CN112063723A - 一种降解检材分析微单倍型复合扩增体系及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种降解检材分析中微单倍型复合扩增体系及其构建方法和相关单倍型频率。本发明提供了一组遗传标记组合物共计23个微单倍型及其rs号。根据23个微单倍型的扩增引物，构建了用于降解检材分析的微单倍型复合扩增体系。本文还提供了包括前述23个微单倍型的扩增引物的试剂盒。本发明提供的微单倍型复合扩增体系可以对降解检材进行法医学鉴定，且灵敏度高，识别能力强。
Description
技术领域
本发明属于法医学领域，具体涉及一种降解检材分析中微单倍型复合扩增体系及其构建方法及相关单倍型频率。
背景技术
法医物证学主要是要解决司法实践中个人识别问题，个人识别是以同一认定理论为指导原则，对现场检材的遗传标记做出科学的鉴定，所以新的、更稳定、准确、快速、信息量大的人类遗传标记的开发与利用一直是法医学研究的热点。
随着DNA分析技术的发展以及在法医学中的应用，人们逐渐研究出了基于短串联重复序列(STR)长度多态性以及单核苷酸多态性(SNP)序列多态性的个人识别检测技术。这些技术具有鉴别能力强、灵敏度高、有种属特异性、结果准确、易于标准化等优点，其中STR遗传标记检测技术更是目前法医学DNA分析的主流技术。
但是，这两种技术都存在一些难以解决的问题，这些问题使得日常法医学工作中降解检测的DNA分析异常困难，而且导致结果可信度不高。如：STR因在扩增过程中，时常会出现复制滑脱的现象，从而导致出现影子峰；SNP虽然没有影子峰且具有突变率低、易于从降解材料中获得信息、易于自动化等优点，但单个位点所含信息量小，约50个SNP才可以达到12个STR基因座的识别率，这大大提升了复合扩增体系的构建难度。
为了解决目前DNA分析技术中的难题，尤其是STR中影子峰与SNP遗传标记单个位点所含信息量有限的问题，2013年Kidd教授团队将一种在200bp范围内2-5个SNP的单倍型组合引入到法医学DNA分析领域，并命名为微单倍型(microhaplotype)。这种遗传标记不光兼具STR和SNP遗传标记的优点，而且不存在影子峰的干扰，并相较于SNP单个遗传标记位点具有更多的信息量，可以帮助DNA分析人员更好地检测降解检材。
中国专利201810207821.0公开了一种用于法医检测的微单倍型遗传标记及其试剂盒。该发明提供了一组由位于常染色体上的21个微单倍型组成的遗传标记组合，能够有效的用于人类生物检材的法医检测。
中国专利201910328532.0公开了一种基于21个微单倍型位点的复合扩增体系，目的是解决现有检测方法STR分型技术无法获得理想的分型结果、SNP位点数过多位可能出现等位基因丢失的技术问题。
本发明在基因组序列中筛选出一套用来分析法医学案件中降解检材的微单倍型位点，并在每一位点设计一对正反向扩增引物，并构建了扩增所需的复合扩增体系。最后使用二代测序技术对所得到的序列进行分析，而后对设计的单倍型位点进行频率计算，以便应用于法医学实践中。
发明内容
术语：
除非另外定义，本申请中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。
rs号：指美国国立生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation,NCBI)的SNP数据库中的rs号。
微单倍型命名规则：基于既往报道的原则进行命名，以mh02YJW001为例，其中，mh表示微单倍型(microhaplotype)的英文缩写，02表示2号染色体，YJW表示发现这个位点的实验室，001用于进一步区分同一条染色体上发现的不同微单倍型位点。
Hs Taq：DNA聚合酶。
dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸。
Buffer：扩增体系的缓冲液，如无特别说明，本申请所述的扩增体系的缓冲液是为本领域技术人员熟知的。
Primer F：正向引物。
Primer R：反向引物。
扩增条件中的cycles指循环数，即所包含的步骤的重复次数。
本发明提供了一种降解检材微单倍型复合扩增体系的构建方法，通过该方法构建的微单倍型复合扩增体系，可以对法医学鉴定中的降解检材进行鉴定以完成个体识别，其灵敏度高，识别能力强。
一方面，本发明提供了一种降解检材微单倍型复合扩增体系的构建方法。
具体地，所述的降解检材微单倍型复合扩增体系构建方法包括以下步骤：
(1)位点选择：
①从HapMap数据库中下载一定数量的中国人染色体上具有rs号的SNP位点；
②根据SNP位点位置，选择片段在140bp范围内，包含3个及以上SNP的序列；
③利用Haploview软件计算这些位点的单倍型分型以及每种分型对应的频率；
④选择在特定位置的微单倍型分型数大于4个，且每种分型的概率相差比较近的位点；
⑤将上述选择的位点，放在华大基因的中国人群数据库中计算频率，选择等位基因频率大于或等于0.1的位点。
(2)引物设计：引物长度在18-25bp之间；各基因座引物的Tm值尽量一致；引物间不能形成二聚体、发夹结构等；PCR产物长度控制在140bp以内；引物内最好不要有连续相同的四个以上的碱基；保证引物在PCR中得到的扩增产物单一。
(3)复合体系PCR扩增：将上述筛选出的引物混合至同一反应体系中，保证模板浓度在一定范围内，寻找引物最适浓度，以期复合体系中的各位点可以得到最优扩增。
另一方面，本发明提供了一种降解检材分析的遗传标记组合物。
