CN112080484A - 一种基于磁性COFs的固定化酶、合成方法及其在制备生物柴油中的应用 - Google Patents

一种基于磁性COFs的固定化酶、合成方法及其在制备生物柴油中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于磁性COFs的固定化酶、合成方法及其在制备生物柴油中的应用，该基于磁性COFs的固定化酶包括核‑壳结构的纳米粒子和被固定的水解酶，核为Fe3O4磁性纳米颗粒，壳为COFs，被固定的水解酶为RML。一种基于磁性COFs的固定化酶的合成方法包括磁性COFs的合成和酶的固定化，即先合成磁性COFs材料，再用磁性COFs材料固定RML，得到固定化酶RML@Fe3O4@COF‑OMe。基于磁性COFs的固定化酶稳定性好，保留了RML催化活性高的特点，在催化制备生物柴油中能达到产率高的效果。

Description

一种基于磁性COFs的固定化酶、合成方法及其在制备生物柴 油中的应用
技术领域
本发明涉及固定化酶技术领域，具体涉及到一种基于磁性COFs的固定化酶、合成方法及其在制备生物柴油中的应用。
背景技术
目前，在绿色化学原则及可持续发展的指导下，开发新的可再生能源成为研究的热点。生物柴油基于良好的生物可再生性，生物可降解性，其开发制备具有重要的意义。现如今，在制备生物柴油的过程中，常用的化学催化剂如酸，碱在催化过程中具有诸多不足：1、化学催化剂污染较大；2、难以从体系中分离，回收效果不好；3、化学催化剂催化反应的条件苛刻。
因此，基于生物催化剂(酶)的生物柴油的制备成为研究热点，酶具有催化的高效性，专一性及反应条件温和的特点。不过酶的使用在生产中，特别是大规模的工业化生产，仍有一些问题需要解决：
1.酶的价格昂贵，游离的酶不易从反应体系中分离，经济效益不高；
2.酶的固定化可以解决酶的回收的问题，但固定化过程改变了酶的构象，对酶的活性造成影响，严重的情况下会使酶失活；
3.部分固定化载体稳定性不好，且载体本身(如含有的金属元素)对酶会产生影响。
而共价有机骨架材料(COFs)是一种新型的结晶型多孔材料，具有大的比表面积，多孔道及表面可修饰的特点。COFs因其结构骨架为B、C、N、O、Si等轻元素，因而密度低，且在合成过程中，单体之间不发生大的改变，因而可以通过选择设计单体，合成具有特定孔径大小、不同表面性质的COFs材料，使其在吸附、催化、手性拆分等方向上极具应用潜力。
有研究公开了一种硼酸型磁性COFs材料，通过单体1,3,5三甲酰间苯三酚与单体3,3’-二硝基联苯胺经Schiff碱缩合反应形成共价有机骨架，用硼酸基团修饰后得到，该材料由于其吸附性即用于尿液中痕量单胺类神经递质物质的分离富集和含量分析。而将COFs材料用于酶的固定性能上的研究以及固定后在生物柴油中的应用还没有确切的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于磁性COFs的固定化酶、合成方法及其在制备生物柴油中的应用，可以解决生物催化剂活性低、载体稳定性差的问题，也突破了将COFs材料用于酶的固定性能上的研究。
为达上述目的，本发明提供了一种基于磁性COFs的固定化酶，包括核-壳结构的纳米粒子和被固定的水解酶，核为Fe3O4磁性纳米颗粒，壳为COFs，被固定的水解酶为RML。
