CN112063682A - 一种五大连池重碳酸矿泉水水源地嗜铁细菌培养基及其筛选方法 - Google Patents

一种五大连池重碳酸矿泉水水源地嗜铁细菌培养基及其筛选方法 Download PDF

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Abstract

一种五大连池重碳酸矿泉水水源地嗜铁细菌培养基及其筛选方法，本发明涉及嗜铁细菌的培养基及其筛选方法领域。本发明要解决现有使用Pipes为缓冲液筛选嗜铁细菌时需要调节pH，操作复杂的技术问题。该培养基为CAS检测平板培养基；方法：采集样品；制备LB液体培养基；制备CAS检测平板培养基；将样品加入到LB液体培养基，稀释；将稀释菌液涂布在CAS检测平板培养基上培养。本发明加入了特定的磷酸缓冲液，由于磷酸盐缓冲液缓冲能力强，在配制及培养过程中无需调pH及补加哌嗪二乙醇磺酸钠作为辅助，操作简便，嗜铁细菌筛选效果提高；并用五大连池重碳酸矿泉水替代蒸馏水，缩短筛菌培养时间。本发明用于筛选五大连池重碳酸矿泉水水源地嗜铁细菌。

Description

一种五大连池重碳酸矿泉水水源地嗜铁细菌培养基及其筛选 方法
技术领域
本发明涉及嗜铁细菌的培养基及其筛选方法领域。
背景技术
铁是地壳中含量居于第4位的元素，但其溶解性差，生物利用性极其有限。在有氧和中性pH值时，铁以难溶Fe(OH)3形式存在，在低铁环境下，绝大多数细菌和真菌都能通过非核糖体途径合成并分泌一种或几种嗜铁素(siderophore，又名高铁载体)。这些嗜铁素被分泌到微生物的细胞外或细胞表面作为螯合因子来获取Fe3+或者将铁变为可溶形式以便微生物利用，它们与Fe3+的特异性结合能力非常强(解离常数Ks为1022～1050)，并且嗜铁素可以从各种水溶性和非水溶性的化合物中夺走Fe3+。它广泛用于医药、造纸印染工业，化肥工业、农业等领域。因此，嗜铁素是一种重要的生物活性物质，在生命代谢中起着重要的调节作用，对其的研究具有重要的理论和应用指导意义。
五大连池冷矿泉水享有“神泉”、“圣水”的美誉，对人类的健康疗养具有非常神奇的功效。五大连池冷矿泉的类型多样，其中药泉山铁质重碳酸盐矿水区被开发得最为全面。然而，从天然重碳酸矿泉水中筛选分泌嗜铁素的嗜铁菌研究未见报道。
发明内容
本发明要解决现有使用Pipes为缓冲液筛选嗜铁细菌时需要调节pH，操作复杂的技术问题，而提供一种五大连池重碳酸矿泉水水源地嗜铁细菌培养基及其筛选方法。
一种五大连池重碳酸矿泉水水源地嗜铁细菌培养基，该培养基为CAS检测平板培养基；
CAS检测平板培养基包括CAS蓝色检测液、磷酸盐缓冲液和混合液，
其中CAS蓝色检测液由铬天青(CAS)溶液、FeCl3盐酸溶液和十六烷基三甲基溴化铵溶液混合而成；
磷酸盐缓冲液采用Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、KH2PO4、NH4Cl、NaCl和去离子水配制；
混合液由蔗糖溶液、酸水解酪蛋白溶液、CaCl2溶液、MgSO4溶液、琼脂和五大连池重碳酸矿泉水混合获得。
所述一种五大连池重碳酸矿泉水水源地嗜铁细菌的筛选方法，具体按以下步骤进行：
一、采集五大连池重碳酸矿泉水水源地的水样或泥样，获得样品，采集深度为5～10厘米；
二、配制LB液体培养基：将酵母提取物、胰蛋白胨、NaCl和蒸馏水混合均匀，分装，灭菌处理，获得LB液体培养基；
三、配制CAS检测平板培养基：
A、将铬天青溶于去离子水中，再加入FeCl3盐酸溶液，获得溶液a；
B、将十六烷基三甲基溴化铵溶于去离子水中，获得溶液b；
C、将溶液a加入到溶液b中，混合均匀，灭菌处理，得到CAS蓝色检测液；
D、采用Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、KH2PO4、NH4Cl、NaCl和去离子水配制磷酸盐缓冲液；磷酸盐缓冲液pH为6.8；
E、将磷酸盐缓冲液稀释，获得稀释缓冲液；
