CN112063705A - 用于鉴别柿树性别的引物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开用于鉴别柿树性别的引物，包括MF正向引物和MF反向引物，为序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。用于鉴别柿树性别引物的应用：柿基因组DNA的提取；利用正向引物和反向引物对所提取的DNA进行PCR扩增；对PCR产物进行克隆测序；根据测序结果对柿树进行性别鉴定。本发明所提供的MF引物可用于预测柿种质资源的雌雄类型，在样品性别来源未知的情况下，可通过检测样品中是否存在特异核苷酸序列，鉴定出其是否开雄花，鉴定结果的准确率大于91％，为柿性别的鉴定提供了简便、快捷、有效的分子标记。

Description

用于鉴别柿树性别的引物及其应用
技术领域
本发明涉及分子鉴别技术领域。具体地说是用于鉴别柿树性别的引物及其应用。
背景技术
柿(Diospyros kaki Thunb.)属于柿科(Ebenaceae)柿属(Diospyros)植物，是原产我国的、重要的木本粮食树种，在食品、保健、化工和医药等领域的开发价值和应用潜力越来越受到重视。柿绝大部分栽培品种为完全雌株(只开雌花)，少数为雌雄同株(同时开雌花和雄花)。此外，在我国的江苏、湖南、湖北、江西、广西等地的野生山区，存在少量完全雄株(只开雄花)。
日本学者以雌雄同株和完全雌株柿树为研究材料，对其性别决定位点进行分析发现，雄花的产生必然需要OGI基因的参与，也就是说，利用OGI基因可以将完全雌株和雌雄同株柿树进行区分(Akagi et al.，2016)。值得注意的是，受实验材料的限制，该研究并未对我国特有柿种质资源-完全雄株进行性别鉴定。因此，很有必要开发新的分子标记以探索其在柿完全雄株中的表现，这对于不同类型柿种质资源性别的精准鉴定，具有重要应用价值。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种用于鉴别柿树性别的引物及其应用，利用本发明的分子标记可有效筛选开雄花的柿种质资源(包括完全雄株和雌雄同株)和不开雄花的柿种质资源(完全雌株)。
为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
用于鉴别柿树性别的引物，包括MF正向引物和MF反向引物，其序列分别为序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的核苷酸序列。
上述用于鉴别柿树性别的引物用于鉴别柿树完全雄株和雌雄同株的应用。
上述用于鉴别柿树性别的引物的应用，采用PCR扩增方法和琼脂糖凝胶电泳检测技术，利用鉴别柿树性别的引物对柿树完全雄株和雌雄同株的性别鉴别。
上述用于鉴别柿树性别的引物的应用，
包括如下步骤：
(1)柿基因组DNA的提取；
(2)利用权利要求1所述的正向引物和反向引物对所提取的DNA进行PCR扩增，产物用1.0wt％的琼脂糖凝胶电泳检测；
(3)对PCR产物进行克隆测序；
(4)根据测序结果对柿树进行性别鉴定。
上述用于鉴别柿树性别的引物的应用，在步骤(1)中，使用Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒提取柿基因组DNA：
(1-1)称取0.5g的新鲜植物叶片，在液氮中充分研磨，转移到已灭菌的1.5ml离心管中；
(1-2)加700μL65℃预热的Buffer PCD和14μLβ-巯基乙醇到离心管中，充分混匀，65℃水浴20min，间或混摇2-3次；
(1-3)加等体积的氯仿到混合液中混匀，12000rpm离心5min；
(1-4)吸取上清液到一个新的1.5ml离心管中，加与上清液等体积的Buffer BD，吸打混匀，再加入与上清液等体积的无水乙醇，吸打混匀；
(1-5)转移离心管中的混合液到吸附柱中，室温静置2min，10000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体；
(1-6)吸取500μL混有异丙醇的PW Solution到吸附柱中，室温静置2min，10000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体；
