CN112107697A - 一种利用斑马鱼模型评价抗氧化和淡斑亮肤功效的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于检测技术领域。本发明公开了一种利用斑马鱼模型评价抗氧化和淡斑亮肤功效的方法，利用受精后3天内的斑马鱼进行体外实验，采用甲萘醌作为造模剂，使用氧化应激试剂作为染料，实验终点为受精后第4天；采集斑马鱼卵黄囊的荧光照片和白光照片作为数据采集，利用卵黄囊荧光强度即软件参数明亮度总和（B）用于评价抗氧化功效，利用卵黄囊色素强度即软件参数不透明度总和（O）用于评价淡斑亮肤功效。本发明首次利用甲萘醌建立斑马鱼抗氧化和淡斑亮肤功效评价；建立了既可以评价口服保健食品又可以评价涂抹化妆品抗氧化和淡斑亮肤功效且符合替代原则的动物模型；实验周期短，1‑2天完成功效评价，可批量筛选配方。
Description
技术领域
本发明属于检测技术领域，尤其是涉及一种利用斑马鱼模型评价抗氧化和淡斑亮肤功效的方法。
背景技术
从1986年英国部分禁止化妆品动物实验，到今天欧盟、巴西、挪威、土耳其、韩国、印度、新西兰和以色列等国家和地区禁止用动物评价化妆品的功效。化妆品功效评价主要应用体外实验和斑马鱼幼鱼(受精后5天内的斑马鱼由于不需要进食，被认为是可以接受的)进行替代实验。
在中国护肤类的化妆品中，美白功效备受关注。美白机制分为以下7类：1.酪氨酸酶活性抑制剂；2.黑色素细胞毒性剂；3.影响黑色素代谢剂；4.遮光剂(防晒剂)；5.还原剂；6.化学剥脱剂；7.内皮素拮抗剂。现有化妆品美白功效评价方法主要有以下几种：1.体外检测酪氨酸酶抑制作用；2.DPPH/ORAC/ABTS/FRAP抗氧化测试；3.羟自由基检测；4.小鼠黑色素细胞抑制实验；5.人黑色素细胞抑制实验；6.抑制人黑色素转移实验；7.斑马鱼黑色素面积、黑色素含量、酪氨酸酶活性测定。已有斑马鱼专利报道用Franz透皮扩散池37℃8h，透皮液作用于斑马鱼，评价斑马鱼黑色素总面积(CN104977399A-一种检测美白成分安全性和有效性的方法)。
已有临床文献报道黄褐斑、老年斑均与超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性降低，脂质过氧化物(LPO)和丙二醛(MDA)含量增高，最终导致脂褐质积累相关(杨多，2007；吴艳华，2006；查元坤，1997)。
已有文献报道甲萘醌(维生素K3)能够诱发斑马鱼氧化应激，能够通过检测斑马鱼血管内过氧化氢的累积量(Catherine L.2012)和氧自由的荧光强度(EmilianoPanieri.2017)来反映斑马鱼体内氧化应激的程度。Carlos Barata，2005)。另有文献报道甲萘醌能诱导大型溞氧化应激，谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、谷胱甘肽S转移酶(GST)、过氧化氢酶(CAT)和脂质过氧化物都有明显的变化。尽管甲萘醌诱导氧化应激已有成熟的报道，但对是否能模拟形成黄褐斑、老年斑等色素代谢障碍尚未见报道。
现有技术存在以下缺陷：
1.现有检测方法表明美白评价方法集中在酪氨酸酶活性抑制剂、还原剂和影响黑色素代谢剂，并没有可用于评价改善黄褐斑、老年斑等色素代谢障碍功效的方法；
2.体外检测缺乏吸收、分布、代谢和排泄的过程，无法准确预测改善色素代谢障碍的供试品在人体是否真正有效，也无法预测在体内代谢后代谢产物具有改善色素代谢障碍功效的供试品；
3.体外检测不具备可视化的优势，展现形式不直观，不利于化妆品和保健食品的宣传推广；
4.可用于替代实验的色素代谢障碍动物模型尚未建立；
5.人体实验周期较长，不利于大批量的供试品功效评价，尤其不适用于早期的配方筛选。
发明内容
