CN112063639B - 一种双信号嵌合抗原受体及其制备方法和应用 - Google Patents

一种双信号嵌合抗原受体及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112063639B
CN112063639B CN201910498634.7A CN201910498634A CN112063639B CN 112063639 B CN112063639 B CN 112063639B CN 201910498634 A CN201910498634 A CN 201910498634A CN 112063639 B CN112063639 B CN 112063639B
Authority
CN
China
Prior art keywords
antigen receptor
eso
chimeric antigen
signal
double
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910498634.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112063639A (zh
Inventor
刘兵
周美龄
刘韬
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Luohu Peoplel's Hospital
Original Assignee
Shenzhen Luohu Peoplel's Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Luohu Peoplel's Hospital filed Critical Shenzhen Luohu Peoplel's Hospital
Priority to CN201910498634.7A priority Critical patent/CN112063639B/zh
Publication of CN112063639A publication Critical patent/CN112063639A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112063639B publication Critical patent/CN112063639B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3069—Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0646—Natural killers cells [NK], NKT cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种用于表达双信号嵌合抗原受体的基因片段，所述用于表达双信号嵌合抗原受体的基因片段包括顺次连接的γδTCR基因片段及NY‑ESO‑1单链基因片段。其中，γδTCR基因片段表达的γδTCR抗原受体能够特异性识别过度表达高代谢恶性肿瘤细胞表面的磷酸化抗原小分子，作为第一识别信号；当γδTCR抗原受体进行识别之后，所述NY‑ESO‑1单链基因表达的NY‑ESO‑1单链抗体能够特异性地识别恶性肿瘤细胞表面对应的肿瘤抗原，作为第二识别信号，激活下游信号分子快速特异性杀死肿瘤细胞。所述的双信号嵌合抗原受体采用双重识别信号，使其具有高靶向性，提高了抗原受体在肿瘤细胞表面定位的准确性和高效性。

Description

一种双信号嵌合抗原受体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种双信号嵌合抗原受体及其制备方法和应用。
背景技术
新陈代谢是机体生命活动的基本特征，包括物质代谢和与之相伴的能量代谢。有机体在物质代谢过程中能量的释放、转换和利用过程，称为能量代谢。恶性肿瘤的一个重要特征为肿瘤细胞的高代谢能力，肿瘤细胞高代谢可以特异性地过度产生肿瘤磷酸化抗原小分子。
近年来过继性细胞治疗技术中，嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)修饰的T细胞技术在治疗肿瘤的临床应用中取得了显著的突破，在临床试验中表现出良好的靶向性、杀伤性和持久性，展示了巨大的应用潜力和发展前景。但是，最新的临床实验中发现CAR-T技术具有引起细胞因子风暴及系统性神经毒性等高风险因素。
自然杀伤(Natural Killer，NK)细胞是人体先天免疫的核心组成部分，是与T、B细胞并列的第三类群淋巴细胞，来源于造血干细胞，在骨髓内发育成熟。在外周血中约占淋巴细胞总数的10％～15％，脾内约有3％～4％，也可出现在肺脏、肝脏和肠粘膜，但在胸腺、淋巴结和胸导管中罕见。与T细胞比较，NK细胞具有很多特点：固有免疫细胞、非特异性直接杀伤靶细胞、不需要预先由抗原致敏、不需要抗体参与、无MHC限制性、发挥免疫杀伤作用早。NK细胞通过多种细胞表面受体包括NKG2D，CD16(ADCC效应介导受体)以及天然细胞毒性受体NKp44，NKp46，NKp30等识别被感染的和恶性癌变的细胞，这些受体激活含有免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)结构的调控蛋白DAP10、DAP12，ITAM结构能启动细胞毒性颗粒蛋白的释放并调控IFN-γ和TNF-α等细胞因子和趋化因子的分泌。为了克服CAR-T细胞技术临床应用中的风险，应用NK细胞代替T细胞作为效应细胞有望发挥出更安全的特异性抗肿瘤作用。
寻找和鉴定新的肿瘤特异性或相关性抗原是肿瘤免疫学研究的关键之一。随着重组cDNA文库血清学分析技术(serological analysis of recombinantcDNA expressionlibraries，SEREX)、细胞毒性T细胞(cytotoxic T cell，CTL)克隆识别技术、生物信息学技术为基础的抗原鉴定体系的应用，大量的肿瘤特异性和相关性抗原被发现，其中癌-睾丸抗原(cancer-testis antigen，CT)被认为最具有前景的肿瘤相关抗原之一，其特点是在多种组织来源的肿瘤细胞中表达，但在正常组织中的表达仅限于睾丸和胚胎组织。由于生殖细胞不表达HLA分子以及血睾屏障的存在，因此针对CT抗原的肿瘤免疫治疗一般不会对正常组织细胞产生免疫毒性。NY-ESO-1(New York esophageal squamous cell carcinoma 1，NY-ESO-1)是CT抗原基因家族中的重要一员，由于其在肿瘤抗原中具有较强的免疫原性，并在多种肿瘤组织(恶性黑素瘤、肝细胞癌、卵巢癌等)中表达而在肿瘤治疗领域备受关注。
发明内容
本发明的目的在于提供一种双信号嵌合抗原受体及其制备方法和应用，旨在解决现有技术杀伤恶性肿瘤细胞的抗原受体靶向性差、定位不准确的问题。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种用于表达双信号嵌合抗原受体的基因片段，所述用于表达双信号嵌合抗原受体的基因片段包括顺次连接的γδTCR基因片段及NY-ESO-1单链基因片段；其中，所述γδTCR基因片段的碱基序列如Sequence No.1；所述NY-ESO-1单链基因片段的碱基序列如Sequence No.2。
以及，一种双信号嵌合抗原受体，所述双信号嵌合抗原受体包括顺次连接的γδTCR抗原受体和NY-ESO-1单链受体，所述γδTCR抗原受体的氨基酸序列如Sequence No.3，.所述NY-ESO-1单链抗体的氨基酸序列如Sequence No.4。
以及，一种双信号嵌合抗原受体慢病毒表达载体，所述双信号嵌合抗原受体慢病毒表达载体包括上述用于表达双信号嵌合抗原受体的基因片段或上述的双信号嵌合抗原受体。
以及，一种双信号嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞，所述双信号嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞含有所述用于表达双信号嵌合抗原受体的基因片段或所述的双信号嵌合抗原受体。
以及，一种双信号嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞的制备方法，包括如下步骤：
合成所述用于表达双信号嵌合抗原受体的基因片段，克隆至慢病毒表达载体，制备得到含有所述用于表达双信号嵌合抗原受体的基因片段的慢病毒表达载体；
包装含有所述用于表达双信号嵌合抗原受体的基因片段的慢病毒表达载体，得到含有所述用于表达双信号嵌合抗原受体的基因片段的慢病毒；
利用含有所述用于表达双信号嵌合抗原受体的基因片段的慢病毒感染外周血来源的自然杀伤细胞，得到所述双信号嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞。
与现有技术相比，本发明所述的一种用于表达双信号嵌合抗原受体的基因片段，所述用于表达双信号嵌合抗原受体的基因片段包括顺次连接的γδTCR基因片段及NY-ESO-1单链基因片段；其中，所述γδTCR基因片段作为所述双信号嵌合抗原受体的第一识别信号，能够表达γδTCR抗原受体，特异性识别过度表达高代谢恶性肿瘤细胞表面的磷酸化抗原小分子，进行抗原定位的功能；同时NY-ESO-1单链基因片段作为所述双信号嵌合抗原受体的第二识别信号，所述NY-ESO-1单链基因片段能够表达NY-ESO-1单链抗原受体，能够特异性地识别恶性肿瘤细胞表面对应的肿瘤抗原，进一步将双信号嵌合抗原受体特异性定位于肿瘤细胞表面，提高其靶向性，提高了杀伤恶性肿瘤细胞的抗原受体定位的准确性。
本发明所述的一种双信号嵌合抗原受体，包括顺次连接的γδTCR抗原受体和NY-ESO-1单链受体，所述γδTCR抗原受体能够特异性识别过度表达高代谢恶性肿瘤细胞表面的磷酸化抗原小分子，进行抗原定位的功能，作为所述双信号嵌合抗原受体的第一识别信号；同时NY-ESO-1单链抗体能够特异性地识别恶性肿瘤细胞表面对应的肿瘤抗原，作为所述双信号嵌合抗原受体的第二识别信号，进一步将双信号嵌合抗原受体特异性定位于肿瘤细胞表面，进而激活所述双信号嵌合抗原受体下游的信号分子，使信号分子发挥作用，快速特异性杀死肿瘤细胞。所述的双信号嵌合抗原受体采用双重识别信号，使其具有高靶向性，提高了抗原受体在肿瘤细胞表面定位的准确性和高效性。
本发明所述的一种双信号嵌合抗原受体慢病毒表达载体，所述双信号嵌合抗原受体慢病毒表达载体包括上述用于表达双信号嵌合抗原受体的基因片段或上述的双信号嵌合抗原受体。该慢病毒表达载体能够分别发挥上述第一识别信号和第二识别信号的作用，能够快速、特异性地识别恶性肿瘤细胞表面对应的肿瘤抗原，具有高靶向性，提高了抗原受体在肿瘤细胞表面定位的准确性和高效性。
本发明所述的一种双信号嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞，所述双信号嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞含有所述用于表达双信号嵌合抗原受体的基因片段或所述的双信号嵌合抗原受体。所述自然杀伤细胞能够成功诱导表达上述双信号嵌合抗原受体，能够分别发挥第一识别信号和第二识别信号，能够快速、特异性地识别恶性肿瘤细胞表面对应的肿瘤抗原，具有高靶向性，提高了抗原受体在肿瘤细胞表面定位的准确性和高效性。