F、将蔗糖溶液、CaCl2溶液、MgSO4溶液、琼脂和五大连池重碳酸矿泉水混合，灭菌处理，获得混合液，降温至58～62℃，向混合液加入酸水解酪蛋白溶液、稀释缓冲液和CAS蓝色检测液，获得CAS检测平板培养基；
四、将步骤一获得的样品加入到步骤二获得的LB液体培养基，控制温度为35～37℃、转速为190～220r/min条件下振荡培养45～48h，然后按照10倍稀释法进行稀释，获得稀释菌液；
五、将步骤四获得的稀释菌液均匀涂布在步骤三获得的CAS检测平板培养基上，控制温度为26～28℃恒温培养3～5d，完成所述一种五大连池重碳酸矿泉水水源地嗜铁细菌的筛选方法。
本发明所述采集地五大连池重碳酸矿泉水水源地位于五大连池风景区南泉。在培养基配制时用五大连池重碳酸矿泉水替代蒸馏水，缩短了筛菌培养时间。
本发明的有益效果是：
本发明利用嗜铁细菌分泌的铁载体能螯合CAS检测液中的Fe3+进而导致培养基颜色由蓝变橙，在CAS检测平板上形成橙色铁载体分泌圈，并且在相同条件下，晕圈直径越大的细菌产铁载体能力越高，同时本发明在CAS检测平板基础上加入了特定的磷酸缓冲液，由于磷酸盐缓冲液缓冲能力强，因此在配制及培养过程中无需调pH及补加哌嗪二乙醇磺酸钠(Pipes)作为辅助，操作简便，同时在培养基中用五大连池重碳酸矿泉水替代蒸馏水配制培养基，嗜铁细菌筛选时间缩短，橘黄色菌圈产生时间加快。
试验显示菌液稀释度为10-7时，CAS检测平板筛菌效果最佳，可以观察到培养基中产生橘黄色菌圈的菌落为嗜铁细菌，仅用36h即筛选出了嗜铁细菌，加快了试验完成时间。
本发明培养基及其筛选方法用于筛选五大连池重碳酸矿泉水水源地嗜铁细菌。
附图说明
图1为实施例一步骤五稀释度为10-7时，培养后的培养基图片；
图2为未筛出嗜铁细菌的培养基图片。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举的具体实施方式，还包括各具体实施方式之间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式一种五大连池重碳酸矿泉水水源地嗜铁细菌培养基，该培养基为CAS检测平板培养基；
CAS检测平板培养基包括CAS蓝色检测液、磷酸盐缓冲液和混合液，
其中CAS蓝色检测液由铬天青溶液、FeCl3盐酸溶液和十六烷基三甲基溴化铵溶液混合而成；
磷酸盐缓冲液采用Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、KH2PO4、NH4Cl、NaCl和去离子水配制；
混合液由蔗糖溶液、酸水解酪蛋白溶液、CaCl2溶液、MgSO4溶液、琼脂和五大连池重碳酸矿泉水混合获得。
具体实施方式二：本实施方式一种五大连池重碳酸矿泉水水源地嗜铁细菌的筛选方法，具体按以下步骤进行：
一、采集五大连池重碳酸矿泉水水源地的水样或泥样，获得样品，采集深度为5～10厘米；
二、配制LB液体培养基：将酵母提取物、胰蛋白胨、NaCl和蒸馏水混合均匀，分装，灭菌处理，获得LB液体培养基；
三、配制CAS检测平板培养基：
A、将CAS溶于去离子水中，再加入FeCl3盐酸溶液，获得溶液a；
B、将十六烷基三甲基溴化铵溶于去离子水中，获得溶液b；
C、将溶液a加入到溶液b中，混合均匀，灭菌处理，得到CAS蓝色检测液；
D、采用Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、KH2PO4、NH4Cl、NaCl和去离子水配制磷酸盐缓冲液；磷酸盐缓冲液pH为6.8；
E、将磷酸盐缓冲液稀释，获得稀释缓冲液；
F、将蔗糖溶液、CaCl2溶液、MgSO4溶液、琼脂和五大连池重碳酸矿泉水混合，灭菌处理，获得混合液，降温至58～62℃，向混合液加入酸水解酪蛋白溶液、稀释缓冲液和CAS蓝色检测液，获得CAS检测平板培养基；
四、将步骤一获得的样品加入到步骤二获得的LB液体培养基，控制温度为35～37℃、转速为190～220r/min条件下振荡培养45～48h，然后按照10倍稀释法进行稀释，获得稀释菌液；
五、将步骤四获得的稀释菌液均匀涂布在步骤三获得的CAS检测平板培养基上，控制温度为26～28℃恒温培养3～5d，完成所述一种五大连池重碳酸矿泉水水源地嗜铁细菌的筛选方法。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是：步骤二所述LB液体培养基中酵母提取物、胰蛋白胨、NaCl和蒸馏水的用量比为5g∶10g∶10g∶1000mL。其它与具体实施方式二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式二或三不同的是：步骤A中CAS与去离子水的质量体积比为0.07g∶50mL，FeCl3盐酸溶液与去离子水的体积比为1∶5，FeCl3盐酸溶液中FeCl3的浓度为1mmol·L-1、HCl的浓度为1mmol·L-1。其它与具体实施方式二或三相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式二至四之一不同的是：步骤B中十六烷基三甲基溴化铵与去离子水的质量体积比为0.06g∶40mL。其它与具体实施方式二至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式二至五之一不同的是：步骤C中溶液a加入到溶液b的体积比为60∶(37～42)。其它与具体实施方式二至五之一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式二至六之一不同的是：步骤D中每100mL磷酸盐缓冲液中含2.427g Na2HPO4·12H2O、0.5905g NaH2PO4·2H2O、0.075g KH2PO4、0.250g NH4Cl、0.125g NaCl；磷酸盐缓冲液pH为6.8。其它与具体实施方式二至六之一相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式二至七之一不同的是：步骤E将磷酸盐缓冲液10倍稀释。其它与具体实施方式二至七之一相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式二至八之一不同的是：步骤F中混合液中各组分用量为：1mL质量百分含量为20％的蔗糖溶液、0.1mL浓度为1mmol/L的CaCl2溶液、2mL浓度为1mmol/L的MgSO4溶液、1.8g琼脂和100mL五大连池重碳酸矿泉水；混合液、酸水解酪蛋白溶液、稀释缓冲液与CAS蓝色检测液的体积比为(100～104)mL∶3mL∶5mL∶5mL，酸水解酪蛋白溶液中酸水解酪素的质量百分含量为10％。其它与具体实施方式二至八之一相同。
具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式二至九之一不同的是：步骤五中将稀释度为10-2～10-9中每个稀释度取100μL稀释菌液进行涂布。其它与具体实施方式二至九之一相同。
采用以下实施例验证本发明的有益效果：
实施例一：
本实施例一种五大连池重碳酸矿泉水水源地嗜铁细菌培养基，该培养基为CAS检测平板培养基；
CAS检测平板培养基包括CAS蓝色检测液、磷酸盐缓冲液和混合液，
其中CAS蓝色检测液由铬天青溶液、FeCl3盐酸溶液和十六烷基三甲基溴化铵溶液混合而成；
磷酸盐缓冲液采用Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、KH2PO4、NH4Cl、NaCl和去离子水配制；
混合液由蔗糖溶液、酸水解酪素、CaCl2溶液、MgSO4溶液、琼脂和五大连池重碳酸矿泉水混合获得。
所述一种五大连池重碳酸矿泉水水源地嗜铁细菌的筛选方法，具体按以下步骤进行：
一、采集五大连池重碳酸矿泉水水源地的水样或泥样，获得样品，采集深度为5～10厘米；
二、配制LB液体培养基：将5g酵母提取物、10g胰蛋白胨、10gNaCl和1000mL蒸馏水混合均匀，分装，控制温度为121℃灭菌处理15min，获得LB液体培养基；
三、配制CAS检测平板培养基：
A、将0.07g铬天青溶于50mL去离子水中，再加入10mLFeCl3盐酸溶液，获得溶液a；FeCl3盐酸溶液中FeCl3的浓度为1mmol·L-1、HCl的浓度为1mmol·L-1；
B、将0.06g十六烷基三甲基溴化铵溶于40mL去离子水中，获得溶液b；
C、将溶液a加入到溶液b中，混合均匀，控制温度为121℃灭菌处理15min，得到CAS蓝色检测液；
D、采用Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、KH2PO4、NH4Cl、NaCl和去离子水配制磷酸盐缓冲液；磷酸盐缓冲液pH为6.8；每100mL磷酸盐缓冲液中含2.427g Na2HPO4·12H2O、0.5905g NaH2PO4·2H2O、0.075g KH2PO4、0.250g NH4Cl、0.125g NaCl；
E、将磷酸盐缓冲液10倍稀释，获得稀释缓冲液；
F、将1mL质量百分含量为20％的蔗糖溶液、0.1mL浓度为1mmol/L的CaCl2溶液、2mL浓度为1mmol/L的MgSO4溶液、1.8g琼脂和100mL五大连池重碳酸矿泉水混合，控制温度为121℃灭菌处理15min，获得混合液，降温至60℃，向100mL混合液加入3mL酸水解酪蛋白溶液、5mL稀释缓冲液和5mL CAS蓝色检测液，获得CAS检测平板培养基；其中酸水解酪蛋白溶液中酸水解酪素的质量百分含量为10％；
四、将1mL步骤一获得的样品加入到100mL步骤二获得的LB液体培养基，控制温度为37℃、转速为200r/min条件下振荡培养48h，然后按照10倍稀释法进行稀释，获得稀释菌液；
五、将步骤四获得的稀释菌液中稀释度为10-2～10-9中每个稀释度取100μL稀释菌液分别均匀涂布在步骤三获得的CAS检测平板培养基上，控制温度为28℃恒温培养3～5d，完成所述一种五大连池重碳酸矿泉水水源地嗜铁细菌的筛选方法。
采用本方法培养36h观察到CAS检测平板中产生了橘黄色嗜铁素螯合圈。
经检测本实施例中五大连池重碳酸矿泉水的水质检测报告如下：
Figure BDA0002689428680000061
Figure BDA0002689428680000071
图1为实施例一步骤五稀释度为10-7时，培养后的培养基图片；
图2为未筛出嗜铁细菌的培养基图片。由图可以观察出采用本实施例培养基筛选嗜铁细菌的培养基图片中产生橘黄色菌圈的菌落为嗜铁细菌。试验显示菌液稀释度为10-7时，CAS检测平板筛菌效果最佳，稀释度过小，菌液浓度高不易产生单菌落，影响橘黄色菌圈观察效果；稀释度过大易出现无菌种生长的结果，也不适于结果观察。细菌分泌的铁载体能螯合CAS检测液中的Fe3+而导致颜色由蓝变橙，在CAS检测平板上形成橙色铁载体分泌圈。相同条件下，晕圈直径越大的细菌产铁载体能力越高。由于磷酸盐缓冲液缓冲能力强，不需要补加哌嗪二乙醇磺酸钠(Pipes)作为辅助，配制过程中无需调pH。并且由于用五大连池重碳酸矿泉水替代蒸馏水配制培养基，重碳酸矿泉水中含有Fe2+，接触空气后被氧化为Fe3+，增加嗜铁细菌的营养物质，缩短橘黄色菌圈产生的时间，仅用36h即筛选出了嗜铁细菌，加快试验完成时间。

Claims (10)

1.一种五大连池重碳酸矿泉水水源地嗜铁细菌培养基，其特征在于该培养基为CAS检测平板培养基；
CAS检测平板培养基包括CAS蓝色检测液、磷酸盐缓冲液和混合液，
其中CAS蓝色检测液由铬天青溶液、FeCl3盐酸溶液和十六烷基三甲基溴化铵溶液混合而成；
磷酸盐缓冲液采用Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、KH2PO4、NH4Cl、NaCl和去离子水配制；
混合液由蔗糖溶液、酸水解酪蛋白溶液、CaCl2溶液、MgSO4溶液、琼脂和五大连池重碳酸矿泉水混合获得。
2.一种五大连池重碳酸矿泉水水源地嗜铁细菌的筛选方法，其特征在于该方法具体按以下步骤进行：
一、采集五大连池重碳酸矿泉水水源地的水样或泥样，获得样品，采集深度为5～10厘米；
二、配制LB液体培养基：将酵母提取物、胰蛋白胨、NaCl和蒸馏水混合均匀，分装，灭菌处理，获得LB液体培养基；