(1-7)将吸附柱放回收集管中，在离心机上以12000rpm的转速离心2min；
(1-8)取出吸附柱置于新的1.5mL离心管中，加50μL 60℃预热的TE Buffer洗脱，室温静置3min，12000rpm离心2min，丢弃吸附柱，离心管中的液体即为获得的柿基因组DNA；
(1-9)柿基因组DNA提取后，利用紫外分光光度计检测样品的浓度，利用1.0wt％的琼脂糖凝胶检测样品的质量，样品检测合格后置于-20℃冰箱保存备用。
上述用于鉴别柿树性别的引物的应用，在步骤(2)中，PCR扩增的程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，重复循环30次；72℃延伸5min。
上述用于鉴别柿树性别的引物的应用，在步骤(2)中，PCR扩增的体系为：Taq DNA聚合酶12.5μL；浓度为10μM的上游引物1μL；浓度为10μM的下游引物1μL；模板DNA 1μL；ddH2O 9.5μL。
上述用于鉴别柿树性别的引物的应用，在步骤(2)中，PCR扩增产物用1.0wt％的琼脂糖凝胶电泳检测；电泳条件为150V、400mA，电泳时间为20min。
上述用于鉴别柿树性别的引物的应用，在步骤(3)中：
(3-1)PCR扩增产物经电泳检测合格后，用PCR产物纯化回收试剂盒进行凝胶回收；
(3-2)将回收纯化的产物连接到pUC18-T载体，转化到大肠杆菌；
(3-3)选择在IPTG/X-gal平板上生长的白色菌落，用牙签挑至含氨苄青霉素的液体培养基，37℃培养过夜；
(3-4)筛选白色单克隆菌斑进行PCR鉴定，挑选阳性菌落进行测序。
上述用于鉴别柿树性别的引物的应用，在步骤(4)中：完全雄株和雌雄同株的柿树有一条含有270bp的条带，其序列为序列表中SEQ ID No.3的核苷酸序列，雌株柿树未产生该条带。
本发明的技术方案取得了如下有益的技术效果：
本发明所提供的MF引物可用于预测柿种质资源的雌雄类型，在样品性别来源未知的情况下，可通过检测样品中是否存在特异核苷酸序列，鉴定出其是否开雄花，鉴定结果的准确率大于91％，为柿性别的鉴定提供了简便、快捷、有效的分子标记。
本发明引物对为开雄花柿种质资源专一性分子探针，根据样品中有无PCR扩增条带，即可判断检测个体是否开雄花，该方法简单、准确、灵敏度高，在柿种质资源的性别鉴定中具有重要意义。
附图说明
图1分子标记MF对柿完全雌株扩增结果；
图2分子标记MF对柿完全雄株扩增结果；
图3分子标记MF对柿雌雄同株扩增结果。
具体实施方式
实施例1分子标记引物MF
委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成用于鉴别柿树性别的分子标记引物MF，引物信息如表1所示。
表1
Figure BDA0002697188370000041
实施例2
利用实施例中的鉴别柿树性别的引物MF进行鉴别柿树性别的应用：
(1)提取柿树叶片DNA；
用Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒(生工，中国)分别提取86份(完全雌株36份，完全雄株33份，雌雄同株17份)柿树的基因组DNA，具体方法如下：
a)称取0.5g的新鲜植物叶片，在液氮中充分研磨，转移到已灭菌的1.5ml离心管中；
b)加700ul65℃预热的Buffer PCD和14ulβ-巯基乙醇到上述离心管中，充分混匀，65℃水浴20min，间或混摇2-3次；
c)加等体积的氯仿到混合液中混匀，12000rpm离心5min；
d)吸取上清液到一个新的1.5ml离心管中，加与上清液等体积的Buffer BD，吸打混匀，再加入与上清液等体积的无水乙醇，吸打混匀；
e)转移离心管中的混合液到吸附柱中，室温静置2min，10000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体；
f)吸取500ul混有异丙醇的PW Solution到吸附柱中，室温静置2min，10000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体；
g)继续吸取500ul混有无水乙醇的Wash Solution到吸附柱中，室温静置2min，10000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体；