采用上述方案的有益效果是：核-壳结构的纳米粒子，具有高的比表面积和磁性，有利于酶的固定化，便于固定化酶的回收；Fe3O4磁性纳米颗粒为结构提供磁性以及增加复合物的密度；COFs比表面积大、孔道多及表面可修饰的特点，使其用于载体材料时吸附性强，且COFs也保护了Fe3O4磁性纳米颗粒核的完整性；RML是一种水解酶(脂肪酶)，其具有催化酯的水解、酯交换反应等能力，且RML催化活性高，可以催化制备生物柴油；通过这种结构的固定化酶在生物柴油的制备中能提升酶的催化效率。
进一步的，COFs是由单体2,5-二甲氧基对苯二甲醛与单体1,3,5-三(氨基苯基)苯在室温下发生席夫碱反应形成，其反应时间为12h。
采用上述方案的有益效果是：该反应为Schiff反应即席夫碱反应，单体2,5-二甲氧基对苯二甲醛的羰基(醛)和单体1,3,5-三(氨基苯基)苯的氨基发生缩合反应，生成含有亚胺结构的有机化合物，连接碳骨架，这种结构可以在Fe3O4磁性纳米颗粒表面形成COF层，最终形成磁性COFs材料，即Fe3O4@COF-OMe。
进一步的，单体2,5-二甲氧基对苯二甲醛和单体1,3,5-三(氨基苯基)苯的摩尔比为3:2。
上述基于磁性COFs的固定化酶的合成方法，包括磁性COFs的合成和酶的固定化。
采用上述方案的有益效果是：将磁性COFs的合成，作为载体物质；选取合适的催化生物柴油的酶；通过吸附法将酶固定在磁性COFs上，使固定后的酶稳定性高、可重复使用，且易将固定化酶与底物、产物分离，方便回收。
进一步的，磁性COFs的合成具体包括以下步骤：
(1)称量溶解
将原料Fe3O4磁性纳米颗粒、2,5-二甲氧基对苯二甲醛和1,3,5-三(氨基苯基)苯，溶于溶剂中；
(2)催化
将步骤(1)所得溶液超声，同时滴加催化剂后静置过夜，得到固体颗粒，其中超声时间为5-10min；
(3)洗涤
将步骤(2)得到的固体颗粒用磁铁分离后洗涤；
(4)干燥
将洗涤后的固体颗粒在50℃真空干燥24h，得磁性COFs。
采用上述方案的有益效果是：通过将Fe3O4磁性纳米颗粒、单体2,5-二甲氧基对苯二甲醛和单体1,3,5-三(氨基苯基)苯溶解在溶剂中，通过超声分散不溶性颗粒，再同时滴加催化剂催化席夫碱反应的进行，最终可以得到带有磁性的亚胺结构的磁性COFs复合物。将磁性COFs复合物用磁铁分离后进行洗涤，除去之前的各种化学试剂，加热真空干燥，得到黄色磁性固体颗粒，即可用作酶的载体。
进一步的，步骤(1)中的溶剂为乙腈溶液，步骤(2)中的催化剂为乙酸溶液。
采用上述方案的有益效果是：乙腈是极性较强的有机溶剂，对无机盐、有机物和高分子化合物均有很好的溶解性；反应中两个单体通过席夫碱反应生成亚胺，在酸性条件下可以催化加速反应的生成。
进一步的，步骤(3)洗涤具体包括用无水四氢呋喃、甲醇各洗涤3次，之后在索氏提取器中用无水四氢呋喃提取洗涤48h。
采用上述方案的有益效果是：多次重复洗涤，可以将固体颗粒上残留的乙腈溶液、乙酸溶液以及没有成型的原料一起除去。
进一步的，酶的固定化具体包括：将磁性COFs分散于PBS缓冲液中，向其中加入RML酶，于室温下置于旋转培养器上培养48h后利用磁铁分离固定化酶并冻干保存，固定化酶/此生物复合物中磁性COFs与酶的质量比为50：1。
采用上述方案的有益效果是：PBS缓冲液作为溶剂，起溶解保护试剂的作用，是生物化学研究中使用最为广泛的一种缓冲液；磁性COFs分散于PBS缓冲液中与RML酶进行吸附，同时旋转培养，增加两者的接触面积与吸附效率，最后形成固定化酶，可以反复使用又能发挥催化作用，还因为Fe3O4为其赋予的磁性，最终可在溶液中被磁铁轻松分离。