三、配制CAS检测平板培养基：
A、将CAS溶于去离子水中，再加入FeCl3盐酸溶液，获得溶液a；
B、将十六烷基三甲基溴化铵溶于去离子水中，获得溶液b；
C、将溶液a加入到溶液b中，混合均匀，灭菌处理，得到CAS蓝色检测液；
D、采用Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、KH2PO4、NH4Cl、NaCl和去离子水配制磷酸盐缓冲液；磷酸盐缓冲液pH为6.8；
E、将磷酸盐缓冲液稀释，获得稀释缓冲液；
F、将蔗糖溶液、CaCl2溶液、MgSO4溶液、琼脂和五大连池重碳酸矿泉水混合，灭菌处理，获得混合液，降温至58～62℃，向混合液加入酸水解酪蛋白溶液、稀释缓冲液和CAS蓝色检测液，获得CAS检测平板培养基；
四、将步骤一获得的样品加入到步骤二获得的LB液体培养基，控制温度为35～37℃、转速为190～220r/min条件下振荡培养45～48h，然后按照10倍稀释法进行稀释，获得稀释菌液；
五、将步骤四获得的稀释菌液均匀涂布在步骤三获得的CAS检测平板培养基上，控制温度为26～28℃恒温培养3～5d，完成所述一种五大连池重碳酸矿泉水水源地嗜铁细菌的筛选方法。
3.根据权利要求2所述的一种五大连池重碳酸矿泉水水源地嗜铁细菌的筛选方法，其特征在于步骤二所述LB液体培养基中酵母提取物、胰蛋白胨、NaCl和蒸馏水的用量比为5g∶10g∶10g∶1000mL。
4.根据权利要求2所述的一种五大连池重碳酸矿泉水水源地嗜铁细菌的筛选方法，其特征在于步骤A中CAS与去离子水的质量体积比为0.07g∶50mL，FeCl3盐酸溶液与去离子水的体积比为1∶5，FeCl3盐酸溶液中FeCl3的浓度为1mmol·L-1、HCl的浓度为1mmol·L-1。
5.根据权利要求2所述的一种五大连池重碳酸矿泉水水源地嗜铁细菌的筛选方法，其特征在于步骤B中十六烷基三甲基溴化铵与去离子水的质量体积比为0.06g∶40mL。
6.根据权利要求2所述的一种五大连池重碳酸矿泉水水源地嗜铁细菌的筛选方法，其特征在于步骤C中溶液a加入到溶液b的体积比为60∶(37～42)。
7.根据权利要求2所述的一种五大连池重碳酸矿泉水水源地嗜铁细菌的筛选方法，其特征在于步骤D中每100mL磷酸盐缓冲液中含2.427g Na2HPO4·12H2O、0.5905g NaH2PO4·2H2O、0.075g KH2PO4、0.250g NH4Cl、0.125g NaCl；磷酸盐缓冲液pH为6.8。
8.根据权利要求2所述的一种五大连池重碳酸矿泉水水源地嗜铁细菌的筛选方法，其特征在于步骤E将磷酸盐缓冲液10倍稀释。
9.根据权利要求2所述的一种五大连池重碳酸矿泉水水源地嗜铁细菌的筛选方法，其特征在于步骤F中混合液中各组分用量为：1mL质量百分含量为20％的蔗糖溶液、0.1mL浓度为1mmol/L的CaCl2溶液、2mL浓度为1mmol/L的MgSO4溶液、1.8g琼脂和100mL五大连池重碳酸矿泉水；混合液、酸水解酪蛋白溶液、稀释缓冲液与CAS蓝色检测液的体积比为(100～104)mL∶3mL∶5mL∶5mL，酸水解酪蛋白溶液中酸水解酪素的质量百分含量为10％。
10.根据权利要求2所述的一种五大连池重碳酸矿泉水水源地嗜铁细菌的筛选方法，其特征在于步骤五中将稀释度为10-2～10-9中每个稀释度取100μL稀释菌液进行涂布。
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赵翔等: "适合高产铁载体细菌筛选、检测体系的改进与探析", 微生物学通报, vol. 6, no. 33 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2616956A (en) * 2022-01-28 2023-09-27 Theunseen Ltd Antimicrobial indicator composition

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