CN114698572A - D-半乳糖诱导al斑马鱼衰老模型及评价抗衰老功效的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及快速检测技术领域，为解决现有现有技术下抗衰老产品的抗衰老功效的检测时间较长，评价方法较为复杂的问题，公开了D‑半乳糖诱导AL斑马鱼衰老模型及评价抗衰老功效的方法，所述模型为使用D‑半乳糖诱导衰老的AL斑马鱼模型，所述方法包括如下步骤：设置正常组、模型组与供试品组进行孵育，在孵育5‑7天后，将各组斑马鱼清洗固定然后进行β‑半乳糖苷酶染色，用光学显微镜观察并计算斑马鱼的不饱和透明度总和。本发明建立了D‑半乳糖诱导AL斑马鱼衰老模型和使用该模型评价抗衰老产品的抗衰老功效的方法，检测快速并准确，实验结果直观。
Description
技术领域
本发明涉及快速检测技术领域，尤其涉及一种D-半乳糖诱导AL斑马鱼衰老模型及评价抗衰老功效的方法。
背景技术
随着生活水平的改善与科学技术的进步，使人们追求更完美的自我，全球老龄化的加剧也促使抗衰老成为更多人关心的话题。市场上抗衰老产品琳琅满目，护肤品、保健品和食品等均有抗衰老功效的描述，但其实际的抗衰老功效参差不齐。大量假冒的抗衰老产品也出现于市场，这不仅给消费者带来巨大的经济损失，也危害消费者的健康。因此，需要建立一种能快速检测并评价抗衰老产品的抗衰老功效的方法。目前常用的评价抗衰老功效的方法主要为人体功效评价试验或实验室试验，其中实验室试验主要采用非模式动物(体外细胞实验)和模式动物。模式动物存在试验周期短的动物与人的同源性较低，与人的同源性高的模式动物试验周期长，花费较大的问题。
例如，在中国专利文献上公开的“一种基于模式生物秀丽隐杆线虫的抗衰老评价方法与应用”，其公告号为CN107875403A，包括如下步骤：向涂布有大肠杆菌OP50的NGM培养板中加入待测物质，再加入秀丽隐杆线虫培养，观察秀丽隐杆线虫的生存状况。该发明使用秀丽隐杆线虫作为观察对象，通过其寿命、热应激能力、抗紫外辐照能力、抗氧化损伤能力、繁殖力、身体长度以及脂褐素含量评价其衰老情况，评价项目较为复杂。
发明内容
本发明为了克服现有技术下抗衰老产品的抗衰老功效的检测时间较长，评价方法较为复杂的问题，提供一种D-半乳糖诱导AL斑马鱼衰老模型及评价抗衰老功效的方法，该方法建立了斑马鱼衰老模型，通过斑马鱼衰老模型可快速判断抗衰老产品中是否含具有抗衰老和抗活性氧的作用。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种D-半乳糖诱导AL斑马鱼衰老模型，所述模型为使用D-半乳糖诱导衰老的AL斑马鱼模型。
斑马鱼与人类基因同源性高达85％，由于基因组与蛋白质组与人类具有很高的相似性，因此疾病的发病机制和信号传导通路等方面与人类基本近似，且生物结构和生理功能与哺乳动物高度相似。斑马鱼的生长周期短，D-半乳糖诱导可加快斑马鱼的衰老速度。
作为优选，所述D-半乳糖诱导衰老的步骤为使用添加D-半乳糖的养殖用水孵育AL品系斑马鱼鱼卵4-6天，添加D-半乳糖的养殖用水每日更换。
当使用添加D-半乳糖的养殖用水孵育4-6天时，斑马鱼的衰老程度显著高于没有D-半乳糖诱导的斑马鱼。
作为优选，所述AL品系斑马鱼鱼卵为受精后5-7h的AL品系斑马鱼鱼卵。
使用受精后5-7h的AL品系斑马鱼鱼卵造模给药，可提升D-半乳糖对斑马鱼的诱导效果，进而减短检测时间。
作为优选，所述添加D-半乳糖的养殖用水中D-半乳糖的浓度为1.6-25.6mg/mL。
D-半乳糖的浓度在1.6-25.6mg/mL范围内时可诱导斑马鱼衰老同时不会使斑马鱼死亡，D-半乳糖的最佳浓度为25.6mg/mL，该浓度下诱导衰老效果好并且培养6天后斑马鱼的成活率高于90％。
一种使用D-半乳糖诱导AL斑马鱼衰老模型的评价抗衰老功效的方法，包括以下步骤：
1)设置正常组、模型组与供试品组进行孵育；