一种基于磁性COFs的固定化酶在制备生物柴油中的应用。
采用上述方案的有益效果是：磁性COFs载体在固定化酶之后，能够维持酶的活性，在生物柴油的制备中能提升酶的催化效率，且磁性便于了固定化酶从体系中快速分离，成功实现了其在生物柴油制备中的应用。
综上所述，本发明具有以下优点：
1、通过席夫碱反应，合成核-壳型磁性COFs载体，赋予了载体磁性，便于回收，还增加了复合物的密度；
2、亚胺类的COFs载体具有高比表面积、均一纳米孔径、高稳定性的特点；
3、通过核-壳型磁性COFs载体固定，可以增加酶的稳定性；
4、本发明首次实现了基于COFs材料固定化水解酶，并将其运用到生物柴油的制备；
5、在本发明的实验过程里，Fe3O4@COF-OMe能够很好维持酶的活性，RML@Fe3O4@COF-OMe在模板反应中能达到80％的产率，在制备生物柴油中也能达到较高的产率，且能在适度过量的甲醇中维持酶的活性。
附图说明
图1为时间对酶活性影响的示意图；
图2为pH值对酶活性影响的示意图；
图3为固定化酶、游离酶的热稳定性示意图；
图4为不同载体对实验的影响示意图；
图5为不同溶剂对实验的影响示意图；
图6为不同温度对实验的影响示意图；
图7为不同酶量对实验的影响示意图。
具体实施方式
本发明提供了一种基于磁性COFs的固定化酶，包括核-壳结构的纳米粒子和被固定的水解酶，以Fe3O4磁性纳米颗粒为核，以COFs为壳，以RML为被固定的水解酶，通过吸附法固定，即得基于磁性COFs的固定化酶。
本发明提供了一种基于磁性COFs的固定化酶的合成方法，具体包括磁性COFs的合成和酶的固定化，其中，磁性COFs的合成包括以下步骤：
(1)称量溶解
按比例称取原料Fe3O4磁性纳米颗粒、2,5-二甲氧基对苯二甲醛和1,3,5-三(氨基苯基)苯，溶于溶剂中；
(2)催化
将上述溶液超声，同时滴加催化剂后静置过夜，得到固体颗粒，其中超声时间为5-10min；
(3)洗涤
将步骤(2)得到的固体颗粒用磁铁分离后洗涤；
(4)干燥
将洗涤后的固体颗粒在50℃真空干燥24h，即得Fe3O4@COF-OMe。
其中，酶的固定化具体步骤为：将Fe3O4@COF-OMe分散于PBS缓冲液中，向其中加入RML酶液，置于旋转培养器上培养48h后利用磁铁分离固定化酶并冻干保存。
实施例1
一种基于磁性COFs的固定化酶的合成方法，包括核-壳型磁性COFs的合成(Fe3O4@COF-OMe)：
1、称量0.24mmol的2,5-二甲氧基对苯二甲醛、0.16mmol的1,3,5-三(氨基苯基)苯和30mg磁性Fe3O4纳米颗粒，置于20mL乙腈溶液中溶解；
2、将体系超声5min，使不溶解的颗粒如磁性Fe3O4颗粒分散于体系中；
3、在超声的同时，缓慢滴加1.5mL乙酸，滴加完成后，静置过夜；
4、将所得到的固体颗粒用磁铁从体系中分离，用无水四氢呋喃、甲醇各洗涤3次，之后在索氏提取器中用无水四氢呋喃提取洗涤48h；
5、收集固体颗粒，在50℃真空干燥24h后，得到黄色磁性固体颗粒(Fe3O4@COF-OMe)；
一种基于磁性COFs的固定化酶的合成方法，还包括酶的固定化(RML@Fe3O4@COF-OMe)：将Fe3O4@COF-OMe分散于PBS缓冲液中，向其中加入0.2mgRML酶，置于旋转培养器上25℃培养48h，之后利用磁铁分离固定化酶，冻干后保存备用。
实施例2
一种基于磁性COFs的固定化酶的合成方法，包括核-壳型磁性COFs的合成(Fe3O4@COF-OMe)：