本发明的目的在于建立评价淡斑亮肤(改善色素代谢障碍)功效的替代的体内模型，提供可视化的图片，便于化妆品和保健食品的宣传推广，建立可批量筛选配方的体内模型；本发明提供了一种利用斑马鱼模型评价抗氧化和淡斑亮肤功效的方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种利用斑马鱼模型评价抗氧化和淡斑亮肤功效的方法，包括以下步骤：
a)设置模型对照组、正常对照组与供试品组；
b)将上述各组中的斑马鱼经过洗脱处理，然后进行荧光染色处理，染色结束后再次进行洗脱；
c)采集斑马鱼鱼卵黄囊的荧光照片和白光照片；
d)针对上述采集到的斑马鱼卵黄囊的荧光照片和白光照片，
采集卵黄荧光强度B，用于评价抗氧化功效，所述评价抗氧化功效的公式为：
采集卵黄囊色素强度O，用于评价淡斑亮肤功效，所述评价淡斑亮肤功效的公式为：
所述的供试品组由以下方法制得，先用甲萘醌溶液处理受精后3天以内的斑马鱼，处理时间为1-24小时；再将经上述处理后的斑马鱼用待测保健食品或化妆品处理，处理时间为20-28小时；
所述模型对照组为经甲萘醌溶液处理后的斑马鱼，所述正常对照组为经标准稀释水处理后的斑马鱼。
作为优选，甲萘醌溶液的浓度为1-25μM，用二甲基亚砜配制；斑马鱼为黑色素等位基因突变Albino品系斑马鱼。
作为优选，步骤a)中，每组选用30尾斑马鱼，在6孔板中定容3mL处理。
作为优选，步骤b)中，洗脱时采用标准稀释水进行洗脱，并且至少洗脱两次，所述荧光染色处理时采用氧化应激试剂进行荧光染色。
作为优选，步骤b)中，荧光染色处理时将斑马鱼移至24孔板，用终浓度为2.5μM的氧化应激试剂1mL定容，避光25-30℃染色1.5小时。
作为优选，氧化应激试剂为
氧化应激试剂。
作为优选，步骤c)中，在绿色荧光条件下，采集斑马鱼卵黄囊的荧光照片；在白光条件下，采集斑马鱼卵黄囊的白光照片。
作为优选，模型对照组、正常对照组与供试品组的设置必须在斑马鱼受精后4天以内完成。
因此，本发明具有以下有益效果：
(1)首次利用甲萘醌建立斑马鱼抗氧化和淡斑亮肤功效评价；
(2)建立了既可以评价口服保健食品又可以评价涂抹化妆品抗氧化和淡斑亮肤功效且符合替代原则的动物模型；
(3)实验周期短，1-2天完成功效评价，可批量筛选配方。
附图说明
图1为华信牌硒尔康胶囊和金日牌心源素胶囊处理后斑马鱼表型图，虚线为数据分析区域；
图2为唐巢蜂胶胶囊处理后斑马鱼表型图，虚线为数据分析区域；
图3为唾液酸处理后斑马鱼表型图，虚线为数据分析区域；
图4为悦木之源韦博士灵芝焕能精华爽肤水菌菇水(以下简称菌菇水)处理后斑马鱼表型图，虚线为数据分析区域；
图5为雪花秀润颜乳处理后斑马鱼表型图，虚线为数据分析区域。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步的说明。
显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
1.实验动物
黑色素等位基因突变Albino品系斑马鱼，受精后1-3天(dpf)，每个实验组30尾。
2.主要仪器和试剂
解剖显微镜(SZX7，OLYMPUS，Japan)；精密电子天平(CP214，OHAUS，China)；6孔板(Fisher scientific，China)；24孔板(Nest Biotech，China)；电动聚焦连续变倍荧光显微镜(AZ100，Nikon，Japan)。
甲萘醌，淡黄色粉末，货号M104154，购自阿拉丁试剂(上海)有限公司；CellROX，无色透明液体，货号C10444，购自Thermofisher公司。
3.实验方法
3.1斑马鱼背景：