具体地，所述的遗传标记组合物包括分别位于常染色体上不同位置的23个微单倍型。
具体地，所述的23个微单倍型的SNP位点组成及其所位于的染色体编号如表1所示(SNP位点以美国国立生物技术信息中心的SNP数据库中的rs号命名)：
表1 23个微单倍型的SNP位点组成
再一方面，本发明提供了一种用于降解检材分析的微单倍型复合扩增体系。
具体地，所述的微单倍型复合扩增系统包括用于扩增上述23个微单倍型的引物对。
具体地，所述的扩增体系还包括性别鉴定基因座的引物对。
优选地，所述的性别鉴定基因座为Amelo基因座(Amelogenin)。
优选地，所述的用于扩增上述23个微单倍型和Amelo基因座的24组引物的序列以及每组引物在复合扩增体系中的浓度如表2所示：
表2 23个微单倍型和Amelo基因座的扩增引物及浓度
具体地，表2中所述的引物浓度是指每组引物中的正向引物和反向引物的浓度和为该浓度，在上表2的所述特定浓度下，每个微单倍型的扩增效率尽可能的高效且保持一致。
具体地，所述的扩增体系还包括PCR体系常用的其他试剂。
进一步具体地，所述的常用的其他成分还包括但不限于DNA聚合酶，Buffer，ddH2O，dNTP。
优选地，所述的复合扩增体系各试剂加样量如下表3所示：
表3复合扩增体系
其中，所述的Pimer mix为表2所示的引物的混合物。
优选地，所述的复合扩增程序为：95℃，3min；95℃，30s，56℃，35s，70℃，90s，35cycles；72℃，7min；4℃，贮存。
又一方面，本发明提供了一种用于降解检材分析的微单倍型复合扩增试剂盒。
具体地，所述的试剂盒包括前述用于扩增23个微单倍型和性别鉴定基因座的引物对。
优选地，所述的性别鉴定基因座为Amelo基因座(Amelogenin)。
优选地，所述的引物对序列及引物对的浓度如表2所示。
具体地，所述的试剂盒还包括但不限于DNA聚合酶、Buffer、ddH2O、dNTP。
又一方面，本发明提供了前述遗传标记组合、降解检材微单倍型复合扩增体系和降解检材微单倍型复合扩增试剂盒在法医鉴定、检测领域中的应用。
具体地，所述的法医鉴定、检测领域中的应用包括但不限于法医学鉴定、检测领域中的个体识别、案件排查及尸源认定。
与现有技术相比，本发明的积极和有益效果在于：
(1)本发明提供了一种降解检材微单倍型复合扩增体系的构建方法，可用于快速构建微单倍型复合扩增体系，应用于法医学鉴定、检测领域中。
(2)本发明提供了一组由位于常染色体上的23个微单倍型组成的遗传标记组合物，所述的遗传标记组合物能够有效的应用于法医学鉴定、检测领域中个体识别、案件排查及尸源认定等工作中。
(3)本发明提供了扩增上述23个微单倍型的复合扩增系统或试剂盒，本发明针对每个微单倍型均设计了一对特定引物且采用特定的引物浓度，使每个微单倍型的扩增效率尽可能的一致，扩增结果最大程度的保持平衡有效。
(4)本发明提供的微单倍型复合扩增体系或试剂盒，可以对法医学鉴定中的降解检材进行鉴定以完成个体识别等工作，其灵敏度高，识别能力强，解决了目前STR与SNP遗传标记检测分析技术存在的缺点，可以更好的应用于法医学鉴定工作。
附图说明
图1为实施例2中23个微单倍型位点以及Amelo基因座的单个位点的PCR扩增结果电泳图。
图2为实施例2中对比实验1的扩增结果电泳图。
图3为实施例2中对比实验2的扩增结果电泳图。
图4为实施例4中利用实施例2提供的复合扩增体系检测样本丢失位点的数量结果统计图。
图5为实施例4中利用3500毛细管电泳检测样本丢失等位基因的数量结果统计图。
图6为实施例5灵敏度检测实验DNA浓度分别为2ng、1ng、0.5ng、0.25ng、0.125ng、0.0625ng时成功分型的位点数量结果统计图。
图7为实施例5灵敏度检测实验DNA浓度分别为2ng、1ng、0.5ng、0.25ng、0.125ng、0.0625ng的复合PCR扩增结果电泳图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例中未注明具体技术或条件者，均按照本领域内的文献所描述的技术或条件(如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。
实施例1微单倍型复合扩增体系的构建
(1)位点选择：
①从hapmap数据库中下载82个中国人在1-22号染色体上具有rs号的SNP位点；
②根据位置，选择片段在140bp范围内，包含3个及以上SNP的序列；
③利用Haploview软件计算这些位点的单倍型分型以及每种分型对应的频率；
④选择在特定位置的微单倍型分型数大于4个，且每种分型的概率相差比较近的位点；
⑤将上述选择的位点，放在华大基因的中国人群数据库中计算频率，选择等位基因频率大于或等于0.1的位点。
(2)引物设计：引物长度在18-25bp之间；各基因座引物的Tm值尽量一致，Tm值主要依靠Primer软件设计结果；引物间不能形成二聚体、发夹结构等；PCR长度控制在140bp以内；引物内最好不要有连续相同的四个以上的碱基；保证引物在PCR中得到的扩增产物单一。
(3)复合体系PCR扩增：将上述筛选出的引物混合至同一反应体系中，保证模板浓度在一定范围内，寻找引物最适浓度，以期复合体系中的各位点可以得到最优扩增。
实施例2一种微单倍型复合扩增体系
1.根据实施例1的构建方法得到一种微单倍型复合扩增体系。
1.1微单倍型位点
表4为在每条染色体上选择的SNP位点数以及对应的rs号，以及利用PCR将这些位点扩增出来的扩增片段长度和PCR产物在人类全基因组Feb.2009(GRCh37/hg19版本)参考基因组中的位置。其中，PCR的扩增长度均在140bp范围内，且包括的SNP都在3-4个之间。