1、称量0.12mmol的2,5-二甲氧基对苯二甲醛、0.08mmol的1,3,5-三(氨基苯基)苯和15mg磁性Fe3O4纳米颗粒，置于20mL乙腈溶液中溶解；
2、将体系超声8min，使不溶解的颗粒如磁性Fe3O4颗粒分散于体系中；
3、在超声的同时，缓慢滴加1.5mL乙酸，滴加完成后，静置过夜；
4、将所得到的固体颗粒用磁铁从体系中分离，用无水四氢呋喃、甲醇各洗涤3次，之后在索氏提取器中用无水四氢呋喃提取洗涤48h；
5、收集固体颗粒，在50℃真空干燥24h后，得到黄色磁性固体颗粒(Fe3O4@COF-OMe)；
一种基于磁性COFs的固定化酶的合成方法，还包括酶的固定化(RML@Fe3O4@COF-OMe)：将Fe3O4@COF-OMe分散于PBS缓冲液中，向其中加入0.5mgRML酶，置于旋转培养器上50℃培养48h，之后利用磁铁分离固定化酶，冻干后保存备用。
实施例3
一种基于磁性COFs的固定化酶的合成方法，包括核-壳型磁性COFs的合成(Fe3O4@COF-OMe)：
1、称量0.06mmol的2,5-二甲氧基对苯二甲醛、0.04mmol的1,3,5-三(氨基苯基)苯和7.5mg磁性Fe3O4纳米颗粒，置于20mL乙腈溶液中溶解；
2、将体系超声10min，使不溶解的颗粒如磁性Fe3O4颗粒分散于体系中；
3、在超声的同时，缓慢滴加1.5mL乙酸，滴加完成后，静置过夜；
4、将所得到的固体颗粒用磁铁从体系中分离，用无水四氢呋喃、甲醇各洗涤3次，之后在索氏提取器中用无水四氢呋喃提取洗涤48h；
5、收集固体颗粒，在50℃真空干燥24h后，得到黄色磁性固体颗粒(Fe3O4@COF-OMe)；
一种基于磁性COFs的固定化酶的合成方法，还包括酶的固定化(RML@Fe3O4@COF-OMe)：将Fe3O4@COF-OMe分散于PBS缓冲液中，向其中加入0.8mgRML酶，置于旋转培养器上25℃培养48h，之后利用磁铁分离固定化酶，冻干后保存备用
试验例1
研究固定化酶(RML@Fe3O4@COF-OMe)与游离酶的活性差异(见图1)，以及加热处理(见图3)、ph值(见图2)对活性的影响。
实验组：在试管中，将0.1mg的固定化酶、500μL(2mmol/L)p-NPA加入到2000μL PBS缓冲液中；
对照组1：在试管中，加入游离酶RML，游离酶加入的量与固定化酶的量一致，且游离酶液与PBS缓冲液总量为2000μL；
对照组2：在试管中，加入酶RML@Fe3O4-COF-OMe(其中，Fe3O4-COF-OMe为COFs和磁性Fe3O4简单物理混合制得)，加入量与固定化酶的量一致，且酶液与PBS缓冲液总量为2000μL。
由图可知：两种固定化酶的活性都不及游离酶，但核壳型的RML@Fe3O4@COF-OMe相较于简单混合的RML@Fe3O4-COF-OMe，更能维持酶的活性，尽管固定化酶在p-NPA水解中表现不及游离酶，但在实际应用中(模板反应及生物柴油反应中)，固定化酶后对酶的保护作用远大于对其活性的影响。
试验例2
研究制备生物柴油过程中，不同载体、溶剂、温度以及酶量对产率的影响。
由于生物柴油的反应是一类酯交换反应，我们选择2-苯乙醇与醋酸乙烯酯的酯交换反应作为模板反应来优化反应条件。
载体：游离酶、Fe3O4@COF-OMe、Fe3O4-COF-OMe(见图4)；
溶剂：正己烷、四氯化碳、三氯乙烯、甲苯、无溶剂(即醋酸乙烯酯过量)、叔丁醇、四氢呋喃及丙酮(见图5)；
温度：30℃、40℃、50℃、60℃(见图6)；
酶量：0.1、0.2、0.5、0.8mg(见图7)。
结果发现在以正己烷为溶剂，50℃条件下，0.5mg固定化酶，核壳型Fe3O4@COF-OMe载体固定化RML，能得到较高的产率。
由上可知，我们选择以正己烷为溶剂，温度50℃下，含有0.5mgRML的固定化酶，催化麻风树果油制备生物柴油，实现生物柴油的转化。
试验例3
研究生物柴油反应物甲醇对酶活性的影响，见表1：
表1甲醇含量对酶活性的研究
Entry Oil Methol(μL) Yield(％)
1 Jatropha curcas Oil 10 67.8
2 Jatropha curcas Oil 20 72.3
3 Jatropha curcas Oil 50 trace
4 Jatropha curcas Oil 100 trace
由表可知，磁性COFs载体在适度过量(过量1倍)的甲醇下，依然能维持酶的活性，但当甲醇大大过量(过量5倍、10倍)的情况下，酶活性完全损失。因此，在Fe3O4@COF-OMe在甲醇过量的一定范围内，仍能维持其活性。由此可知，催化麻风树果油制备生物柴油时，理论底物化学计量比为麻风树果油：甲醇＝1：3。

Claims (9)

1.一种基于磁性COFs的固定化酶，其特征在于，包括核-壳结构的纳米粒子和被固定的水解酶，所述核为Fe3O4磁性纳米颗粒，所述壳为COFs，所述被固定的水解酶为RML。
2.如权利要求1所述的基于磁性COFs的固定化酶，其特征在于，所述COFs由单体2,5-二甲氧基对苯二甲醛与单体1,3,5-三(氨基苯基)苯在室温下发生席夫碱反应形成，其反应时间为12h。
3.如权利要求2所述的基于磁性COFs的固定化酶，其特征在于，所述单体2,5-二甲氧基对苯二甲醛和单体1,3,5-三(氨基苯基)苯的摩尔比为3:2。
4.权利要求1-3任一项所述的基于磁性COFs的固定化酶的合成方法，其特征在于，包括磁性COFs的合成和酶的固定化。
5.如权利要求4所述的基于磁性COFs的固定化酶的合成方法，其特征在于，所述磁性COFs的合成具体包括以下步骤：
(1)称量溶解
将原料Fe3O4磁性纳米颗粒、2,5-二甲氧基对苯二甲醛和1,3,5-三(氨基苯基)苯，溶于溶剂中；
(2)催化
将步骤(1)所得溶液超声，同时滴加催化剂后静置过夜，得到固体颗粒，其中超声时间为5-10min；
(3)洗涤
将步骤(2)得到的固体颗粒用磁铁分离后洗涤；
(4)干燥
将洗涤后的固体颗粒在40-60℃真空干燥22-26h，得磁性COFs材料。
6.如权利要求5所述的基于磁性COFs的固定化酶的合成方法，其特征在于，所述步骤(1)中的溶剂为乙腈溶液，所述步骤(2)中的催化剂为乙酸溶液。
7.如权利要求5所述的基于磁性COFs的固定化酶的合成方法，其特征在于，所述步骤(3)洗涤过程具体包括用无水四氢呋喃、甲醇各洗涤3次，之后在索氏提取器中用无水四氢呋喃提取洗涤48h。
8.如权利要求4所述的基于磁性COFs的固定化酶的合成方法，其特征在于，所述酶的固定化过程具体包括：将磁性COFs分散于PBS缓冲液中，向其中加入RML酶，在室温下置于旋转培养器上培养48h后利用磁铁分离固定化酶并冻干保存；其中，固定化酶/此生物复合物中磁性COFs与酶的质量比为50：1。
9.权利要求1-3任一项所述的基于磁性COFs的固定化酶在制备生物柴油中的应用。
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