孔堵塞，可进行下述处理以重复使用：

——用缓冲液反冲洗膜反应器(5)，冲洗液收集于储瓶(8)中；

——将膜反应器用醇类溶剂浸泡5～20分钟；

——用蒸馏水冲洗干净。

再重新将原料和酶液注回膜反应器即可继续工作，酶活力几乎不降低，所使用的醇类溶剂最好为乙醇溶液。

本发明将酶水解反应和产物分离过程同步进行，而酶可连续长时间使用，从而使单位酶活的水解量大大提高，酶损失少，水解水平均可达到80％以上，多个膜反应器串联使用，平均水解量可达90％。酶在使用中无需固定化，因而成本也大大降低，操作简单方便。

下面结合附图和实施例作进一步说明。

附图1超滤膜反应器中RNA酶水解流程图

其中(1)酶储瓶；(2)RNA缓冲液储瓶；(3)蠕动泵；(4)流量计；(5)膜反应器；(6)5′-核苷酸储瓶；(7)压力表；(8)储瓶；(9)阀门。

实施例1

在一单组件聚砜中空纤维超滤膜玻璃反应器中(中空纤维膜外径d_外＝0.96mm，内径d_内＝0.76mm，膜有效面积计算值≈0.01m²，膜截留分子量为5,000，膜反应器容积为30ml)。向膜外加入核酸酶P₁(由桔青霉发酵得到，系日本天野制药(株)产品，分子量为45,000)溶液后，用蠕动泵连续泵入2％RNA缓冲溶液(含0.125M乙酸一乙酸钠，PH＝5.6，含0.1mMZnSO₄，RNA的平均分子量为100,000)，起始酶浓度为2000μ/ml，控制RNA水解温度65℃，RNA溶液泵入速度1ml/min，膜反应器操作压力不超过0.3Kg/cm²，水解溶液经中空纤维内径透出，反应初期(～30h)透出量接近1ml/min，随着水解反应时间的延续，操作压力逐渐升高至0.3Kg/cm²，透出速度开始减慢时(～60h)，为使操作压力不超过0.3Kg/cm²，开始由膜外分流很小一部分水解溶液，至透出速度降至0.7～0.8ml/min时(～72h)，表明超沪膜已有部分堵塞，则停止水解反应，将反应液放入一储瓶中，并以缓冲液反冲洗膜反应器，冲洗液亦收集于储瓶中。将膜反应器用乙醇溶液浸泡10分钟，用蒸馏水冲洗干净，可再开始RNA水解反应。先将储瓶中的反应液(可补充少量流失的酶)先泵入膜反应器中，再连续泵入RNA缓冲溶液，缓持第一轮的控制条件，60h内RNA的平均水解率为80％，流出液的酶活力为4.5μ/ml，酶的流失比为1/500，流出液中RNA的含量为原料RNA的1/100，(可能是因为含有未彻底水解的小分子RNA)。第二轮RNA水解反应，可维持第一轮RNA水解的水解率水平。

透出液经弱碱性阴离子交换树脂层板柱分离、浓缩、结晶，得到5′-腺苷酸(26.8％)，5′-岛苷酸(32.2％)，5′-胞苷酸(20.8％)和5′-尿苷酸(20.2％)。

实施例2

将两个单组件聚砜中空纤维超沪膜反应器串联在一起，第一个反应器的流出液接第二个反应器的RNA溶液入口，第一个反应器的膜截留分子量为10,000，第二个反应器的膜截留分子量为5,000，每个膜反应器的容积为15ml，起始酶浓度为2,0000μ/ml，连续泵入2％RNA缓冲溶液，控制泵入速度1ml/min，压力不超过0.3Kg/cm²，RNA水解温度65℃，水解溶液透出膜的速度接近1ml/min，操作方法同实施例1。30h内，经过第一个膜反应器的RNA平均水解率为75％，经过第二个膜反应器的RNA平均水解率达90％。

比较例1

在一玻璃反应器中，加核酸酶P₁100ml(2,000μ/ml)，加2％RNA缓冲溶液1000ml(含0.125M)乙酸—乙酸钠，PH＝5.6，含01mMZnSO₄)，于65℃进行水解反应，30min后RNA水解率为30％，3小时后RNA的水解率才达80％。用沉淀剂将酶和RNA沉淀，使与5′-核苷酸溶液分离。

Claims (4)

1.一种由核糖核酸连续酶水解制5′-核苷酸的方法，其特征在于：在水解过程中使用了超滤膜反应器，工艺过程如下：

——将核酸酶P₁注入膜反应器(5)的反应腔中，其中核酸酶P₁的浓度为100～10,000μ/ml，反应器的膜采用聚砜超滤膜，膜截留分子量为5000～10,000；

——保持膜反应器(5)温度在60～70℃，并连续泵入浓度为1～10％的RNA酯酸缓冲液，其PH＝5.0～6.0，缓冲液中还含有0.01～0.1mM的ZnSO₄，泵入速度在0.5～1.5ml/min之间；

——收集渗透液分离、浓缩、结晶，最终得到5′-胞苷酸，5′-乌苷酸，5′-腺苷酸和5′-尿苷酸。

2.按权利要求1所述由核糖核酸水解制5′-核苷酸的方法，其特征在于：采用的膜反应器可以是中空纤维膜反应器，板式叠法膜反应器，卷式膜反应器等，可以将1～100个一到三种膜反应器串联使用。

3.按权利要求1，2所述由核糖核酸水解制5′-核苷酸的方法，其特征在于：当膜反应器(5)中超滤膜已有部分堵塞时，可进行下述处理以重复使用：

——用缓冲液反冲洗膜反应器(5)，冲洗液收集于储瓶(8)中；

——将膜反应器用醇类溶剂浸泡5～20分钟；

——用蒸馏水冲洗干净。

4.按权利要求1所述由核糖核酸水解制5′-核苷酸的方法，其特征在于：所使用的醇类溶剂最好为乙醇溶液。