本发明所述的一种双信号嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞的制备方法，该制备方法能够在实现本发明双信号嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞上述有益效果的同时，赋予所述双信号嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞的稳定性能，使所述自然杀伤细胞能够成功诱导表达上述双信号嵌合抗原受体，能够分别发挥第一识别信号和第二识别信号，能够快速、特异性地识别恶性肿瘤细胞表面对应的肿瘤抗原，具有高靶向性，提高了抗原受体在肿瘤细胞表面定位的准确性和高效性。此外，此制备方法工艺简单，条件可控，操作便捷。
附图说明
图1是本发明实施例提供的PLV-Easy-T-2.1-γδTCR/NY-ESO-1-CAR慢病毒表达载体基因片段的结构。
图2是本发明实施例提供的PLV-EasyT-2.1-γδTCR/NY-ESO-1-CAR慢病毒的质粒示意图。
图3是本发明实施例提供的是各效应细胞体外杀伤检测图。
图4是本发明实施例提供的是荷瘤NOD-SCID小鼠体内肿瘤的生长曲线。
图5是本发明实施例提供的治疗结束后荷瘤NOD-SCID小鼠体内肿瘤重量。
图6是本发明实施例提供的荷瘤NOD-SCID小鼠生存周期曲线图。
图7是本发明实施例提供各效应细胞IFN-γ分泌量检测图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和技术效果更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。结合本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
在本发明中，所述“NY-ESO-1”是指纽约食管鳞状细胞癌1(New York esophagealsquamous cell carcinoma 1，NY-ESO-1)，是CT抗原基因家族中的重要一员，由于其在肿瘤抗原中具有较强的免疫原性，在许多肿瘤中再表达。NY-ESO-1具有引发自发性体液免疫和细胞免疫应答的功能以及限制性表达模式，是肿瘤免疫治疗的良好候选靶标。
在本发明中，所述“慢病毒表达载体”是指以人类免疫缺陷病毒-1(H IV-1)来源的一种病毒载体，慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，是慢病毒载体系统的主要组成部分。携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，通过感染细胞或活体组织，实现外源基因在细胞或活体组织中表达。
在本发明中，所述“自然杀伤细胞”，即natural killer cell(NK)，是机体重要的免疫细胞，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生，能够识别靶细胞、杀伤介质。
本发明实例提供一种用于表达双信号嵌合抗原受体的基因片段，所述用于表达双信号嵌合抗原受体的基因片段包括顺次连接的γδTCR基因片段及NY-ESO-1单链基因片段；其中，所述γδTCR基因片段的碱基序列如Sequence No.1；所述NY-ESO-1单链基因片段的碱基序列如Sequence No.2。
具体的，由于γδTCR基因片段作为第一识别信号，可以识别非肽抗原，通过在细胞表面先表达γδTCR抗原受体，可以优先识别过度表达的高代谢磷酸化的抗原小分子，对恶性肿瘤细胞进行定位，使该双信号嵌合抗原受体具有更强的靶向性。
优选的，所述γδTCR基因片段的碱基序列如Sequence No.1，碱基序列如下：
5’-ATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAGCATTCCTCCTGATCCCAATGCTGTCACTGCTCCACGCATCAACGCTGGCAGTCCTTGGGGCTCTGTGTGTATATGGTGCAGGTCACCTAGAGCAACCTCAAATTTCCAGTACTAAAACGCTGTCAAAAACAGCCCGCCTGGAATGTGTGGTGTCTGGAATAACAATTTCTGCAACATCTGTATATTGGTATCGAGAGAGACCTGGTGAAGTCATACAGTTCCTGGTGTCCATTTCATATGACGGCACTGTCAGAAAGGAATCCGGCATTCCGTCAGGCAAATTTGAGGTGGATAGGATACCTGAAACGTCTACATCCACTCTCACCATTCACAATGTAGAGAAACAGGACATAGCTACCTACTACTGTGCCTTGTGGGAGGCCCAGCAAGAGTTGGGCAAAAAAATCAAGGTATTTGGTCCCGGAACAAAGCTTATCATTACAGATAAACAACTTGATGCAGATGTTTCCCCCAAGCCCACTATTTTTCTTCCTTCAATTGCTGAAACAAAGCTCCAGAAGGCTGGAACATACCTTTGTCTTCTTGAGAAATTTTTCCCTGATGTTATTAAGATACATTGGGAAGAAAAGAAGAGCAACACGATTCTGGGATCCCAGGAGGGGAACACCATGAAGACTAATGACACATACATGAAATTTAGCTGGTTAACGGTGCCAGAAAAGTCACTGGACAAAGAACACAGATGTATCGTCAGACATGAGAATAATAAAAACGGAGTTGATCAAGAAATTATCTTTCCTCCAATAAAGACAGATGTCATCACAATGGATCCCAAAGACAATTGTTCAAAAGATGCAAATGATACACTACTGCTGCAGATGCAGAGGATCTCCTCCCTCATCCATCTCTCTCTCTTCTGGGCAGGAGTCATGTCAGCCATTGAGTTGGTGCCTGAACACCAAACAGTGCCTGTGTCAATAGGGGTCCCTGCCACCCTCAGGTGCTCCATGAAAGGAGAAGCGATCGGTAACTACTATATCAACTGGTACAGGAAGACCCAAGGTAACACAATGACTTTCATATACCGAGAAAAGGACATCTATGGCCCTGGTTTCAAAGACAATTTCCAAGGTGACATTGATATTGCAAAGAACCTGGCTGTACTTAAGATACTTGCACCATCAGAGAGAGATGAAGGGTCTTACTACTGTGCCTGTGACACCTTGGGGATGGGGGGGGAATACACCGATAAACTCATCTTTGGAAAAGGAACCCGTGTGACTGTGGAACCAAGAAGTCAGCCTCATACCAAACCATCCGTTTTTGTCATGAAAAATGGAACAAATGTCGCTTGTCTGGTGAAGGAATTCTACCCCAAGGATATAAGAATAAATCTCGTGTCATCCAAGAAGATAACAGAGTTTGATCCTGCTATTGTCATCTCTCCCAGTGGGAAGTACAATGCTGTCAAGCTTGGTAAATATGAAGATTCAAATTCAGTGACATGTTCAGTTCAACACGACAATAAAACTGTGCACTCCACTGACTTTGAAGTGAAGACAGATTCTACAGATCACGTAAAACCAAAGGAAACTGAAAACACAAAGCAACCTTCAAAGAGCTGCCATAAACCCAAAGCCATAGTTCATACCGAGAAGTAA-3’。
具体的，NY-ESO-1单链基因片段作为所述双信号嵌合抗原受体的第二识别信号，所述NY-ESO-1单链基因片段能够表达NY-ESO-1单链抗原受体，能够特异性地识别恶性肿瘤细胞表面对应的肿瘤抗原，进一步将双信号嵌合抗原受体特异性定位于肿瘤细胞表面，提高其靶向性，提高了杀伤恶性肿瘤细胞的抗原受体定位的准确性。
优选的，所述NY-ESO-1单链基因片段的碱基序列如Sequence No.2，碱基序列如下：
5’-GAAGTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGGCGGTCTTGTTCAGCCTGGTGGTTCTTTACGTCTTTCTTGCGCTGCTTCCGGATTCACTTTCTCTACTTACCAGATGTCTTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTAAAGGTTTGGAGTGGGTTTCTGGTATCGTTTCTTCTGGTGGCTCTACTGCTTATGCTGACTCCGTTAAAGGTCGCTTCACTATCTCTAGAGACAACTCTAAGAATACTCTCTACTTGCAGATGAACAGCTTAAGGGCTGAGGACACTGCAGTCTACTATTGTGCGGGGGAGCTACTTCCCTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCAAGCGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGATCTCAGAGCGAATTGACTCAGCCTCGCTCAGTGTCCGGGTCTCCTGGACAGTCAGTCACCATCTCCTGCACTGGGACCAGCCGTGATGTTGGTGGTTATAACTATGTCTCCTGGTACCAACAACACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATAATTCATGATGTCATAGAGCGGTCGTCAGGGGTCCCTGATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGATGAGGCTGATTATTATTGCTGGTCATTTGCAGGCTCCTATTATGTCTTCGGGACAGGGACCGACGTCACCGTCCTCCCCAAGCTTGGG-3’。
在本发明具体实施例中，所述用于表达双信号嵌合抗原受体的基因片段包括顺次连接的第一信号肽基因片段、γδTCR基因片段、T2A基因片段、第二信号肽基因片段、NY-ESO-1单链基因片段、CD8铰链区及跨膜结构域基因片段、41BB胞内结构域基因片段及DAP12-ITAM结构域基因片段。
本发明另一实施例提供了一种双信号嵌合抗原受体，所述双信号嵌合抗原受体包括顺次连接的γδTCR抗原受体和NY-ESO-1单链受体，所述γδTCR抗原受体的氨基酸序列如Sequence No.3，所述NY-ESO-1单链抗体的氨基酸序列如Sequence No.4。
具体的，所述双信号嵌合抗原受体由上述用于表达双信号嵌合抗原受体的基因片段表达得到的双信号嵌合抗原受体蛋白质片段。具体的，所述双信号嵌合抗原受体包括：γδTCR抗原受体。所述γδTCR抗原受体可以识别非肽抗原，通过在细胞表面先表达γδTCR抗原受体，作为第一识别信号，可以优先识别过度表达的高代谢磷酸化的抗原小分子，对恶性肿瘤细胞进行定位。作为所述双信号嵌合抗原受体的第一识别信号，进行抗原定位的功能，使该双信号嵌合抗原受体具有更强的靶向性。
优选的，所述γδTCR抗原受体的氨基酸序列如Sequence No.3，氨基酸序列如下：