2)在孵育5-7天后，将各组斑马鱼清洗固定；
3)对固定后的斑马鱼进行β-半乳糖苷酶染色，用光学显微镜观察并计算斑马鱼的不饱和透明度总和。
染色后可通过颜色深度判断各组斑马鱼体内β-半乳糖苷酶的活性，而β-半乳糖苷酶活性升高是细胞衰老的特征之一。斑马鱼鱼卵培育5-7天后成长为幼鱼，其身体透明，可直接观察到其血管内被染色的β-半乳糖苷酶。
作为优选，所述步骤1)中每组各有20-40粒AL品系斑马鱼鱼卵。
作为优选，所述步骤2)中清洗固定步骤为将各组斑马鱼用养殖用水清洗2-3次后，置于4％的细胞固定液中16-18h。
作为优选，所述步骤3)中观察并计算斑马鱼躯干的不饱和透明度总和。
斑马鱼整体器官的染色浓度较深会影响结果判定，各组斑马鱼躯干的染色浓度既可用肉眼观察到各组斑马鱼的染色情况，又可满足有效区分各组斑马鱼的不饱和透明度的要求。
作为优选，所述步骤3)中，当模型组中斑马鱼的不饱和透明度总和显著高于正常组中斑马鱼的不饱和透明度总和，供试品组中斑马鱼的不饱和透明度总和显著低于模型组中斑马鱼的不饱和透明度总和，可认为供试品有抗衰老功效。
模型组中斑马鱼的不饱和透明度总和显著高于正常组中斑马鱼表明本次试验中D-半乳糖成功诱导斑马鱼衰老，而供试品组中斑马鱼的不饱和透明度总和显著低于模型组中斑马鱼表明，供试品抑制了D-半乳糖的诱导衰老作用，即供试品有抗衰老功效。
因此，本发明具有如下有益效果：(1)建立了D-半乳糖诱导AL斑马鱼衰老模型和使用该模型评价抗衰老产品的抗衰老功效的方法；(2)检测快速并准确；(3)实验结果直观。
附图说明
图1是D-半乳糖诱导AL斑马鱼衰老模型中正常组和模型组的效果比较图。
图2是不同浓度D-半乳糖对AL斑马鱼衰老诱导效果的对比图。
图3是孵育时间对AL斑马鱼衰老诱导效果的对比图。
图4是二甲双胍对AL斑马鱼抗衰老功效的检测图。
图5是白藜芦醇对AL斑马鱼抗衰老功效的检测图。
图6是烟酰胺单核苷酸对AL斑马鱼抗衰老功效的检测图。
图7是雷帕霉素对AL斑马鱼抗衰老功效的检测图。
具体实施方式
下面结合附图与具体实施方法对本发明做进一步的描述。
总实施例
本发明实施例使用的β-半乳糖苷酶染色液中，每100μL包含1μLβ-半乳糖苷酶染色液A、1μLβ-半乳糖苷酶染色液B、93μLβ-半乳糖苷酶染色液C和5μL X-Gal溶液。
实施例1
D-半乳糖诱导AL斑马鱼衰老模型的建立：
1)取6hpf的AL品系斑马鱼鱼卵分为正常组和模型组置于微板中，每组30粒鱼卵，正常组以每孔3mL的养殖用水孵育，模型组以每孔3mL含25.6mg/mL D-半乳糖的养殖用水孵育，每天更换各组养殖用水或含25.6mg/mL D-半乳糖的养殖用水；
2)第6天进行收样，将各组斑马鱼用养殖用水清洗2次后采用4％的细胞固定液固定18h，然后采用PBS清洗3次，每次5min，将斑马鱼转移到1.5ml的EP管中，吸干PBS后加入配置好的β-半乳糖苷酶染色液100μL，置于摇床中在37℃、600r/min的条件下染色8h；
3)染色结束后，采用光学显微镜进行观察拍照，并计算斑马鱼躯干的不饱和透明度总和，计算不透明度总和的范围。
染色结果如图1所示，以斑马鱼全身不透明度总和计算，模型组为(97392.6±2026.9)，正常组为(80604.3±1043.1)，独立样本T检验P<0.05；在划线区域内，模型组的不透明度总和为(19169.8±270.8)，正常组的不透明度总和为(13351.7±165.40)，独立样本T检验P<0.05，这两组数据均表明模型组的β-半乳糖苷酶含量显著高于正常组，即D-半乳糖成功诱导斑马鱼细胞衰老。同时，从两组数据中可知，划线区域内不透明度总和可反映斑马鱼的衰老程度，并且颜色区别更明显。
实施例2
D-半乳糖诱导AL斑马鱼衰老模型的建立：
模型组中D-半乳糖浓度为3.2mg/mL，其余条件与实施例1相同。
实施例3