h)将吸附柱放回收集管中，在离心机上以12000rpm的转速离心2min；
i)取出吸附柱置于新的1.5mL离心管中，加50ul 60℃预热的TE Buffer洗脱，室温静置3min，12000rpm离心2min，丢弃吸附柱，离心管中的液体即为获得的柿基因组DNA；
j)柿基因组DNA提取后，利用紫外分光光度计检测样品的浓度，利用1.0％的琼脂糖凝胶检测样品的质量，样品检测合格后置于-20℃冰箱保存备用。
(2)利用MF正向引物和MF反向引物对所提取的DNA进行PCR扩增；
PCR扩增体系：
Taq PCR Master Mix 12.5μL
10μM上游引物 1μL
10μM下游引物 1μL
模板DNA 1μL
Sterilized ddH2O 9.5μL
PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，重复循环30次；72℃延伸5min。
产物用1.0wt％的琼脂糖凝胶电泳检测(电泳结果如图1-图3所示)。
(3)对PCR产物进行克隆测序；
(3-1)PCR扩增产物经电泳检测合格后，用PCR产物纯化回收试剂盒(生工，中国)进行凝胶回收；
(3-2)将回收纯化的产物连接到pUC18-T载体，转化到大肠杆菌；
(3-3)选择在IPTG/X-gal平板上生长的白色菌落，用牙签挑至含氨苄青霉素的液体培养基，37℃培养过夜。
(3-4)筛选白色单克隆菌斑进行PCR鉴定(3％糖凝胶电泳检测)，挑选阳性菌落送至生工生物工程(上海)有限公司进行测序。
(4)根据测序结果对柿树进行性别鉴定。
86份(完全雌株36份，完全雄株33份，雌雄同株17份)柿树的检测结果如表2所示。
表2
Figure BDA0002697188370000071
Figure BDA0002697188370000081
结果显示：用MF引物扩增，完全雄株和雌雄同株样品均产生大小为270bp的条带，片段序列如SEQ ID No.3所示；除3株完全雌株获得扩增产物外，其余雌株样品均未产生条带。由此推测，利用MF引物可以准确鉴别柿树是否能开雄花。
SEQ ID No.3 270bp：
TTCACCAAGTATTGATTTTTATTGTACCATTGCTTATTCATCCTTAATCTTTGGATATTAAGGATTTTAAGTTAATGTATTTTATATTTAACTCACTTGTGTGTGAGAGAAATTTAATGTAATTTGTGAGGGTATGTAATTTGCTTCCAAATGTTCTTATTTACAAAAGAGTTACACTTTGAAGTTCTAGCATTCATACAAAAGCTAATGTTTATATGTTCATCGTTGAACCTTCAACATTTTGCTTAAAGAGAGAGAAAACACAATTTA。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本专利申请权利要求的保护范围之中。
序列表
<110> 国家林业和草原局泡桐研究开发中心
<120> 用于鉴别柿树性别的引物及其应用
<141> 2020-09-23
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcaccaagta ttgattttta ttgtaccat 29
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaattgtgtt ttctctctct ttaagca 27
<210> 3
<211> 270
<212> DNA
<213> Diospyros kaki
<400> 3
ttcaccaagt attgattttt attgtaccat tgcttattca tccttaatct ttggatatta 60
aggattttaa gttaatgtat tttatattta actcacttgt gtgtgagaga aatttaatgt 120
aatttgtgag ggtatgtaat ttgcttccaa atgttcttat ttacaaaaga gttacacttt 180
gaagttctag cattcataca aaagctaatg tttatatgtt catcgttgaa ccttcaacat 240