3.1.1、斑马鱼是脊椎动物，与人基因相似度高达87％。斑马鱼的消化系统由肝脏、胆囊和肠组成，肝和肠细胞的分化与人类高度保守；食欲调节(如血清素)和胰岛素调节功能保守；消化和营养物质的吸收以及运输与人类高度相似；拥有新陈代谢的关键器官(如下丘脑回路、胰腺和胰岛素反应组织，白色脂肪组织、肝脏和肌肉)(Marta Carnovali，2017；Kathrin Landgraf，2017；Liqing Zang，2018；Vanessa H.Quinlivan，2017)。因此，斑马鱼服用保健食品后评价其功效，具有较高的预测性。
3.1.2、斑马鱼皮肤结构与功能与人类高度相似。含有基底层(stratum basale)、棘层(stratum spinosum)、颗粒层(stratum granulosum)、透明层(lamina lucia)和表皮角质细胞层(Cuticle-keratinocytes)；另外尚有与人皮肤结构相同的固有层(laminadensa)、半桥粒(hemidesmosomes)、黑色素细胞(melanocytes)、血管(blood vessels)和皮下脂肪细胞(adipocyte)等。斑马鱼皮肤间质结缔组织、胶原及其临近的纤维母细胞及皮肤基因表达与人类皮肤相似。斑马鱼已获得广泛认可研究皮肤病变包括遗传病、色素异常、炎症、牛皮鲜、损伤修复、黑色素瘤等(Abigail Cline，2016；Qiaoli Li，2014；Qiaoli Li，2011；Wei-Jen Chang，2014；Dominique Le Guellec，2004)。因此，斑马鱼模型评价人用化妆品功效也具有较好的预测性。
3.2原理：
3.2.1造模剂原理：甲萘醌，是一种氧化剂。细胞内的氧化还原系统包括微粒体的P450还原酶和线粒体的呼吸链还原酶进行单电子反应代谢甲萘醌，产生不稳定的半醌，进入氧化还原循环，产生活性氧族。
3.2.2染料原理：
绿色试剂是一种DNA染料，具有细胞通透性，原本无荧光或者在还原状态荧光非常弱，氧化后与DNA结合，发出荧光信号。它的信号主要定位在细胞核和线粒体中。
氧化应激试剂产生的荧光可通过传统荧光显微镜、高含量成像和分析、微板荧光测定法或流式细胞仪检测。
3.2.3用鱼阶段：受精后3天(3dpf)和3dpf前斑马鱼化合物吸收只经过皮肤；4dpf和之后化合物吸收通过皮肤和肠道(Zhang，2015)。因此，化妆品功效评价的造模阶段为1-2dpf，实验终点在4dpf之前即可。由于该方法需要定量斑马鱼卵黄囊部位，而5dpf的斑马鱼卵黄囊几乎吸收完全。因此，保健食品功效评价的造模阶段为3dpf，实验终点必须在4dpf。
3.2.4保健食品处理方法：用甲萘醌(1-25μM)处理3dpf黑色素等位基因突变Albino品系斑马鱼1-24小时，每组30尾，6孔板定容3mL，建立斑马鱼保健食品淡斑亮肤(改善色素代谢障碍)模型。同时在6孔板中加入保健食品相应的浓度，保健食品的处理时长维持24小时。实验终点为4dpf。
3.2.5化妆品处理方法：用甲萘醌(1-25μM)处理1-2dpf黑色素等位基因突变Albino品系斑马鱼1-24小时，每组30尾，6孔板定容3mL，建立斑马鱼化妆品淡斑亮肤(改善色素代谢障碍)模型。同时在6孔板中加入化妆品相应的浓度，化妆品的处理时长维持24小时。实验终点为2-3dpf。
3.2.6染色方法：实验结束前，将斑马鱼用标准稀释水洗脱2遍，70转/分钟。洗脱结束，将斑马鱼从6孔板转入24孔板，用终浓度为2.5μM的
1mL定容，避光25-30℃染色1.5小时。染色结束，再用标准稀释水洗脱2遍。
3.2.7数据采集：1、在绿色荧光条件下，采集斑马鱼卵黄囊的荧光照片。2、在白光条件下，采集斑马鱼卵黄囊的白光照片。
3.2.8数据分析：用尼康NIS-Elements D 4.30.00高级图像处理软件分析；