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPMLSLLHASTLAVLGALCVYGAGHLEQPQISSTKTLSKTARLECVVSGITISATSVYWYRERPGEVIQFLVSISYDGTVRKESGIPSGKFEVDRIPETSTSTLTIHNVEKQDIATYYCALWEAQQELGKKIKVFGPGTKLIITDKQLDADVSPKPTIFLPSIAETKLQKAGTYLCLLEKFFPDVIKIHWEEKKSNTILGSQEGNTMKTNDTYMKFSWLTVPEKSLDKEHRCIVRHENNKNGVDQEIIFPPIKTDVITMDPKDNCSKDANDTLLLQMQRISSLIHLSLFWAGVMSAIELVPEHQTVPVSIGVPATLRCSMKGEAIGNYYINWYRKTQGNTMTFIYREKDIYGPGFKDNFQGDIDIAKNLAVLKILAPSERDEGSYYCACDTLGMGGEYTDKLIFGKGTRVTVEPRSQPHTKPSVFVMKNGTNVACLVKEFYPKDIRINLVSSKKITEFDPAIVISPSGKYNAVKLGKYEDSNSVTCSVQHDNKTVHSTDFEVKTDSTDHVKPKETENTKQPSKSCHKPKAIVHTEK。
具体的，所述双信号嵌合抗原受体还包括NY-ESO-1单链抗体。由于NY-ESO-1单链抗体是抗原基因家族中重要的一员，在肿瘤抗原中具有较强的免疫原性，同时利用NY-ESO-1单链抗体作为第二识别信号，对肿瘤细胞表面的肿瘤抗原进行特异性定位，进一步保证该双信号嵌合抗原受体定位准确，具有高度靶向性。
优选的，所述NY-ESO-1单链抗体包括NY-ESO-1抗体重链可变区VH和NY-ESO-1抗体轻链可变区VL。所述NY-ESO-1抗体重链可变区VH和NY-ESO-1抗体轻链可变区VL由连接肽(Gly4Ser)3连接。
在本发明具体实施例中，NY-ESO-1抗体重链可变区VH及NY-ESO-1抗体轻链可变区VL基因的制备方法如下：
S01.获取NY-ESO-1抗原免疫小鼠总cDNA；
S02.以所述NY-ESO-1抗原免疫小鼠总cDNA为模板，分别设计NY-ESO-1抗体重链可变区VH及NY-ESO-1抗体轻链可变区VL的上游引物和下游引物进行PCR；
S03.进行琼脂糖凝胶电泳鉴定后，回收NY-ESO-1抗体重链可变区VH基因PCR产物及NY-ESO-1抗体轻链可变区VL基因PCR产物。
具体的，在上述步骤S01中，获取NY-ESO-1抗原免疫小鼠总cDNA，其操作步骤如下：
S011.利用NY-ESO-1抗原对BALB/C小鼠进行免疫，效价符合要求(1:100000以上)时，处死小鼠，取脾脏，用Trizol法提取小鼠脾脏总RNA。
S012.采用iScript cDNA Synthesis Kit合成总cDNA，以步骤S012提取的小鼠脾脏总RNA为模板，按照下述反应体系进行PCR反应：
Figure BDA0002089445770000071
所述PCR反应条件如下：
变性：25℃5min
退火：42℃30min
延伸：85℃5min
保存：4℃一直。
具体的，在上述步骤S02.中，以所述NY-ESO-1抗原免疫小鼠总cDNA为模板，分别设计NY-ESO-1抗体重链可变区VH及NY-ESO-1抗体轻链可变区VL的上游引物和下游引物进行PCR。
优选的，所述NY-ESO-1抗体重链可变区VH的上游引物(VH-F，Sequence No.5)为5'-GAA GTT CAA TTG TTA GAG TCT GGT GGC GGT-3'；下游引物(VH-R，Sequence No.6)为5'-GCT TGA GAC GGT GAC CGT GGA CCC TTG GCC-3'。
NY-ESO-1抗体轻链可变区VL的上游引物(VL-F，Sequence No.7)为5'-CAG AGCGAA TTG ACT CAG CCT CGC TCA GTG-3'；下游引物(VL-R，Sequence No.8)为5'-GAG GACGGT GAC GTC GGT CCC TGT CCC GAA-3'。
Figure BDA0002089445770000072
以NY-ESO-1抗原免疫小鼠总cDNA为模板，以上述抗体重链可变区VH的上游引物(VH-F)和下游引物(VH-R)为上下游引物进行PCR反应，制备NY-ESO-1抗体重链可变区VH。以NY-ESO-1抗原免疫小鼠总cDNA为模板，以抗体轻链可变区VL的上游引物(VL-F)和下游引物(VL-R)为上下游引物进行PCR反应，制备NY-ESO-1抗体轻链可变区VL。所述PCR反应体系如下：
Figure BDA0002089445770000073
Figure BDA0002089445770000081
所述PCR反应条件如下：
预变性：94℃5min，
变性：94℃45s，
退火：60℃1min，
延伸：72℃1min，共反应35个循环，再72℃延伸5min。
具体的，在上述步骤S03中，对上述PCR反应得到的PCR反应液进行1.2％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，利回收NY-ESO-1抗体重链可变区VH基因PCR产物及NY-ESO-1抗体轻链可变区VL基因PCR产物。
优选的，制备得到的NY-ESO-1 VH和NY-ESO-1 VL片段采用多基因片段重叠延伸PCR(Overlap Extension PCR，OE-PCR)的方法用连接肽进行连接，得到NY-ESO-1单链抗体。
在本发明优选实施例中，所述连接肽选用(Gly4Ser)3片段，具体的，所述(Gly4Ser)3片段的碱基序列如下(Sequence No.9)：
5’-GGT GGT GGT GGT TCT GGC GGC GGC GGC TCC GGT GGT GGT GGA TCT-3’。
利用所述(Gly4Ser)3片段将NY-ESO-1 VH和NY-ESO-1 VL片段连接起来，并在所述NY-ESO-1 VH片段的N端位置引入酶切位点EcoR I，在NY-ESO-1 VL片段的C端位置引入酶切位点Hind III，利用多基因片段重叠延伸PCR的反应进行PCR反应。
其中，NY-ESO-1抗体重链可变区VH及轻链可变区VL OE-PCR引物序列如下：
Figure BDA0002089445770000082
所述OE-PCR反应体系如下：
Figure BDA0002089445770000083
Figure BDA0002089445770000091
所述PCR反应条件如下：(1)步骤1：95℃预变性1min，94℃1min，60℃1min，72℃1min，共7个循环，72℃延伸10min；(2)步骤2：95℃预变性5min，94℃45s，62℃1min，72℃1min，共35个循环，72℃延伸5min。
反应结束后，利用1.2％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，回收NY-ESO-1单链抗体(NY-ESO-1 scFv片段)。
优选的，所述NY-ESO-1单链抗体(NY-ESO-1scFv片段)的氨基酸序列如SequenceNo.4，氨基酸序列如下：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYQMSWVRQAPGKGLEWVSGIVSSGGSTAYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGELLPYYGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSELTQPRSVSGSPGQSVTISCTGTSRDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLIIHDVIERSSGVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCWSFAGSYYVFGTGTDVTVLPKLG。
进一步地，将所述NY-ESO-1单链抗体片段与pcDNA3.1(+)载体连接，构建pcDNA3.1(+)-NY-ESO-1/scFv重组质粒。其制备方法如下：利用EcoR I/Hind III分别双酶切处理并回收NY-ESO-1单链抗体片段与pcDNA3.1(+)载体，再利用T4DNA连接酶将NY-ESO-1抗体scFv片段与pcDNA3.1(+)载体连接，制备得到pcDNA3.1(+)-NY-ESO-1/scFv质粒。
在本发明具体实施例中，所述的双信号嵌合抗原受体包括顺次连接的第一信号肽SP、γδTCR抗原受体、T2A、第二信号肽SP、NY-ESO-1单链抗体、CD8铰链区及跨膜结构域、41BB胞内结构域及DAP12-ITAM结构域。其中，γδTCR抗原受体能够特异性识别过度表达高代谢恶性肿瘤细胞表面的磷酸化抗原小分子，进行抗原定位的功能，作为所述双信号嵌合抗原受体的第一识别信号；同时NY-ESO-1单链抗体能够特异性地识别恶性肿瘤细胞表面对应的肿瘤抗原，作为所述双信号嵌合抗原受体的第二识别信号，进一步将双信号嵌合抗原受体特异性定位于肿瘤细胞表面，进而激活所述双信号嵌合抗原受体下游的信号分子，使信号分子发挥作用，快速特异性杀死肿瘤细胞。所述的双信号嵌合抗原受体采用双重识别信号，使其具有高靶向性，提高了抗原受体在肿瘤细胞表面定位的准确性和高效性。
本发明又一实施例提供了一种双信号嵌合抗原受体慢病毒表达载体，所述双信号嵌合抗原受体慢病毒表达载体包括上述用于表达双信号嵌合抗原受体的基因片段或所述的双信号嵌合抗原受体。
在本发明优选实施例中，委托南京金斯瑞生物科技有限公司分别合成两段序列用于构建慢病毒表达载体：
构建对照组表达载体一：PLV-Easy-T-2.1-NY-ESO-1-CAR慢病毒表达载体，其中，所述表达载体序列包括NY-ESO-1t单链抗体(scFv)、CD8铰链区及跨膜结构域、41BB胞内结构域及DAP12-ITAM结构域，所选的进行克隆的慢病毒表达载体为PLV-Easy-T-2.1慢病毒表达载体。
构建本发明所述双信号嵌合抗原受体慢病毒表达载体二，即PLV-Easy-T-2.1-γδTCR/NY-ESO-1-CAR慢病毒表达载体，所述慢病毒表达载体包括所述双信号嵌合抗原受体，所诉双信号嵌合抗原受体依次包括：第一信号肽、γδTCR抗原受体、T2A、信号肽SP、NY-ESO-1单链抗体、CD8铰链区及跨膜结构域、41BB胞内结构域及DAP12-ITAM结构域。
优选的，所述双信号嵌合抗原受体依次包括：第一信号肽、γδTCR抗原受体、T2A、信号肽SP、NY-ESO-1单链抗体。其中，先构建γδTCR抗原受体，由于γδTCR抗原受体可以识别非肽抗原，通过在细胞表面先表达γδTCR抗原受体，作为第一识别信号，可以优先识别过度表达的高代谢磷酸化的抗原小分子，对恶性肿瘤细胞进行定位；再连接NY-ESO-1单链抗体，由于NY-ESO-1单链抗体是抗原基因家族中重要的一员，在肿瘤抗原中具有较强的免疫原性，再利用NY-ESO-1单链抗体作为第二识别信号，对肿瘤细胞表面的肿瘤抗原进行特异性定位，进一步保证该双信号嵌合抗原受体定位准确，具有高度靶向性。
当第一识别信号和第二识别信号均进行锚定之后，会激活下游信号进行表达，其中，CD8铰链区及跨膜结构域、41BB胞内结构域及DAP12-ITAM结构域均是激活信号域，能够快速杀伤肿瘤细胞。
优选的，在γδTCR链和NY-ESO-1单链抗体之前均添加了信号肽分子，能够促进γδTCR链和NY-ESO-1单链抗体表达并分泌到细胞膜上，有利于进行信号识别。