D-半乳糖诱导AL斑马鱼衰老模型的建立：
模型组中D-半乳糖浓度为6.4mg/mL，其余条件与实施例1相同。
实施例4
D-半乳糖诱导AL斑马鱼衰老模型的建立：
模型组中D-半乳糖浓度为12.8mg/mL，其余条件与实施例1相同。
实施例5
D-半乳糖诱导AL斑马鱼衰老模型的建立：
模型组中D-半乳糖浓度为51.2mg/mL，其余条件与实施例1相同。
实施例6
D-半乳糖诱导AL斑马鱼衰老模型的建立：
正常组及模型组在第4天进行收样，其余条件与实施例1相同。
实施例7
D-半乳糖诱导AL斑马鱼衰老模型的建立：
正常组及模型组在第5天进行收样，其余条件与实施例1相同。
实施例1-5中不同D-半乳糖浓度对斑马鱼的诱导作用如图2所示，在3.2-51.2mg/mL的浓度范围内，浓度越高斑马鱼的衰老程度越高，但51.2mg/mL的D-半乳糖会使斑马鱼的成活率降低到60％，而25.6mg/mL的D-半乳糖下斑马鱼的成活率高于90％，因此在造模时采用25.6mg/mL的D-半乳糖。
实施例1、实施例6以及实施例7中不同孵育时间对AL斑马鱼衰老诱导效果如图3所示，第4天时模型组的不透明度就高于正常组，第6天时区别较为显著，因此选定孵育时间为6天。
实施例8
二甲双胍的抗衰老功效评价：
1)取6hpf的AL品系斑马鱼鱼卵分为正常组、模型组和供试品组置于微板中，每组30粒鱼卵，正常组以每孔3mL的养殖用水孵育，模型组以每孔3mL含25.6mg/mL D-半乳糖的养殖用水孵育，供试品组以每孔3mL含25.6mg/mL D-半乳糖以及不同浓度二甲双胍的养殖用水，每天更换各组的养殖用水；
2)第6天进行收样，将各组斑马鱼用养殖用水清洗2次后采用4％的细胞固定液固定18h，然后采用PBS清洗3次，每次5min，将斑马鱼转移到1.5ml的EP管中，吸干PBS后加入配置好的β-半乳糖苷酶染色液100μL，置于摇床中在37℃、600r/min的条件下染色8h；
3)染色结束后，采用光学显微镜进行观察拍照，并计算斑马鱼躯干的不饱和透明度总和，计算不透明度总和的范围。
各组斑马鱼的不透明度总和如图4所示，当二甲双胍浓度高于0.25mg/mL时，斑马鱼的不透明度显著低于模型组，这表明0.25-1.00mg/mL的二甲双胍对斑马鱼有较好的抗衰老作用。
实施例9
白藜芦醇的抗衰老功效评价：
1)取6hpf的AL品系斑马鱼鱼卵分为正常组、模型组和供试品组置于微板中，每组30粒鱼卵，正常组以每孔3mL的养殖用水孵育，模型组以每孔3mL含25.6mg/mL D-半乳糖的养殖用水孵育，供试品组以每孔3mL含25.6mg/mL D-半乳糖以及不同浓度白藜芦醇的养殖用水，每天更换各组的养殖用水；
2)第6天进行收样，将各组斑马鱼用养殖用水清洗2次后采用4％的细胞固定液固定18h，然后采用PBS清洗3次，每次5min，将斑马鱼转移到1.5ml的EP管中，吸干PBS后加入配置好的β-半乳糖苷酶染色液100μL，置于摇床中在37℃、600r/min的条件下染色8h；
3)染色结束后，采用光学显微镜进行观察拍照，并计算斑马鱼躯干的不饱和透明度总和，计算不透明度总和的范围。
各组斑马鱼的不透明度总和如图5所示，当白藜芦醇浓度高于25μg/mL时，斑马鱼的不透明度显著低于模型组，这表明25-200μg/mL的白藜芦醇对斑马鱼有较好的抗衰老作用。
实施例10
烟酰胺单核苷酸(NMN)的抗衰老功效评价：
1)取6hpf的AL品系斑马鱼鱼卵分为正常组、模型组和供试品组置于微板中，每组30粒鱼卵，正常组以每孔3mL的养殖用水孵育，模型组以每孔3mL含25.6mg/mL D-半乳糖的养殖用水孵育，供试品组以每孔3mL含25.6mg/mL D-半乳糖以及不同浓度NMN的养殖用水，每天更换各组的养殖用水；
2)第6天进行收样，将各组斑马鱼用养殖用水清洗2次后采用4％的细胞固定液固定18h，然后采用PBS清洗3次，每次5min，将斑马鱼转移到1.5ml的EP管中，吸干PBS后加入配置好的β-半乳糖苷酶染色液100μL，置于摇床中在37℃、600r/min的条件下染色8h；
3)染色结束后，采用光学显微镜进行观察拍照，并计算斑马鱼躯干的不饱和透明度总和，计算不透明度总和的范围。
各组斑马鱼的不透明度总和如图6所示，当NMN浓度高于6.25μg/mL时，斑马鱼的不透明度显著低于模型组，这表明6.25-100μg/mL的NMN对斑马鱼有较好的抗衰老作用。
实施例11
雷帕霉素的抗衰老功效评价：
1)取6hpf的AL品系斑马鱼鱼卵分为正常组、模型组和供试品组置于微板中，每组30粒鱼卵，正常组以每孔3mL的养殖用水孵育，模型组以每孔3mL含25.6mg/mL D-半乳糖的养殖用水孵育，供试品组以每孔3mL含25.6mg/mL D-半乳糖以及不同浓度雷帕霉素的养殖用水，每天更换各组的养殖用水；
2)第6天进行收样，将各组斑马鱼用养殖用水清洗2次后采用4％的细胞固定液固定18h，然后采用PBS清洗3次，每次5min，将斑马鱼转移到1.5ml的EP管中，吸干PBS后加入配置好的β-半乳糖苷酶染色液100μL，置于摇床中在37℃、600r/min的条件下染色8h；
3)染色结束后，采用光学显微镜进行观察拍照，并计算斑马鱼躯干的不饱和透明度总和，计算不透明度总和的范围。
各组斑马鱼的不透明度总和如图7所示，当雷帕霉素浓度高于0.25μg/mL时，斑马鱼的不透明度显著低于模型组，这表明0.25-2μg/mL的雷帕霉素对斑马鱼有较好的抗衰老作用。
本发明可快速筛选具有抗衰老功效的物质，并可根据不透明度的降低程度评价该物质的抗衰老效果。
Claims (10)
1.D-半乳糖诱导AL斑马鱼衰老模型，其特征是，所述模型为使用D-半乳糖诱导衰老的AL斑马鱼模型。
2.根据权利要求1所述的一种D-半乳糖诱导AL斑马鱼衰老模型，其特征是，所述D-半乳糖诱导衰老的步骤为使用添加D-半乳糖的养殖用水孵育AL品系斑马鱼鱼卵4-6天，添加D-半乳糖的养殖用水每日更换。
3.根据权利要求1所述的一种D-半乳糖诱导AL斑马鱼衰老模型，其特征是，所述AL品系斑马鱼鱼卵为受精后5-7 h的AL品系斑马鱼鱼卵。
4.根据权利要求1所述的一种D-半乳糖诱导AL斑马鱼衰老模型，其特征是，所述添加D-半乳糖的养殖用水中D-半乳糖的浓度为1.6-25.6 mg/mL。
5.一种使用如权利要求1所述D-半乳糖诱导AL斑马鱼衰老模型的评价抗衰老功效的方法，其特征是，包括以下步骤：
1）设置正常组、模型组与供试品组进行孵育；
2）在孵育5-7天后，将各组斑马鱼清洗固定；
3）对固定后的斑马鱼进行β-半乳糖苷酶染色，用光学显微镜观察并计算斑马鱼的不饱和透明度总和。
6.根据权利要求5所述的一种评价抗衰老功效的方法，其特征是，所述步骤1）中每组各有20-40粒AL品系斑马鱼鱼卵。
7.根据权利要求5所述的一种评价抗衰老功效的方法，其特征是，所述步骤2）中清洗固定步骤为将各组斑马鱼用养殖用水清洗2-3次后，置于4%的细胞固定液中16-18h。
8.根据权利要求5所述的一种评价抗衰老功效的方法，其特征是，所述步骤3）中β-半乳糖苷酶染色的步骤为使用PBS清洗固定后斑马鱼2-3次，每次3-5min，吸干斑马鱼体表的PBS后，用β-半乳糖苷酶染色液在37℃下于摇床以600-700 r/min染色斑马鱼6-8 h。
9.根据权利要求5所述的一种评价抗衰老功效的方法，其特征是，所述步骤3）中观察并计算斑马鱼躯干的不饱和透明度总和。
10.根据权利要求5或9所述的一种评价抗衰老功效的方法，其特征是，所述步骤3）中，当模型组中斑马鱼的不饱和透明度总和显著高于正常组中斑马鱼的不饱和透明度总和，供试品组中斑马鱼的不饱和透明度总和显著低于模型组中斑马鱼的不饱和透明度总和，可认为供试品有抗衰老功效。
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