表4微单倍型扩增长度、在hg19参考基因组中的位置及rs号
1.2复合扩增体系中的扩增引物
复合扩增体系中，23个微单倍型每条染色体上的正反向引物如表2所示，为使每条染色体上的扩增效率尽可能的一致，通过调整复合体系中每对引物的浓度，最终调整后的引物浓度如表2所示。
1.3除以上微单倍型位点外，该体系中还增加了性别鉴定基因座Amelo基因的相关引物及引物浓度，如表2所示。
1.4 23个微单倍型位点以及Amelo基因的单个位点的PCR扩增结果
上述23个微单倍型位点的单引物扩增体系如下表5所示：
表5 23个微单倍型位点的单引物扩增体系
其中Primer F和Primer R选自表2。
其中，DNA模板按照凯杰
DNA Investigator Kit操作步骤提取人血液样本的基因组DNA并通过invitrogen Qubit4进行样本DNA定量。
单引物扩增程序如下：95℃，3min；95℃，30s，56℃，35s，70℃，90s，35cycles；72℃，7min；4℃，贮存。
图1为23个微单倍型位点以及Amelo基因的单个位点的PCR扩增结果的琼脂糖凝胶电泳的结果图。该图表明，以上每个微单倍型均表现出良好的扩增效率，且扩增的目的片段具有特异性。
1.5对比实验1
本对比实验采用与上述扩增体系、扩增程序相同，但引物浓度统一修改为0.05μM，对相同的DNA模板进行扩增。
对扩增产物进行凝胶电泳检测，电泳图谱如图2所示，可以看出当引物浓度统一修改为0.05μM后，微单倍型均未被扩增出来。
1.6对比实验2
本对比实验采用与上述扩增体系、扩增程序相同，但引物浓度统一修改为2μM，对相同的DNA模板进行扩增。
对扩增产物进行凝胶电泳检测，电泳图谱如图3所示，可以看出当引物浓度统一修改为2μM后，所有微单倍型也可被扩增出来，但mh08YJW001和Amelo出现非特异性扩增，易影响后续实验结果。
对比实验1和对比实验2结果表明复合引物浓度修改之后，与表2引物浓度不同的情况下，扩增效果变差。
2.本实施例提供的PCR复合扩增体系各试剂加样量如下表6所示。
表6 PCR复合扩增体系
其中，DNA来源于所测样本，Primer mix为前述引物的混合物，通过将干粉引物稀释至浓度为10μM后按表7的比例配制。
表7配制引物混合物中各引物加样量
3.PCR复合扩增反应条件：95℃，3min；95℃，30s，56℃，35s，70℃，90s，35cycles；72℃，7min；4℃，贮存。
实施例3汉/藏/维族3个群体50个无关样本单倍型频率结果
由于本发明提供的微单倍型均为新设计，应用到试剂盒中时没有对应可用来对降解检材进行分析的频率信息，因此需要先计算这些微单倍型的频率。
(1)DNA提取：利用凯杰
DNA Investigator Kit试剂盒提取样本的全基因组DNA。
(2)根据实施例2提供的复合扩增体系对提取的DNA进行复合PCR扩增。
(3)对得到的PCR产物进行凝胶电泳后，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化，库检合格后，用MiSeq测序仪进行测序。
(4)对测序得到的fastq文件进行质量控制，将质控后的fastq文件转换为fasta文件，利用正向引物调出测序得到的每条染色体上包含正反向引物的序列，对得到的序列做blast，其中blast的库文件为每条染色体上利用正反向引物从ucsc中的电子PCR得到的序列，然后找到每个个体中，对应位置处的SNP碱基，将每条染色体上对应的SNP组合到一起，即为该个体在该染色体上的单倍型分型。
(5)利用Haploview软件对单倍型的频率进行计算。
本实施例中，在北京的汉族(汉)、西藏藏族自治区的藏族(藏)、新疆维吾尔自治区的维吾尔族(维)3个群体各选取50个无关样本，每条染色体上出现的单倍型以及对应的频率如下表8所示。
表8：汉/藏/维族样本中每条染色体上的单倍型分型及对应频率
实施例4一种降解检材分析微单倍型复合扩增体系对降解检材的分型效果
实验组：提取人血液样本的基因组DNA并进行人工降解作为降解检材，利用实施例2提供的复合扩增体系对降解样品DNA进行扩增，得到的产物通过Miseq测序仪进行测序，并进一步进行单倍型分型。
对照组：同实验组提取人血液样本的基因组DNA并进行人工降解作为降解检材，采用现有技术对降解样品DNA进行检测，即使用Investigator 26plex QS kit试剂盒(Qiagen)对样本进行扩增，然后在Applied Biosystems 3500Genetic Analyzer进行毛细管电泳。
本实施例选用的降解检材信息如下：
样品1来源：提取同学新鲜血液样本的基因组DNA后用M5 DNase 1(北京聚合美生物科技有限公司，MF110-01)人工降解4分钟；样品2来源：提取同学新鲜血液样本的基因组DNA后用M5 DNase 1人工降解7分钟；样品3来源：提取同学新鲜血液样本的基因组DNA后用M5 DNase 1人工降解15分钟。
根据测序及分型结果，实验组对样品中所含微单倍型的具体信息如下表9所示：
表9降解检材微单倍型分型结果
对照组对样品检测结果的具体信息如下表10所示：
表10降解检材3500毛细管电泳检测结果
| STR位点 | 样品1 | 样品2 | 样品3 |
| Amelo | X/X | X/X | - |
| TH01 | 7/9 | 7/9 | - |
| D3S1358 | 15/17 | - | - |
| PentaD | 11/13 | 11/13 | - |