1)采集卵黄囊荧光强度即软件参数明亮度总和(B)用于评价抗氧化功效，评价公式如下：
2)采集卵黄囊色素强度即软件参数不透明度总和(O)用于评价淡斑亮肤功效，评价公式如下：
两组间用T检验，多组间用ANOVA分析，以P<0.05为差异有显著性。
4.实验
4.1模型确定依据
4.1.1.甲萘醌设置一系列浓度作用于1dpf黑色素等位基因突变Albino品系斑马鱼，诱导1小时，1小时后移除甲萘醌，2dpf观察斑马鱼死亡和表型情况。
表1.1dpf斑马鱼甲萘醌处理1小时浓度-毒性反应
4.1.2.甲萘醌设置一系列浓度作用于3dpf黑色素等位基因突变Albino品系斑马鱼，诱导24小时，4dpf观察斑马鱼死亡和表型情况。
表2.3dpf斑马鱼甲萘醌处理24小时浓度-毒性反应
由于色斑代谢障碍与氧自由基含量密切相关，甲萘醌诱导浓度的确定可依据斑马鱼色斑的严重程度而定，不需要再进行
染色。通过多次实验数据表明，甲萘醌诱导的浓度范围在1-25μM，诱导时间在1-24小时。甲萘醌诱导浓度低时，需诱导时间较长；诱导浓度高时，需诱导时间较短。
4.2实验组别
4.2.1.华信牌硒尔康胶囊、金日牌心源素胶囊组抗氧化功效评价实验：
正常对照组：标准稀释水处理；
模型对照组：甲萘醌处理；
华信牌硒尔康胶囊组1：110μg/mL；
华信牌硒尔康胶囊组2：220μg/mL；
华信牌硒尔康胶囊组3：440μg/mL；
金日牌心源素胶囊组1：55μg/mL；
金日牌心源素胶囊组2：110μg/mL；
金日牌心源素胶囊组3：220μg/mL。
4.2.2.唐巢蜂胶囊抗氧化功效评价实验：
正常对照组：标准稀释水处理；
模型对照组：甲萘醌处理；
唐巢蜂胶胶囊组1：0.625μg/mL；
唐巢蜂胶胶囊组2：1.25μg/mL；
唐巢蜂胶胶囊组3：2.5μg/mL；
唐巢蜂胶胶囊组4：5μg/mL；
唐巢蜂胶胶囊组5：10μg/mL。
4.2.3.唾液酸淡斑亮肤功效评价实验：
正常对照组：标准稀释水处理；
模型对照组：甲萘醌处理；
唾液酸组1：25μg/mL；
唾液酸组2：50μg/mL；
唾液酸组3：100μg/mL。
4.2.4.菌菇水淡斑亮肤功效评价实验：
正常对照组：标准稀释水处理；
模型对照组：甲萘醌处理；
菌菇水组1：0.781μL/mL；
菌菇水组2：1.563μL/mL；
菌菇水组3：3.125μL/mL。
4.2.5.雪花秀润颜乳抗氧化功效评价实验：
正常对照组：标准稀释水处理；
模型对照组：甲萘醌处理；
雪花秀润颜乳组1：200μL/mL；
雪花秀润颜乳组2：300μL/mL；
雪花秀润颜乳组3：400μL/mL。
5检测结果
5.1.保健食品：华信牌硒尔康胶囊和金日牌心源素胶囊组抗氧化功效评价实验
模型对照组卵黄囊荧光强度与正常对照组比较明显增强，表明存在大量的氧自由基。服用华信牌硒尔康胶囊、金日牌心源素胶囊1天后，斑马鱼卵黄囊荧光强度明显减弱。表明华信牌硒尔康胶囊和金日牌心源素胶囊具有明显的抗氧化功效。详见图1、表3。
表3.华信牌硒尔康胶囊和金日牌心源素胶囊处理后斑马鱼卵黄囊荧光强度(n＝10)
与模型对照组比较，**p<0.01，***p<0.001。
5.2.保健食品：唐巢蜂胶胶囊抗氧化功效评价实验
模型对照组卵黄囊荧光强度与正常对照组比较明显增强，表明存在大量的氧自由基。服用唐巢蜂胶胶囊1天后，斑马鱼卵黄囊荧光强度明显减弱。表明唐巢蜂胶胶囊具有明显的抗氧化功效。详见图2、表4。
表4.唐巢蜂胶胶囊处理后斑马鱼卵黄囊荧光强度(n＝10)
与模型对照组比较，***p<0.001。
5.3.新食品原料：唾液酸淡斑亮肤功效评价实验
模型对照组卵黄囊色素与正常对照组比较明显增强，呈现黄褐色斑块，表明模型对照组色素代谢障碍。服用唾液酸1天后，斑马鱼卵黄囊色素强度明显减弱、色斑减少。表明唾液酸具有明显的淡斑亮肤功效。详见图3、表5。
表5.唾液酸处理后斑马鱼卵黄囊色素强度(n＝10)
与模型对照组比较，**p<0.01，***p<0.001。
5.4.化妆品：菌菇水淡斑亮肤功效评价实验
模型对照组卵黄囊色素与正常对照组比较明显增强，呈现黄褐色斑块，表明模型对照组色素代谢障碍。涂抹菌菇水1天后，斑马鱼卵黄囊色素强度明显减弱、色斑减少。表明菌菇水具有明显的淡斑亮肤功效。详见图4、表6。
表6.菌菇水处理后斑马鱼卵黄囊色素强度(n＝10)
与模型对照组比较，***p<0.001。
5.5.化妆品：雪花秀润颜乳抗氧化功效评价实验
模型对照组卵黄囊荧光强度与正常对照组比较明显增强，表明存在大量的氧自由基。涂抹雪花秀润颜乳1天后，斑马鱼卵黄囊荧光强度明显减弱。表明雪花秀润颜乳具有明显的抗氧化功效。详见图5、表7。
表7.雪花秀润颜乳处理后斑马鱼卵黄囊荧光强度(n＝10)
与模型对照组比较，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
6.检测结论
在本实验浓度条件下，华信牌硒尔康胶囊、金日牌心源素胶囊、唐巢蜂胶胶囊和雪花秀润颜乳有明显抗氧化功效；唾液酸和菌菇水有明显的淡斑亮肤功效。
应当理解的是，对于本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (8)
1.一种利用斑马鱼模型评价抗氧化和淡斑亮肤功效的方法，其特征在于包括以下步骤：
a)设置模型对照组、正常对照组与供试品组；
b)将上述各组中的斑马鱼经过洗脱处理，然后进行荧光染色处理，染色结束后再次进行洗脱；
c)采集斑马鱼鱼卵黄囊的荧光照片和白光照片；
d)针对上述采集到的斑马鱼卵黄囊的荧光照片和白光照片，
采集卵黄荧光强度B，用于评价抗氧化功效，所述评价抗氧化功效的公式为：
采集卵黄囊色素强度O，用于评价淡斑亮肤功效，所述评价淡斑亮肤功效的公式为：
所述的供试品组由以下方法制得，先用甲萘醌溶液处理受精后3天以内的斑马鱼，处理时间为1-24小时；再将经上述处理后的斑马鱼用待测保健食品或化妆品处理，处理时间为20-28小时；
所述模型对照组为经甲萘醌溶液处理后的斑马鱼，所述正常对照组为经标准稀释水处理后的斑马鱼。
2.根据权利要求1所述的一种利用斑马鱼模型评价抗氧化和淡斑亮肤功效的方法，其特征在于：
所述甲萘醌溶液的浓度为1-25μM；所述的斑马鱼为黑色素等位基因突变Albino品系斑马鱼。
3.根据权利要求1所述的一种利用斑马鱼模型评价抗氧化和淡斑亮肤功效的方法，其特征在于：
所述步骤a)中，每组选用30尾斑马鱼，在6孔板中定容3mL处理。
4.根据权利要求1所述的一种利用斑马鱼模型评价抗氧化和淡斑亮肤功效的方法，其特征在于：
所述步骤b)中，洗脱时采用标准稀释水进行洗脱，并且至少洗脱两次，所述荧光染色处理时采用氧化应激试剂进行荧光染色。
5.根据权利要求1或4所述的一种利用斑马鱼模型评价抗氧化和淡斑亮肤功效的方法，其特征在于：
所述步骤b)中，荧光染色处理时将斑马鱼移至24孔板，用终浓度为2.5μM的氧化应激试剂1mL定容，避光25-30℃染色1.5小时。
6.根据权利要求4所述的一种利用斑马鱼模型评价抗氧化和淡斑亮肤功效的方法，其特征在于：
所述氧化应激试剂为
氧化应激试剂。
7.根据权利要求1所述的一种利用斑马鱼模型评价抗氧化和淡斑亮肤功效的方法，其特征在于：
所述步骤c)中，在绿色荧光条件下，采集斑马鱼卵黄囊的荧光照片；在白光条件下，采集斑马鱼卵黄囊的白光照片。
8.根据权利要求1所述的一种利用斑马鱼模型评价抗氧化和淡斑亮肤功效的方法，其特征在于：
所述模型对照组、正常对照组与供试品组的设置必须在斑马鱼受精后4天以内完成。
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