tttgcttaaa gagagagaaa acacaattta 270

Claims (10)

1.用于鉴别柿树性别的引物，其特征在于，包括MF正向引物和MF反向引物，其序列分别为序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的核苷酸序列。
2.权利要求1所述的用于鉴别柿树性别的引物用于鉴别柿树完全雄株和雌雄同株的应用。
3.根据权利要求2所述用于鉴别柿树性别的引物的应用，其特征在于，采用PCR扩增方法和琼脂糖凝胶电泳检测技术，利用鉴别柿树性别的引物对柿树完全雄株和雌雄同株的性别鉴别。
4.根据权利要求3所述用于鉴别柿树性别的引物的应用，其特征在于，包括如下步骤：
(1)柿基因组DNA的提取；
(2)利用权利要求1所述的正向引物和反向引物对所提取的DNA进行PCR扩增，产物用1.0wt％的琼脂糖凝胶电泳检测；
(3)对PCR产物进行克隆测序；
(4)根据测序结果对柿树进行性别鉴定。
5.根据权利要求3所述用于鉴别柿树性别的引物的应用，其特征在于，在步骤(1)中，使用Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒提取柿基因组DNA：
(1-1)称取0.5g的新鲜植物叶片，在液氮中充分研磨，转移到已灭菌的1.5ml离心管中；
(1-2)加700μL65℃预热的Buffer PCD和14μLβ-巯基乙醇到离心管中，充分混匀，65℃水浴20min，间或混摇2-3次；
(1-3)加等体积的氯仿到混合液中混匀，12000rpm离心5min；
(1-4)吸取上清液到一个新的1.5ml离心管中，加与上清液等体积的Buffer BD，吸打混匀，再加入与上清液等体积的无水乙醇，吸打混匀；
(1-5)转移离心管中的混合液到吸附柱中，室温静置2min，10000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体；
(1-6)吸取500μL混有异丙醇的PW Solution到吸附柱中，室温静置2min，10000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体；
(1-7)将吸附柱放回收集管中，在离心机上以12000rpm的转速离心2min；
(1-8)取出吸附柱置于新的1.5mL离心管中，加50μL 60℃预热的TE Buffer洗脱，室温静置3min，12000rpm离心2min，丢弃吸附柱，离心管中的液体即为获得的柿基因组DNA；
(1-9)柿基因组DNA提取后，利用紫外分光光度计检测样品的浓度，利用1.0wt％的琼脂糖凝胶检测样品的质量，样品检测合格后置于-20℃冰箱保存备用。
6.根据权利要求3所述用于鉴别柿树性别的引物的应用，其特征在于，在步骤(2)中，PCR扩增的程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，重复循环30次；72℃延伸5min。
7.根据权利要求3所述用于鉴别柿树性别的引物的应用，其特征在于，在步骤(2)中，PCR扩增的体系为：Taq DNA聚合酶12.5μL；浓度为10μM的上游引物1μL；浓度为10μM的下游引物1μL；模板DNA 1μL；ddH2O 9.5μL。
8.根据权利要求3所述用于鉴别柿树性别的引物的应用，其特征在于，在步骤(2)中，PCR扩增产物用1.0wt％的琼脂糖凝胶电泳检测；电泳条件为150V、400mA，电泳时间为20min。
9.根据权利要求3所述用于鉴别柿树性别的引物的应用，其特征在于，在步骤(3)中：
(3-1)PCR扩增产物经电泳检测合格后，用PCR产物纯化回收试剂盒进行凝胶回收；
(3-2)将回收纯化的产物连接到pUC18-T载体，转化到大肠杆菌；
(3-3)选择在IPTG/X-gal平板上生长的白色菌落，用牙签挑至含氨苄青霉素的液体培养基，37℃培养过夜；
(3-4)筛选白色单克隆菌斑进行PCR鉴定，挑选阳性菌落进行测序。
10.根据权利要求3所述用于鉴别柿树性别的引物的应用，其特征在于，在步骤(4)中：完全雄株和雌雄同株的柿树有一条含有270bp的条带，其序列为序列表中SEQ ID No.3的核苷酸序列，雌株柿树未产生该条带。
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