优选的，构建上述表达载体一和表达载体二中，所述NY-ESO-1单链抗体为利用上述方法PCR反应得到的NY-ESO-1单链抗体片段。其他片段为通过碱基序列直接进行合成得到的。
所述的一种双信号嵌合抗原受体慢病毒表达载体，所述双信号嵌合抗原受体慢病毒表达载体包括上述双信号嵌合抗原受体，该慢病毒表达载体能够分别发挥第一识别信号和第二识别信号，能够快速、特异性地识别恶性肿瘤细胞表面对应的肿瘤抗原，具有高靶向性，提高了抗原受体在肿瘤细胞表面定位的准确性和高效性。
本发明再一实施例提供了一种双信号嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞，所述双信号嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞含有所述的用于表达双信号嵌合抗原受体的基因片段或所述的双信号嵌合抗原受体。
具体的，所述双信号嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞的制备方法，包括如下步骤：
G01.合成上述的用于表达双信号嵌合抗原受体的基因片段，克隆至慢病毒表达载体，制备得到含有所述用于表达双信号嵌合抗原受体的基因片段的慢病毒表达载体；
G02.包装含有所述用于表达双信号嵌合抗原受体的基因片段的慢病毒表达载体，得到含有所述用于表达双信号嵌合抗原受体的基因片段的慢病毒；
G03.利用含有所述用于表达双信号嵌合抗原受体的基因片段的慢病毒感染外周血来源的自然杀伤细胞，得到所述双信号嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞。
具体的，在上述步骤G01中，按照上述方法合成上述的用于表达双信号嵌合抗原受体的基因片段，克隆至慢病毒表达载体，制备得到含有所述用于表达的双信号嵌合抗原受体的基因片段的慢病毒表达载体，分别构建得到构建对照组表达载体一：PLV-Easy-T-2.1-NY-ESO-1-CAR慢病毒表达载体；本发明所述双信号嵌合抗原受体慢病毒表达载体二：即PLV-Easy-T-2.1-γδTCR/NY-ESO-1-CAR慢病毒表达载体。具体操作方法如上所述，此处不再阐述。
具体的，在上述步骤G02中，包装含有所述用于表达双信号嵌合抗原受体的基因片段的慢病毒表达载体，得到含有所述用于表达双信号嵌合抗原受体的基因片段的慢病毒。具体的，对所述合成得到的表达载体一、表达载体二进行慢病毒包装制备，具体操作方法如下：
G021.Day1：取5×106个293FT细胞(Invitrogen,Cat.No.R700-07)，离心后弃上清，用10ml 37℃预热的完全培养基(D-MEM+10％FBS+2mM L-谷氨酰胺+0.1mM非必须氨基酸+1mM丙酮酸钠+1％P/S)重悬，接种于10cm培养皿中，37℃，5％CO2培养箱中孵育过夜。
G022.Day2：弃去培养皿中的培养液，加入5ml含10％FBS的
Figure BDA0002089445770000111
I培养液(Invitrogen,Cat.No.31985-062)。
G023.
Figure BDA0002089445770000112
2000复合物的制备：
G0231.将1.5ml无血清的
Figure BDA0002089445770000113
I培养液加入5ml离心管中，加入9μgViraPowerTM包装质粒混合物和3μg慢病毒表达质粒，轻柔混合。
其中，所述慢病毒表达载体为上述合成得到的对照组表达载体一和本发明所述双信号嵌合抗原受体慢病毒表达载体二。
G0232.将1.5ml无血清的
Figure BDA0002089445770000114
I培养液加入另一个5ml离心管中，加入36μl
Figure BDA0002089445770000115
2000，轻柔混合后在室温下孵育5min。
G0233.将G031和G032两步得到的溶液转移到一个离心管中，轻柔混合均匀。
G0234.室温下孵育20min，得到
Figure BDA0002089445770000116
2000复合物。
G024.将得到的
Figure BDA0002089445770000117
2000复合物逐滴缓慢加入到培养皿中，并轻轻地来回晃动培养皿。37℃，5％CO2培养箱中孵育过夜。
G025.Day3：取出培养皿，弃去培养液，加入10ml DMEM完全培养基。37℃，5％CO2培养箱中孵育48-72h。
G026.Day5或Day6：将培养皿中的培养液转移到15ml离心管中，在4℃条件下2000g离心15min。
G027.吸取病毒原液，在4℃条件下4000g离心10min去除细胞碎片。
G028.将去除了细胞碎片的病毒原液在4℃条件下25000rpm离心2h。弃去上清，用PBS按照1:100(PBS:病毒原液)重悬病毒沉淀。
G029.重悬后的病毒分装至灭菌EP管中保存于-80℃。
利用上述制备方法，对慢病毒进行包装制备，得到的病毒分装至灭菌EP管中保存于-80℃。其中，对所述对照组表达载体一进行慢病毒包装，得到PLV-EasyT-2.1-NY-ESO-1-CAR慢病毒；对所述双信号嵌合抗原受体慢病毒表达载体二进行慢病毒包装，得到PLV-EasyT-2.1-γδTCR/NY-ESO-1-CAR慢病毒。
具体的，在上述步骤G03中，利用含有所述用于表达双信号嵌合抗原受体的基因片段的慢病毒感染外周血来源的自然杀伤细胞，得到所述双信号嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞。具体包括如下步骤：
G031.分离健康志愿者外周血单个核细胞(PBMC细胞)；
G032.双信号嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞(CAR-NK)细胞的制备。
具体的，在上述步骤G031中，分离健康志愿者PBMC细胞，具体步骤如下：
G0311.抽取健康志愿者外周血25ml，加入肝素继续拧抗凝，在室温条件下离心，所述离心条件为转速700g/min，时间为20min；吸取上层血浆，置于水浴锅中56℃，30min；然后4℃静置15min后，进行离心，所述离心条件为转速900g/min，时间为30min，取自体血浆4℃保存备用。
G0312.取上述700g，20min离心后下部细胞成分，加D-PBS至50ml，混匀，缓慢加到装有20ml人淋巴细胞分离液的50ml离心管中，室温离心，所述离心条件为转速800g/min，时间为15min。
G0313.吸取白膜层细胞，加入到装有5ml培养基RPMI 1640的50ml离心管中。
G0314.利用培养基RPMI 1640进行离心洗涤，离心条件为转速600g/min，时间为10min，洗涤两次，收集细胞即为PBMC细胞。
具体的，在上述步骤G032中，双信号嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞(CAR-NK)细胞的制备方法如下：
G0321.用含50ng/ml CD16单抗、1000U/ml IL-2、100ng/ml IL-15和0.5％自体血浆的Alys505培养液调整PBMC细胞密度为1×106/ml，转入六孔板中，2ml/孔，置于饱和湿度、37℃、5.0％CO2培养箱中培养。
G0322.每3天调整细胞密度为1×106/ml，添加含1000U/ml IL-2和0.5％自体血浆的Alys505培养液。
G0323.在培养的第7天，将NK细胞分成三组，每组细胞均按1×105/孔的密度转移至24孔板中，100μl/孔，每组设三个复孔。
第1组：感染PLV-EasyT-2.1-NY-ESO-1-CAR慢病毒，命名为NY-ESO-1-CAR组。
第2组：感染PLV-EasyT-2.1-γδTCR/NY-ESO-1-CAR慢病毒，命名为γδTCR/NY-ESO-1-CAR组。
第3组：空白NK细胞对照组，命名为NC组。
其中，第1及第2组按照MOI值＝20(此处MOI表示病毒数与细胞数量的比值)分别加入含有慢病毒颗粒的原液，取慢病毒溶液加Alys505完全培养基共配制成100μl，用移液管将慢病毒溶液加至细胞中，轻轻吹打混匀。第3组加入空白Alys505完全培养基100μl。三组细胞分别加入终浓度为8μg/ml的聚凝胺，来回轻轻晃动混合均匀后，置于37℃，5％CO2培养箱中孵育24h。
G0324.在培养的第8天，细胞取出离心，弃掉含慢病毒的上清液，用200μl Alys505培养液重悬，加入24孔板中。根据细胞生长状态进行补液。
G0325.在培养的第10天，分别收获NY-ESO-1-CAR组成熟细胞、γδTCR/NY-ESO-1-CAR组成熟细胞以及NC组成熟细胞，用于后续分析。
所述的一种表达双信号嵌合抗原受体的自然杀伤细胞，所述表达双信号嵌合抗原受体的自然杀伤细胞由上述双信号嵌合抗原受体慢病毒表达载体感染制备得到，能够成功诱导表达上述双信号嵌合抗原受体，能够分别发挥第一识别信号和第二识别信号，能够快速、特异性地识别恶性肿瘤细胞表面对应的肿瘤抗原，具有高靶向性，提高了抗原受体在肿瘤细胞表面定位的准确性和高效性。
该制备方法能够在实现本发明双信号嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞上述有益效果的同时，赋予所述双信号嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞的稳定性能，使所述自然杀伤细胞能够成功诱导表达上述双信号嵌合抗原受体，能够分别发挥第一识别信号和第二识别信号，能够快速、特异性地识别恶性肿瘤细胞表面对应的肿瘤抗原，具有高靶向性，提高了抗原受体在肿瘤细胞表面定位的准确性和高效性。此外，此制备方法工艺简单，条件可控，操作便捷。
下边以具体实施例来进一步说明本发明上述一种双信号嵌合抗原受体及其制备方法和应用。
实施例1
NY-ESO-1单链抗体(NY-ESO-1scFv)片段及质粒的获取
第一步：获取NY-ESO-1抗原免疫小鼠总cDNA，其具体操作步骤如下：
(1)利用NY-ESO-1抗原对BALB/C小鼠进行免疫，效价符合要求(1:100000以上)时，处死小鼠，取脾脏，用Trizol法提取小鼠脾脏总RNA。
(2)采用iScript cDNA Synthesis Kit合成总cDNA，反应体系如下：
Figure BDA0002089445770000131
反应条件：25℃5min 42℃30min85℃5min4℃hold，
制备得到小鼠脾脏总cDNA。
第二步：获取NY-ESO-1抗体重链可变区VH基因及轻链可变区VL基因，具体操作步骤如下：
(1)设计NY-ESO-1抗体重链可变区VH基因及轻链可变区VL基因的上下游引物。
所述NY-ESO-1抗体重链可变区VH的上游引物(VH-F)为5'-GAA GTT CAA TTG TTAGAG TCT GGT GGC GGT-3'；下游引物(VH-R)为5'-GCT TGA GAC GGT GAC CGT GGA CCC TTGGCC-3'。
NY-ESO-1抗体轻链可变区VL的上游引物(VL-F)为5'-CAG AGC GAA TTG ACT CAGCCT CGC TCA GTG-3'；下游引物(VL-R)为5'-GAG GAC GGT GAC GTC GGT CCC TGT CCCGAA-3'。