| D6S1043 | - | - | - |
| D21S11 | 30/33.2 | - | - |
| TPOX | 8/11 | 8/11 | - |
| DYS391 | - | - | - |
| D1S1656 | 15/16 | 15/16 | - |
| D12S391 | 20/21 | 20/21 | - |
| PentaE | 17/19 | - | - |
| D10S1248 | 13/14 | 13/14 | - |
| D22S1045 | 15/16 | 15/16 | - |
| D19S433 | 13/15 | 13/15 | - |
| D8S1179 | 14/16 | 14/16 | - |
| D2S1338 | 19/22 | - | - |
| D2S441 | 11/11 | 11/11 | - |
| D18S51 | 14/15 | 14/15 | - |
| vWA | 18/19 | 18/19 | - |
| FGA | 23/23 | 23/23 | - |
| D16S539 | 10/11 | 10/11 | - |
| CSF1PO | 10/11 | 10/11 | - |
| D13S5317 | 10/10 | 10/10 | - |
| D5S818 | 11/11 | 11/11 | - |
| D7S820 | 9/10 | - | - |
根据表9及表10结果可知，对于样品1(人工降解4分钟)、样品2(人工降解7分钟)、样品3(人工降解15分钟)的微单倍型检测及分型，本发明提供的复合扩增体系丢失位点的数量分别为0、0、9，而采用3500毛细管电泳检测丢失位点的数量分别为1、6、24(由于是女性样本，DYS391位点采用3500毛细管电泳检测无法判别，因此不纳入数据统计中)，表明本发明提供的复合扩增体系对降解检材的微单倍型的分型效果及个体识别能力明显好于3500毛细管电泳检测的效果。
实施例5一种用于降解检材的微单倍型复合扩增体系的灵敏度实验
根据实施例2提供的复合扩增体系，分别采用不同浓度的DNA模板进行扩增，产物使用Miseq进行测序，并进一步进行单倍型分型。
其中，DNA模板浓度分别为：2ng、1ng、0.5ng、0.25ng、0.125ng、0.0625ng。
微单倍型检测结果如下表11所示：
表11降解检材的微单倍型复合扩增体系的灵敏度实验
由该结果可知：本发明提供的复合扩增体系可以对浓度为0.0625ng以上的DNA模板进行检测，灵敏度高，识别能力强。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 山西医科大学
<120> 一种降解检材分析微单倍型复合扩增体系及其构建方法
<130> 20200722
<160> 48
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
atttcacatc aagaaagcaa 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
tagcaggatc gtgatgattt 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 3
tggaaaacta agagatggaa 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 4
ttgtcactgc tgttccaagg 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 5
tgcatttgga acattgtggg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 6
gctggcgaca ttcctcttac 20
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 7
tgggtttagc acaagtgg 18
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 8
tctaccagga acgggaag 18
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 9
gggaacaact ggaaccaa 18
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 10
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 11
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<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 12
tgggaatttg ctctgtgt 18
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 13
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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ctgattctgg agcttccata 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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attttacaaa caccagtgcc 20
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<211> 20
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<213> 人工序列(artificial sequence)
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 19
ttcatgactt tacccttctt 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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taggccaagc tcttaaactg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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gccctcaaat taagatttgc 20
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<213> 人工序列(artificial sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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ctgtttgttg taaagtggcg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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gcctgaaagt gagcaatt 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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taccacagga agcaaacc 18
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<213> 人工序列(artificial sequence)
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gatgttgata gtgggggc 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 29
ggttatgaac tggacaaagg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 30
cagtccgatt tatatttgcc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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ctgcctgtgg ctagtctg 18
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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taatgaaatc aattgtcagc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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aaattgcaca ctaacattcg 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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caattcccag taatatccca 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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ttgtctgtgg aatggagatt 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 37
cgctggagga gcaaaagt 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 38
tggagcacgg aagttagg 18
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<213> 人工序列(artificial sequence)
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aagcaacatc ataccaagag 20
<210> 40
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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aacatatcct gcatggtttg 20
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tggtgatttt tccaacagta 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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ttcctgccct tatgtctg 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 44
tcgtgcaacc aactgact 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 45
cagctgtcct tgaacaagtt 20
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 48
atcagagctt aaactgggaa gctg 24
Claims (10)
1.一种用于降解检材分析的微单倍型复合扩增体系，其特征在于，所述的微单倍型复合扩增体系包括可识别或扩增一组遗传标记组合物的引物对，所述的遗传组合标记物包括23个微单倍型，所述的23个微单倍型的SNP位点及其rs号：
。
2.根据权利要求1所述的用于降解检材分析的微单倍型复合扩增体系，其特征在于，所述的复合扩增体系还包括识别或者扩增性别鉴定基因座的引物对，所述的性别鉴定基因座为Amelo基因座。
3.根据权利要求1或2任一项所述的用于降解检材分析的微单倍型复合扩增体系，其特征在于，所述的复合扩增体系包括：用于扩增所述的23个微单倍型和Amelo基因座的24对引物及每对引物在复合扩增体系中的浓度：
4.根据权利要求3所述的用于降解检材分析的微单倍型复合扩增体系，其特征在于，所述的复合扩增体系中还包括DNA聚合酶、Buffer、ddH2O、dNTP。
5.根据权利要求4所述的用于降解检材分析的微单倍型复合扩增体系，其特征在于，所述的复合扩增体系中各试剂的加样量为：
所述的Primer mix是所述的用于扩增所述的23个微单倍型和Amelo基因座的24对引物的混合物。
6.根据权利要求5所述的用于降解检材分析的微单倍型复合扩增体系，其特征在于，所述的Primer mix通过将干粉引物稀释至浓度为10μM后按比例配制而成，所述的比例为：
7.根据权利要求6所述的用于降解检材分析的微单倍型复合扩增体系，其特征在于，所述的复合扩增体系的扩增条件为：95℃，3min；95℃，30s，56℃，35s，70℃，90s，35cycles；72℃，7min；4℃，贮存。
8.一种降解检材分析中微单倍型复合扩增体系的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括如下步骤：
(1)位点选择：
①从HapMap数据库中下载一定数量的中国人染色体上具有rs号的SNP位点；
②根据SNP位点位置，选择片段在140bp范围内，包含3个及以上SNP的序列；
③利用Haploview软件计算这些位点的单倍型分型以及每种分型对应的频率；
④选择在特定位置的微单倍型分型数大于4个，且每种分型的概率相差比较近的位点；
⑤将上述选择的位点，放在华大基因的中国人群数据库中计算频率，选择等位基因频率大于或等于0.1的位点；
(2)引物设计：引物长度在18-25bp之间；各基因座引物的Tm值尽量一致；引物间不能形成二聚体、发夹结构等；PCR产物长度控制在140bp以内；引物内最好不要有连续相同的四个以上的碱基；保证引物在PCR中得到的扩增产物单一；
(3)复合体系PCR扩增：将上述筛选出的引物混合至同一反应体系中，保证模板浓度在一定范围内，寻找引物最适浓度，以期复合体系中的各位点可以得到最优扩增。
9.一种用于降解检材法医学鉴定的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括用于扩增权利要求1所述的23个微单倍型的扩增引物。
10.权利要求1所述的微单倍型复合扩增体系、权利要求8所述的微单倍型复合扩增体系构建方法和权利要求9所述的试剂盒中的任一项在降解检材法医学鉴定、检测中的应用。
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| CN108504749A (zh) * | 2018-04-16 | 2018-09-07 | 南京医科大学 | 29个微单倍型位点、筛选方法、复合扩增体系及应用 |
| CN108504744A (zh) * | 2018-03-14 | 2018-09-07 | 中国科学院北京基因组研究所 | 一种用于法医检测的微单倍型遗传标记及其试剂盒 |
| CN109852702A (zh) * | 2018-12-28 | 2019-06-07 | 四川大学 | 一种snp-snp标记的复合体系及其检测不平衡混合样本的方法和应用 |
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2020
- 2020-08-12 CN CN202010807636.2A patent/CN112063723B/zh active Active
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