(2)以制备得到小鼠脾脏总cDNA为模板，以上述抗体重链可变区VH的上游引物(VH-F)和下游引物(VH-R)为上下游引物进行PCR反应，制备NY-ESO-1抗体重链可变区VH。以NY-ESO-1抗原免疫小鼠总cDNA为模板，以抗体轻链可变区VL的上游引物(VL-F)和下游引物(VL-R)为上下游引物进行PCR反应，制备NY-ESO-1抗体轻链可变区VL。所述PCR反应体系如下：
Figure BDA0002089445770000141
所述PCR反应条件如下：
预变性：94℃5min，
变性：94℃45s，
退火：60℃1min，
延伸：72℃1min，共反应35个循环，再72℃延伸5min。
(3)对上述PCR反应得到的PCR反应液进行1.2％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，利回收NY-ESO-1抗体重链可变区VH基因PCR产物及NY-ESO-1抗体轻链可变区VL基因PCR产物。
第三步，制备NY-ESO-1单链抗体(NY-ESO-1抗体scFv)片段及质粒，具体操作步骤如下：
(1)设计连接肽(Gly4Ser)3。该连接肽的碱基序列如下：5’-GGT GGT GGT GGT TCTGGC GGC GGC GGC TCC GGT GGT GGT GGA TCT-3’。
(2)利用所述(Gly4Ser)3片段将NY-ESO-1 VH和NY-ESO-1 VL片段连接起来，并在所述NY-ESO-1 VH片段的N端位置引入酶切位点EcoR I，在NY-ESO-1 VL片段的C端位置引入酶切位点Hind III，利用多基因片段重叠延伸PCR的反应进行PCR反应。所述PCR反应体系如下：
所述PCR反应条件如下：(1)步骤1：95℃预变性1min，94℃1min，60℃1min，72℃1min，共7个循环，72℃延伸10min；(2)步骤2：95℃预变性5min，94℃45s，62℃1min，72℃1min，共35个循环，72℃延伸5min。
(3)反应结束后，利用1.2％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，回收NY-ESO-1单链抗体(NY-ESO-1scFv片段)。
(4)将所述NY-ESO-1单链抗体片段与pcDNA3.1(+)载体连接，构建pcDNA3.1(+)-NY-ESO-1/scFv重组质粒。其制备方法如下：利用EcoR I/Hind III分别双酶切处理并回收NY-ESO-1单链抗体片段与pcDNA3.1(+)载体，再利用T4DNA连接酶将NY-ESO-1抗体scFv片段与pcDNA3.1(+)载体连接，制备得到pcDNA3.1(+)-NY-ESO-1/scFv质粒。
通过上述三个步骤，能够制备得到NY-ESO-1单链抗体(NY-ESO-1scFv)片段及质粒。
实施例2
慢病毒表达载体的构建及慢病毒的包装制备
第一步：慢病毒表达载体的构建，具体操作方法如下：
委托南京金斯瑞生物科技有限公司分别合成两段序列用于构建慢病毒表达载体：
表达载体一(PLV-Easy-T-2.1-NY-ESO-1-CAR慢病毒表达载体)包括：NY-ESO-1t单链抗体(scFv)、CD8铰链区及跨膜结构域、41BB胞内结构域及DAP12-ITAM结构域；
表达载体二(PLV-Easy-T-2.1-γδTCR/NY-ESO-1-CAR慢病毒表达载体)包括：第一信号肽、γδTCR抗原受体、T2A、信号肽SP、NY-ESO-1单链抗体、CD8铰链区及跨膜结构域、41BB胞内结构域及DAP12-ITAM结构域。
如附图1所示，图1为上述合成构建的表达载体二的基因片段结构，包括：
γδTCR抗原受体、T2A、信号肽SP、NY-ESO-1单链抗体、CD8铰链区及跨膜结构域、41BB胞内结构域、DAP12-ITAM结构域、信号肽SP、huEGFRt。
第二步：慢病毒的包装制备，具体操作方法如下：
(1)Day1：取5×106个293FT细胞(Invitrogen,Cat.No.R700-07)，离心后弃上清，用10ml 37℃预热的完全培养基(D-MEM+10％FBS+2mM L-谷氨酰胺+0.1mM非必须氨基酸+1mM丙酮酸钠+1％P/S)重悬，接种于10cm培养皿中，37℃，5％CO2培养箱中孵育过夜。
(2)Day2：弃去培养皿中的培养液，加入5ml含10％FBS的
Figure BDA0002089445770000151
I培养液(Invitrogen,Cat.No.31985-062)。
(3)
Figure BDA0002089445770000152
2000复合物的制备：
①将1.5ml无血清的
Figure BDA0002089445770000153
I培养液加入5ml离心管中，加入9μg ViraPowerTM包装质粒混合物和3μg慢病毒表达质粒，轻柔混合。
其中，所述慢病毒表达载体为上述合成得到的对照组表达载体一和本发明所述双信号嵌合抗原受体慢病毒表达载体二。
②将1.5ml无血清的
Figure BDA0002089445770000154
I培养液加入另一个5ml离心管中，加入36μl
Figure BDA0002089445770000155
2000，轻柔混合后在室温下孵育5min。
③将G031和G032两步得到的溶液转移到一个离心管中，轻柔混合均匀。
④室温下孵育20min，得到
Figure BDA0002089445770000156
2000复合物。
(4)将得到的
Figure BDA0002089445770000157
2000复合物逐滴缓慢加入到培养皿中，并轻轻地来回晃动培养皿。37℃，5％CO2培养箱中孵育过夜。
(5)Day3：取出培养皿，弃去培养液，加入10ml DMEM完全培养基。37℃，5％CO2培养箱中孵育48-72h。
(6)Day5或Day6：将培养皿中的培养液转移到15ml离心管中，在4℃条件下2000g离心15min。
(7)吸取病毒原液，在4℃条件下4000g离心10min去除细胞碎片。
(8)将去除了细胞碎片的病毒原液在4℃条件下25000rpm离心2h。弃去上清，用PBS按照1:100(PBS:病毒原液)重悬病毒沉淀。
(9)重悬后的病毒分装至灭菌EP管中保存于-80℃。
利用上述制备方法，对慢病毒进行包装制备，得到的病毒分装至灭菌EP管中保存于-80℃。其中，对所述对照组表达载体一进行慢病毒包装，得到PLV-EasyT-2.1-NY-ESO-1-CAR慢病毒；对所述双信号嵌合抗原受体慢病毒表达载体二进行慢病毒包装，得到PLV-EasyT-2.1-γδTCR/NY-ESO-1-CAR慢病毒。如附图2所示，图2为PLV-EasyT-2.1-NY-TCR的质粒示意图，即所述PLV-EasyT-2.1-γδTCR/NY-ESO-1-CAR慢病毒的质粒示意图。
实施例3
双信号嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞(CAR-NK)的制备
第一步：分离健康志愿者PBMC细胞，具体操作方法如下：
(1)抽取健康志愿者外周血25ml，加入肝素继续拧抗凝，在室温条件下离心，所述离心条件为转速700g/min，时间为20min；吸取上层血浆，置于水浴锅中56℃，30min；然后4℃静置15min后，进行离心，所述离心条件为转速900g/min，时间为30min，取自体血浆4℃保存备用。
(2)取上述700g，20min离心后下部细胞成分，加D-PBS至50ml，混匀，缓慢加到装有20ml人淋巴细胞分离液的50ml离心管中，室温离心，所述离心条件为转速800g/min，时间为15min。
(3)吸取白膜层细胞，加入到装有5ml培养基RPMI 1640的50ml离心管中。
(4)利用培养基RPMI 1640进行离心洗涤，离心条件为转速600g/min，时间为10min，洗涤两次，收集细胞即为PBMC细胞。
第二步：双信号嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞(CAR-NK)细胞的制备，具体方法如下：
(1)用含50ng/ml CD16单抗、1000U/ml IL-2、100ng/ml IL-15和0.5％自体血浆的Alys505培养液调整PBMC细胞密度为1×106/ml，转入六孔板中，2ml/孔，置于饱和湿度、37℃、5.0％CO2培养箱中培养。
(2)每3天调整细胞密度为1×106/ml，添加含1000U/ml IL-2和0.5％自体血浆的Alys505培养液。
(3)在培养的第7天，将NK细胞分成三组，每组细胞均按1×105/孔的密度转移至24孔板中，100μl/孔，每组设三个复孔。
第1组：感染PLV-EasyT-2.1-NY-ESO-1-CAR慢病毒，命名为NY-ESO-1-CAR组。
第2组：感染PLV-EasyT-2.1-γδTCR/NY-ESO-1-CAR慢病毒，命名为γδTCR/NY-ESO-1-CAR组。
第3组：空白NK细胞对照组，命名为NC组。
其中，第1及第2组按照MOI值＝20(此处MOI表示病毒数与细胞数量的比值)分别加入含有慢病毒颗粒的原液，取慢病毒溶液加Alys505完全培养基共配制成100μl，用移液管将慢病毒溶液加至细胞中，轻轻吹打混匀。第3组加入空白Alys505完全培养基100μl。三组细胞分别加入终浓度为8μg/ml的聚凝胺，来回轻轻晃动混合均匀后，置于37℃，5％CO2培养箱中孵育24h。
(4)在培养的第8天，细胞取出离心，弃掉含慢病毒的上清液，用200μl Alys505培养液重悬，加入24孔板中。根据细胞生长状态进行补液。
(5)在培养的第10天，分别收获NY-ESO-1-CAR组成熟细胞、γδTCR/NY-ESO-1-CAR组成熟细胞以及NC组成熟细胞，用于后续分析。
对上述实施例3制备得到的双信号嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞(CAR-NK)进行抗肿瘤活性检测分析，具体操作方法如下：
(一)双信号嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞(CAR-NK)体外抗肿瘤活性检测：
(1)以上述NY-ESO-1-CAR组成熟细胞、γδTCR/NY-ESO-1-CAR组成熟细胞以及NC组成熟细胞为效应细胞，H1299肺癌细胞为靶细胞。于96孔板中按照1:1以及5:1的效靶比混合效应细胞及靶细胞，轻轻混匀；同时设置无细胞的培养液孔以及只有靶细胞的样品对照孔和只有靶细胞用于后续裂解的细胞孔(样品最大酶活性孔)置于5％CO2，37℃培养箱中孵育。
(2)共孵育的第3h，在样品最大酶活性孔加入总体积10％的LDH释放试剂。
(3)共孵育的第4h，400g离心5min，每孔各取120ul上清液加入至新的96孔板。
(4)每孔加入60ulLDH工作液，充分混匀，室温避光孵育30min。
(5)于490nm处测定吸光度。
细胞毒性/死亡率＝(处理样品吸光度-样品对照孔吸光度)/(细胞最大酶活性的吸光度-样品对照孔吸光度)×100％。
(二)双信号嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞(CAR-NK)动物体内抗肿瘤活性检测：
取对数生长期的人肺癌H1299细胞，胰酶消化后制成单细胞悬液，将含1×107个癌细胞的悬液0.1ml于NOD-SCID小鼠肩胛部皮下注射。实验分组及治疗情况见下表，每日观察各组动物的饮食、活动等方面的变化，隔日测量NOD-SCID小鼠体重，观察体重变化情况；隔2天测量肿瘤的最大纵径(a)及最大横径(b)，观察肿瘤生长的情况，按照公式计算：瘤体积＝1/2a×b2。治疗结束后取出NOD-SCID小鼠体内的肿瘤，对其重量进行称量统计。
实验分组及治疗情况
Figure BDA0002089445770000171
Figure BDA0002089445770000181
/>
(三)双信号嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞(CAR-NK)IFN-γ分泌检测：
(1)样品制备；
①H1299作为靶细胞按照5×103/孔的细胞密度接种于96孔板中。
②按照5:1及1:1的效靶比加入NY-ESO-1-CAR-NK细胞以及NK细胞效应细胞。置于5％CO2，37℃培养箱中孵育。
③共孵育24h后，400g离心5min，吸取上清。
(2)ELISA检测：
①包被：用包被缓冲液将Capture antibody稀释至建议浓度，在96孔酶标板中加0.1mL，用保鲜膜封板，置于37℃恒温箱2h或4℃过夜；弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液(0.5％PBST)洗板3次，每次静置1min，用吸水纸扣干。
②封闭：每孔加入250ul的封闭液，用保鲜膜封板，置于室温封闭1h，洗板同上。
③加样品：设立8个标准孔，每孔均设立2个复孔，用稀释缓冲液稀释标准品至浓度为2ng/mL，进行孔内稀释，终浓度分别为：2000pg/mL，1000pg/mL，500pg/mL，250pg/mL，125pg/mL，62.5pg/mL，31.25pg/mL，0pg/mL；同时将上述细胞共孵育24h后收集的上清液，加入到设定的孔中，100μl/well，设空白对照和阴性对照孔；用保鲜膜封板，置于室温孵育2h或4℃过夜。弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液(0.5％PBST)洗板5次，每次静置1min，用吸水纸扣干。
④加二抗：用稀释缓冲液将detect antibody稀释至建议浓度，每孔加入100ul，用保鲜膜封板，置于室温孵育1h，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液(0.5％PBST)洗板5次，每次静置1min，用吸水纸扣干。
⑤加Avidin-HRP：用稀释缓冲液将Avidin-HRP稀释至建议浓度，每孔加入100ul，用保鲜膜封板，置于室温孵育30min，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液(0.5％PBST)洗板5-7次，每次静置1min，用吸水纸扣干。
⑥加TMB显色：每孔加入100ul的TMB显色液，室温避光反应15分钟。
⑦终止：每孔加入50ul的1mol/L的H2SO4。
⑧结果显示：放入全自动酶标仪检测450nm波长处的OD值。读数，输出到Excel中，绘制标准曲线和直线回归方程式，根据公式计算未知样品的浓度。
对上述实施例3制备得到的双信号嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞(CAR-NK)进行抗肿瘤活性检测分析的结果如下：
(一)双信号嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞(CAR-NK)体外抗肿瘤活性检测结果如下：
如图3所示，以上述NY-ESO-1-CAR组成熟细胞、γδTCR/NY-ESO-1-CAR组成熟细胞以及NC组成熟细胞作为效应细胞，用H1299作为靶细胞，应用LDH法检测NK细胞对肺癌H1299细胞的杀伤效率，实验结果显示，当效靶比为5:1时，NC组成熟细胞对肺癌H1299细胞的杀伤率为40％，NY-ESO-1-CAR组成熟细胞对肺癌H1299细胞的杀伤率大约为50％，γδTCR/NY-ESO-1-CAR组成熟细胞对肺癌H1299细胞的杀伤率大于60％；当效靶比为1:1时，NC组成熟细胞对肺癌H1299细胞的杀伤率大约为20％，NY-ESO-1-CAR组成熟细胞对肺癌H1299细胞的杀伤率大约为40％，γδTCR/NY-ESO-1-CAR组成熟细胞对肺癌H1299细胞的杀伤率大于40％；因此，γδTCR/NY-ESO-1-CAR-NK组细胞对肺癌H1299细胞的杀伤率明显强于NY-ESO-1-CAR-NK以及NK组。说明所述双信号嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞(CAR-NK)对肺癌细胞具有高效的杀伤作用。
(二)双信号嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞(CAR-NK)动物体内抗肿瘤活性检测结果如下：
如图4所示，进行体内抗肿瘤实验发现，空白对照组以及NK对照组的小鼠体型消瘦，进食及饮水量明显减少，精神状态不佳，空白对照组在第20天肿瘤体积明显增大，到第35天，肿瘤体积为2500mm3，NK对照组在第20天肿瘤体积明显增大，到第35天，肿瘤体积超过1000mm3。而经过NY-ESO-1-CAR-NK治疗组的小鼠则体重、饮食、饮水正常，精神状态良好，在第20天肿瘤体积逐渐增大，到第35天，肿瘤体积不超过1000mm3，治疗小鼠肿瘤的生长得到了一定程度上的的抑制。γδTCR/NY-ESO-1-CAR治疗组小鼠体重、饮食、饮水正常，精神状态良好，在第20天肿瘤体积逐渐增大，到第35天，肿瘤体积不超过250mm3，肿瘤得到了明显的抑制并且生存周期得到延长。说明双信号嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞可以明显的抑制体内恶性肿瘤的生长，并且延长荷瘤小鼠的生存周期。
如图5所示，测定治疗结束后荷瘤NOD-SCID小鼠体内肿瘤重量，其中，空白对照组中小鼠体内肿瘤重量较高，为3-4g；而NK对照组中小鼠体内肿瘤重量较高，为1-2g；NY-ESO-1-CAR-NK治疗组得到的小鼠体内肿瘤重量大约为0.5-1g；γδTCR/NY-ESO-1-CAR治疗组得到的小鼠体内肿瘤重量少于0.5g，进一步证明，所述双信号嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞可以明显的抑制体内恶性肿瘤的生长。
如图6所示，分析荷瘤NOD-SCID小鼠生存周期曲线，其中，空白对照组中小鼠，在60小时左右，其存活率为0％；NK对照组中小鼠，在70小时左右，其存活率为0％；NY-ESO-1-CAR-NK治疗组中小鼠，在85小时左右，其存活率为0％；γδTCR/NY-ESO-1-CAR治疗组中小鼠，在90小时左右，其存活率为25％。进一步证明，所述双信号嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞可以明显的抑制体内恶性肿瘤的生长，并且延长荷瘤小鼠的生存周期。
(三)信号嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞(CAR-NK)IFN-γ分泌检测结果如下：
如图7，以上述NY-ESO-1-CAR组成熟细胞、γδTCR/NY-ESO-1-CAR组成熟细胞以及NC组成熟细胞作为效应细胞，用H1299作为靶细胞，应用ELISA法检测各组NK细胞与肺癌H1299细胞共孵育后IFN-γ的分泌量，实验结果显示，当效靶比为1:1时，NK组与肺癌细胞H1299共孵育后IFN-γ的分泌量大约为800pg/mL；NY-ESO-1-CAR-NK组与肺癌细胞H1299共孵育后IFN-γ的分泌量大约为1000pg/mL；γδTCR/NY-ESO-1-CAR-NK与肺癌细胞H1299共孵育后IFN-γ的分泌量大约为1200pg/mL；当效靶比为5:1时，NK组与肺癌细胞H1299共孵育后IFN-γ的分泌量大约为800pg/mL；NY-ESO-1-CAR-NK组与肺癌细胞H1299共孵育后IFN-γ的分泌量大约为1200pg/mL；γδTCR/NY-ESO-1-CAR-NK与肺癌细胞H1299共孵育后IFN-γ的分泌量大约为1500pg/mL；γδTCR/NY-ESO-1-CAR-NK与肺癌细胞H1299共孵育后IFN-γ的分泌量明显高于NY-ESO-1-CAR-NK组以及NK组。证明，所述信号嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞在经过抗原刺激以后，细胞活化程度更高，分泌更多的IFN-γ，可以明显的抑制体内恶性肿瘤的生长，并且延长小鼠的生存周期。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳市罗湖区人民医院
<120> 一种双信号嵌合抗原受体及其制备方法和应用
<130> 2019.06.06
<160> 11
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1671
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atcccaatgc tgtcactgct ccacgcatca acgctggcag tccttggggc tctgtgtgta 120
tatggtgcag gtcacctaga gcaacctcaa atttccagta ctaaaacgct gtcaaaaaca 180
gcccgcctgg aatgtgtggt gtctggaata acaatttctg caacatctgt atattggtat 240
cgagagagac ctggtgaagt catacagttc ctggtgtcca tttcatatga cggcactgtc 300
agaaaggaat ccggcattcc gtcaggcaaa tttgaggtgg ataggatacc tgaaacgtct 360
acatccactc tcaccattca caatgtagag aaacaggaca tagctaccta ctactgtgcc 420
ttgtgggagg cccagcaaga gttgggcaaa aaaatcaagg tatttggtcc cggaacaaag 480
cttatcatta cagataaaca acttgatgca gatgtttccc ccaagcccac tatttttctt 540
ccttcaattg ctgaaacaaa gctccagaag gctggaacat acctttgtct tcttgagaaa 600
tttttccctg atgttattaa gatacattgg gaagaaaaga agagcaacac gattctggga 660
tcccaggagg ggaacaccat gaagactaat gacacataca tgaaatttag ctggttaacg 720
gtgccagaaa agtcactgga caaagaacac agatgtatcg tcagacatga gaataataaa 780
aacggagttg atcaagaaat tatctttcct ccaataaaga cagatgtcat cacaatggat 840
cccaaagaca attgttcaaa agatgcaaat gatacactac tgctgcagat gcagaggatc 900
tcctccctca tccatctctc tctcttctgg gcaggagtca tgtcagccat tgagttggtg 960
cctgaacacc aaacagtgcc tgtgtcaata ggggtccctg ccaccctcag gtgctccatg 1020
aaaggagaag cgatcggtaa ctactatatc aactggtaca ggaagaccca aggtaacaca 1080
atgactttca tataccgaga aaaggacatc tatggccctg gtttcaaaga caatttccaa 1140
ggtgacattg atattgcaaa gaacctggct gtacttaaga tacttgcacc atcagagaga 1200
gatgaagggt cttactactg tgcctgtgac accttgggga tgggggggga atacaccgat 1260
aaactcatct ttggaaaagg aacccgtgtg actgtggaac caagaagtca gcctcatacc 1320
aaaccatccg tttttgtcat gaaaaatgga acaaatgtcg cttgtctggt gaaggaattc 1380
taccccaagg atataagaat aaatctcgtg tcatccaaga agataacaga gtttgatcct 1440
gctattgtca tctctcccag tgggaagtac aatgctgtca agcttggtaa atatgaagat 1500
tcaaattcag tgacatgttc agttcaacac gacaataaaa ctgtgcactc cactgacttt 1560
gaagtgaaga cagattctac agatcacgta aaaccaaagg aaactgaaaa cacaaagcaa 1620
ccttcaaaga gctgccataa acccaaagcc atagttcata ccgagaagta a 1671
<210> 2
<211> 741
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct acttaccaga tgtcttgggt tcgccaagct 120
cctggtaaag gtttggagtg ggtttctggt atcgtttctt ctggtggctc tactgcttat 180
gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240
ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac actgcagtct actattgtgc gggggagcta 300
cttccctact acggtatgga cgtctggggc caagggacca cggtcaccgt ctcaagcggt 360
ggtggtggtt ctggcggcgg cggctccggt ggtggtggat ctcagagcga attgactcag 420
cctcgctcag tgtccgggtc tcctggacag tcagtcacca tctcctgcac tgggaccagc 480
cgtgatgttg gtggttataa ctatgtctcc tggtaccaac aacacccagg caaagccccc 540
aaactcataa ttcatgatgt catagagcgg tcgtcagggg tccctgatcg cttctctggc 600
tccaagtctg gcaacacggc ctccctgacc atctctgggc tccaggctga ggatgaggct 660
gattattatt gctggtcatt tgcaggctcc tattatgtct tcgggacagg gaccgacgtc 720
accgtcctcc ccaagcttgg g 741
<210> 3
<211> 556
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 3
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Met Leu Ser Leu Leu His Ala Ser Thr Leu
20 25 30
Ala Val Leu Gly Ala Leu Cys Val Tyr Gly Ala Gly His Leu Glu Gln
35 40 45
Pro Gln Ile Ser Ser Thr Lys Thr Leu Ser Lys Thr Ala Arg Leu Glu
50 55 60
Cys Val Val Ser Gly Ile Thr Ile Ser Ala Thr Ser Val Tyr Trp Tyr
65 70 75 80
Arg Glu Arg Pro Gly Glu Val Ile Gln Phe Leu Val Ser Ile Ser Tyr
85 90 95
Asp Gly Thr Val Arg Lys Glu Ser Gly Ile Pro Ser Gly Lys Phe Glu
100 105 110
Val Asp Arg Ile Pro Glu Thr Ser Thr Ser Thr Leu Thr Ile His Asn
115 120 125
Val Glu Lys Gln Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Glu Ala
130 135 140
Gln Gln Glu Leu Gly Lys Lys Ile Lys Val Phe Gly Pro Gly Thr Lys
145 150 155 160
Leu Ile Ile Thr Asp Lys Gln Leu Asp Ala Asp Val Ser Pro Lys Pro
165 170 175
Thr Ile Phe Leu Pro Ser Ile Ala Glu Thr Lys Leu Gln Lys Ala Gly
180 185 190
Thr Tyr Leu Cys Leu Leu Glu Lys Phe Phe Pro Asp Val Ile Lys Ile
195 200 205
His Trp Glu Glu Lys Lys Ser Asn Thr Ile Leu Gly Ser Gln Glu Gly
210 215 220
Asn Thr Met Lys Thr Asn Asp Thr Tyr Met Lys Phe Ser Trp Leu Thr
225 230 235 240
Val Pro Glu Lys Ser Leu Asp Lys Glu His Arg Cys Ile Val Arg His
245 250 255
Glu Asn Asn Lys Asn Gly Val Asp Gln Glu Ile Ile Phe Pro Pro Ile
260 265 270
Lys Thr Asp Val Ile Thr Met Asp Pro Lys Asp Asn Cys Ser Lys Asp
275 280 285
Ala Asn Asp Thr Leu Leu Leu Gln Met Gln Arg Ile Ser Ser Leu Ile
290 295 300
His Leu Ser Leu Phe Trp Ala Gly Val Met Ser Ala Ile Glu Leu Val
305 310 315 320
Pro Glu His Gln Thr Val Pro Val Ser Ile Gly Val Pro Ala Thr Leu
325 330 335
Arg Cys Ser Met Lys Gly Glu Ala Ile Gly Asn Tyr Tyr Ile Asn Trp
340 345 350
Tyr Arg Lys Thr Gln Gly Asn Thr Met Thr Phe Ile Tyr Arg Glu Lys
355 360 365
Asp Ile Tyr Gly Pro Gly Phe Lys Asp Asn Phe Gln Gly Asp Ile Asp
370 375 380
Ile Ala Lys Asn Leu Ala Val Leu Lys Ile Leu Ala Pro Ser Glu Arg
385 390 395 400
Asp Glu Gly Ser Tyr Tyr Cys Ala Cys Asp Thr Leu Gly Met Gly Gly
405 410 415
Glu Tyr Thr Asp Lys Leu Ile Phe Gly Lys Gly Thr Arg Val Thr Val
420 425 430
Glu Pro Arg Ser Gln Pro His Thr Lys Pro Ser Val Phe Val Met Lys
435 440 445
Asn Gly Thr Asn Val Ala Cys Leu Val Lys Glu Phe Tyr Pro Lys Asp
450 455 460
Ile Arg Ile Asn Leu Val Ser Ser Lys Lys Ile Thr Glu Phe Asp Pro
465 470 475 480
Ala Ile Val Ile Ser Pro Ser Gly Lys Tyr Asn Ala Val Lys Leu Gly
485 490 495
Lys Tyr Glu Asp Ser Asn Ser Val Thr Cys Ser Val Gln His Asp Asn
500 505 510
Lys Thr Val His Ser Thr Asp Phe Glu Val Lys Thr Asp Ser Thr Asp
515 520 525
His Val Lys Pro Lys Glu Thr Glu Asn Thr Lys Gln Pro Ser Lys Ser
530 535 540
Cys His Lys Pro Lys Ala Ile Val His Thr Glu Lys
545 550 555
<210> 4
<211> 247
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 4
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Gln Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Val Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gly Glu Leu Leu Pro Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Glu Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val
130 135 140
Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser
145 150 155 160
Arg Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro
165 170 175
Gly Lys Ala Pro Lys Leu Ile Ile His Asp Val Ile Glu Arg Ser Ser
180 185 190
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser
195 200 205
Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
210 215 220
Trp Ser Phe Ala Gly Ser Tyr Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Asp Val
225 230 235 240
Thr Val Leu Pro Lys Leu Gly
245
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt 30
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
gcttgagacg gtgaccgtgg acccttggcc 30
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
cagagcgaat tgactcagcc tcgctcagtg 30
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
gaggacggtg acgtcggtcc ctgtcccgaa 30
<210> 9
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
ggtggtggtg gttctggcgg cggcggctcc ggtggtggtg gatct 45
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 10
agatccacca ccaccggag 19
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 11
ctccggtggt ggtggatct 19

Claims (2)

1.一种双信号嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞，其特征在于，所述双信号嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞含有用于表达双信号嵌合抗原受体的基因片段或双信号嵌合抗原受体；所述用于表达双信号嵌合抗原受体的基因片段包括顺次连接的γδTCR基因片段及NY-ESO-1单链基因片段；其中，所述γδTCR基因片段的碱基序列如SequenceNo.1；所述NY-ESO-1单链基因片段的碱基序列如SequenceNo.2；
其中，所述双信号嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞γδTCR/NY-ESO-1-CAR组成熟细胞的制备方法，包括如下步骤：
合成基因片段，包括γδTCR抗原受体、T2A、信号肽SP、NY-ESO-1单链抗体、CD8铰链区及跨膜结构域、41BB胞内结构域、DAP12-ITAM结构域、信号肽SP、huEGFRt；
将所述基因片段克隆至慢病毒表达载体，制备得到含有所述用于表达双信号嵌合抗原受体的基因片段的慢病毒表达载体；所述包装慢病毒表达载体的细胞为293FT细胞；其中，所述双信号嵌合抗原受体包括顺次连接的γδTCR抗原受体和NY-ESO-1单链受体，所述γδTCR抗原受体的氨基酸序列如SequenceNo.3，所述NY-ESO-1单链抗体的氨基酸序列如SequenceNo.4；所述NY-ESO-1单链抗体包括NY-ESO-1抗体重链可变区VH和NY-ESO-1抗体轻链可变区VL；所述NY-ESO-1抗体重链可变区VH和NY-ESO-1抗体轻链可变区VL由连接肽(Gly4Ser)3连接；
包装含有所述用于表达双信号嵌合抗原受体的基因片段的慢病毒表达载体，得到含有所述用于表达双信号嵌合抗原受体的基因片段的慢病毒；
利用含有所述用于表达双信号嵌合抗原受体的基因片段的慢病毒感染外周血来源的自然杀伤细胞，得到所述双信号嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞。
2.根据权利要求1所述的双信号嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞，其特征在于，所述用于表达双信号嵌合抗原受体的基因片段包括顺次连接的第一信号肽基因片段、γδTCR基因片段、T2A基因片段、第二信号肽基因片段、NY-ESO-1单链基因片段、CD8铰链区及跨膜结构域基因片段、41BB胞内结构域基因片段及DAP12-ITAM结构域基因片段。
CN201910498634.7A 2019-06-10 2019-06-10 一种双信号嵌合抗原受体及其制备方法和应用 Active CN112063639B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910498634.7A CN112063639B (zh) 2019-06-10 2019-06-10 一种双信号嵌合抗原受体及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910498634.7A CN112063639B (zh) 2019-06-10 2019-06-10 一种双信号嵌合抗原受体及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112063639A CN112063639A (zh) 2020-12-11
CN112063639B true CN112063639B (zh) 2023-05-26

Family

ID=73658191

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910498634.7A Active CN112063639B (zh) 2019-06-10 2019-06-10 一种双信号嵌合抗原受体及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112063639B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107893055A (zh) * 2017-11-03 2018-04-10 深圳市默赛尔生物医学科技发展有限公司 一种特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞及其制备方法和用途
CN108314739A (zh) * 2018-02-05 2018-07-24 深圳市默赛尔生物医学科技发展有限公司 多信号嵌合抗原受体及其表达基因、其修饰的nk细胞及应用
CN108341881A (zh) * 2018-01-31 2018-07-31 深圳市默赛尔生物医学科技发展有限公司 带安全开关的嵌合抗原受体及其表达基因、其修饰的nk细胞及应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107893055A (zh) * 2017-11-03 2018-04-10 深圳市默赛尔生物医学科技发展有限公司 一种特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞及其制备方法和用途
CN108341881A (zh) * 2018-01-31 2018-07-31 深圳市默赛尔生物医学科技发展有限公司 带安全开关的嵌合抗原受体及其表达基因、其修饰的nk细胞及应用
CN108314739A (zh) * 2018-02-05 2018-07-24 深圳市默赛尔生物医学科技发展有限公司 多信号嵌合抗原受体及其表达基因、其修饰的nk细胞及应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN112063639A (zh) 2020-12-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110330567B (zh) 双特异性嵌合抗原受体t细胞，其制备方法和应用
CN111574634B (zh) 同时靶向间皮素和fap的双靶点嵌合抗原受体及其用途
CN108752482B (zh) 携带截短或未截短的髓样细胞触发性受体信号结构的嵌合抗原受体及其应用
CN110144326A (zh) 一种靶向性抗肿瘤t细胞及其制备方法和应用
CN108341881B (zh) 带安全开关的嵌合抗原受体及其表达基因、其修饰的nk细胞及应用
CN107893055B (zh) 一种特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞及其制备方法和用途
CN103965362B (zh) 一种可使t细胞趋向肿瘤部位的嵌合趋化因子受体
CN108822216B (zh) 携带截短或未截短的自然细胞毒性受体信号结构的嵌合抗原受体及其应用
CN111848818A (zh) 一种增强型免疫细胞及其应用
CN108314739B (zh) 多信号嵌合抗原受体及其表达基因、其修饰的nk细胞及应用
CN112940108B (zh) 识别ebv抗原的t细胞受体以及该t细胞受体的应用
CN112111013A (zh) 一种靶向claudin 18.2的通用型嵌合抗原受体T细胞、构建方法及其用途
CN111378624A (zh) 一种靶向性抗肿瘤t细胞及其制备方法和应用
CN111732665B (zh) 一种靶向表达癌胚抗原的细胞的嵌合抗原受体
CN112063639B (zh) 一种双信号嵌合抗原受体及其制备方法和应用
CA3151106A1 (en) Tcr constructs specific for ebv-derived antigens
Qin et al. Melanoma B16-F1 cells coated with fusion protein of mouse calreticulin and virus G-protein coupled receptor induced the antitumor immune response in Balb/C mice
CN110699371A (zh) 一种基于FcγRⅢa的嵌合基因及其用途
CN112940109B (zh) 识别ebv抗原的t细胞受体及其应用
CN111286512A (zh) 靶向人源化酪氨酸激酶孤儿受体1的嵌合抗原受体及其用途
CN114249834A (zh) 能够特异性靶向肿瘤细胞的嵌合抗原受体、其表达基因、其修饰的nk细胞及应用
CN114163538A (zh) 同时靶向gpc3和cd276的嵌合抗原受体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
CN111763262B (zh) 一种靶向c-Met和PD-L1双特异性嵌合抗原受体及其应用
CN112063640A (zh) 靶向人源化cea的嵌合抗原受体及其用途
CN110526990A (zh) 靶向cd30的嵌合抗原受体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant