CN112062875A - 一种谷婪步甲甲壳素提取与脱色方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种谷婪步甲甲壳素提取与脱色方法，以谷婪步甲为原材料提取甲壳素，在减少食害庄稼的害虫的同时也为甲壳素的提取提供了新的材料来源；采用碱性蛋白酶脱除蛋白质，试剂清洁且作用高效；采用有机酸除去无机盐，副产物有机酸盐可以二次利用，在提高处理效率的同时还可以体现保护环境的理念，环境友好；在脱脂时采用索氏提取法，利用溶剂回流和虹吸的原理，使固体物质每一次都能为纯的溶剂所萃取，使萃取油脂的效率提高；在脱蛋白质和无机盐及脱色过程中，借助超声波技术，使谷婪步甲的细胞壁更容易破裂，使脱除效果更好，提高效率、节省时间。利用本发明的方法缩短了试验反应时间，节约了成本，提高了提纯纯度，并简化试验操作。

Description

一种谷婪步甲甲壳素提取与脱色方法
技术领域
本发明涉及甲壳素制备技术领域，具体地涉及一种谷婪步甲甲壳素提取与脱色方法。
背景技术
谷婪步甲Harpalus calceatus属昆虫纲鞘翅目步甲科，别名有谷穗步甲、谷步甲。体长10.5～14.5mm，体黑色，口器棕褐或棕红，触角、足及腹面棕黄至棕红。国内主要分布在宁夏、河北、内蒙古、辽宁、吉林、黑龙江、福建、河南、新疆；国外分布在日本，俄罗斯，印度，欧洲。该虫1年发生1代，4月下旬成虫出现，6月下旬至8月上旬进入活动盛期，在8月中旬后会有所减少。谷婪步甲主要食害玉米、高梁、粟、黍、花生等，成虫食害夏播上述作物的种子，造成缺苗断垄或毁种，也有的危害谷穗。
甲壳素又称甲壳质、几丁质，化学名为β-(1,4)-2-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡萄糖.，为白色固体,溶于强酸,不溶于水、稀酸、稀碱和有机溶剂，是地球上第二大再生资源。因甲壳素的化学性质不活泼，与体液不发生变化，另外对组织也不起异物反应，无毒，在医药科学、食品、微生物学、材料、农业、免疫学等方面应用广泛。在自然界当中甲壳素的来源非常广泛，主要存在于甲壳动物的外壳、昆虫的体壁以及真菌细胞壁中。
目前，提取甲壳素的方法主要有酸碱法、酶法、发酵法、EDTA法等。这些方法都有其优点和可取之处，也有一些不足有待提高，比如酸碱法和EDTA法均会产生大量的酸碱废水，这些废水对环境污染较大；酶法相对于酸碱法而言比较清洁，效果也比较好，对环境污染也比较小，但发明中所用到的酶价格比较贵，生产成本高；发酵法的缺点是生产周期长。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于，提供一种谷婪步甲甲壳素提取与脱色方法，解决传统方法存在的环境污染严重、提取成本高及提取效率低等问题。
本发明公开了一种谷婪步甲甲壳素提取与脱色方法，包括以下步骤：
(1)制粉：将新鲜的谷婪步甲成虫洗净后装入铝盒内，置于烘箱内烘至恒重，然后用破壁机破壁后研磨，得到谷婪步甲虫粉；
(2)脱脂：称取步骤(1)所得谷婪步甲虫粉，用滤纸包包好置入索式提取器的提取筒中，然后按照谷婪步甲虫粉：脱脂剂＝1g：(200～400)mL的比例，将脱脂剂加入事先恒重的烧瓶中，置于95±5℃水浴中连续提取5～10h，每小时的虹吸回流次数不少于4次，提取结束后取出滤纸包，放入事先恒重的称量瓶中，将称量瓶置于烘箱内，打开烘箱箱门在105土5℃下烘干20～40min，待有机溶剂挥发后，用称量瓶瓶盖盖住瓶口一半，关闭烘箱箱门，在105土2℃下烘干1～3小时，然后取出称量瓶盖上瓶盖，置于干燥器中冷却20～40min得到脱脂虫粉；
(3)脱蛋白质：称取步骤(2)所得脱脂虫粉，按脱脂虫粉：蛋白酶溶液＝1g：(6～15)mL的比例，将脱脂虫粉与质量浓度为0.02～0.1％的蛋白酶溶液置于离心管中，将离心管放入超声波清洗器中超声反应1～3h，反应结束后将离心管取出置于低速离心机，在3000r/min转速下离心3～10min，将上清液弃去，再向离心管底部固体中加蒸馏水水洗数次至中性，将离心管置于烘箱内烘至恒重得到脱蛋白虫粉；
(4)脱无机盐：称取步骤(3)所得脱蛋白虫粉，室温条件下，按脱蛋白粉：酸溶液＝1g：(6～15)mL的比例，将脱蛋白虫粉和质量浓度为6～22％的酸溶液置于离心管中，将离心管放入超声波清洗器中超声反应10～30min，反应结束后将离心管取出并置于低速离心机，在3000r/min转速下离心3～10min，将上清液弃去，再向离心管底部的固体中加蒸馏水水洗数次至中性，将离心管置于烘箱内烘至恒重得到甲壳素粗品；
(5)脱色：称取步骤(4)所得甲壳素粗品，按照甲壳素粗品：脱色剂＝1g：(10～30)mL的比例，将甲壳素粗品和脱色剂加入三角瓶中，调节pH为8.5～9.5，在60±10℃下以500W的功率超声处理2～5h后，用4层纱布过滤，将滤渣水洗数次，再将滤渣在85±5℃下烘干得到甲壳素成品。
优选的，所述步骤(1)中烘箱温度为80～90℃，谷婪步甲虫粉过60目筛。
优选的，所述步骤(2)中脱脂剂为石油醚、环己烷、异丙醇中的一种或几种。
优选的，所述步骤(3)中蛋白酶溶液为碱性蛋白酶溶液、木瓜蛋白酶溶液和胰蛋白酶溶液中的一种或几种。
优选的，碱性蛋白酶溶液的pH控制为9.0～11.0，木瓜蛋白酶溶液的pH控制为5.0～6.0，胰蛋白酶溶液的pH控制为7.5～8.5。
优选的，碱性蛋白酶溶液和木瓜蛋白酶溶液超声波处理温度为50±10℃，胰蛋白酶溶液超声波处理温度为37±5℃。
优选的，所述步骤(4)中酸溶液为柠檬酸、苹果酸和乙酸溶液中的一种或几种。
优选的，所述步骤(5)中脱色剂为H2O2、NaClO和KMnO4中的一种或几种。
优选的，所述H2O2的质量浓度为10％～30％；所述NaClO的质量浓度为5％～10％；所述KMnO4的质量浓度为3％～4％，利用KMnO4脱色处理后，需要以甲壳素粗品：草酸＝1g：(70～80)mL的比例加入质量浓度为2～5％的草酸溶液中和滤渣中剩余的KMnO4，再水洗过滤数次并干燥。
优选的，所述步骤(3)至步骤(5)中超声波清洗器的超声功率为150～500W。
优选的，步骤(2)中脱脂剂为石油醚，反应时间为8h；步骤(3)中蛋白酶溶液为碱性蛋白酶溶液，碱性蛋白酶溶液的浓度为0.03％，脱脂虫粉：蛋白酶溶液＝1g：9mL，反应温度为53℃，pH为9.0，超声功率500W，反应时间为2.8h；步骤(4)中酸溶液为乙酸溶液，乙酸溶液浓度20％，脱蛋白粉：酸溶液＝1g：11mL，反应温度为室温，超声功率为180W，反应时间为23min；步骤(5)中脱色剂为H2O2，H2O2浓度为30％，甲壳素粗品：脱色剂＝1g：30mL，反应温度为67.53℃，pH为9.0，超声功率为500W，反应时间为4h。
本发明以谷婪步甲成虫为原料制备甲壳素，化害为益，为甲壳素的制备提供新的材料来源。发明采用石油醚、环己烷、异丙醇中的一种或几种脱除原料中的油脂；用碱性蛋白酶溶液、木瓜蛋白酶溶液和胰蛋白酶溶液中的一种或几种来脱除原料中的蛋白质；采用柠檬酸、苹果酸和乙酸溶液中的一种或几种脱除原料中的无机盐，采用H2O2、NaClO和KMnO4中的一种或几种进行脱色处理，其中，采用石油醚、蛋白酶溶液、乙酸溶液及H2O2处理效果更好。此外，发明设计了从谷婪步甲中提取甲壳素的最佳工艺条件，利用超声波辅助方法，加快谷婪步甲成虫甲壳素提取与脱色处理的速度，缩短周期，提升甲壳素提取纯度与白度值。
本发明的有益效果：
第一，化害为益：谷婪步甲成虫喜欢食害夏播作物的种子，造成缺苗断垄、毁种或危害谷穗。本发明以谷婪步甲为原材料提取甲壳素，在减少食害庄稼的害虫的同时也为甲壳素的提取提供了新的材料来源；
第二，环境友好：传统提取甲壳素，多用氢氧化钠脱除蛋白质，氢氧化钠会产生废水，污染环境。本发明采用碱性蛋白酶脱除蛋白质，试剂清洁且作用高效；采用有机酸除去无机盐，副产物有机酸盐可以二次利用，实现了废料的回收利用。本发明在提高处理效率的同时还可以体现保护环境的理念，环境友好；
第三，简单高效：本发明在脱脂时采用索氏提取法，利用溶剂回流和虹吸的原理，使固体物质每一次都能为纯的溶剂所萃取，从而将可溶物富集到烧瓶内，所以萃取油脂的效率较高；在脱蛋白质和无机盐及脱色过程中，借助超声波技术，可以使谷婪步甲的细胞壁更容易破裂，不仅可以使脱除效果更好，还可提高效率、节省时间。利用本发明的方法缩短了试验反应时间，节约了成本，提高了提纯纯度，并简化试验操作。
附图说明
图1为三种有机溶剂的脱脂效果对比图；
图2为三种蛋白酶的脱蛋白效果对比图；
图3为不同PH值下酶解效果的对比图；
图4为不同超声功率下酶解效果的对比图；
图5为不同水解时间下酶解效果的对比图；
图6为不同酶用量下酶解效果的对比图；
图7为不同液料比下酶解效果的对比图；
图8为不同酶解温度下酶解效果的对比图；
图9为三种有机酸的脱无机盐效果对比图；
图10为不同酸浸时间下脱无机盐效果的对比图；
图11为不同乙酸浓度下脱无机盐效果的对比图；
图12为不同液料比下脱无机盐效果的对比图；
图13为三种不同脱色剂的脱色效果对比图；
图14为不同过氧化氢浓度下脱色效果的对比图；
图15为不同固液比下脱色效果的对比图；
图16为不同超声时间下脱色效果的对比图；
图17为不同脱色温度下脱色效果的对比图；
图18为不同pH下脱色效果的对比图；
图19为本发明获得的甲壳素及标样的红外光谱对比图。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明进行详细说明：
实施例1：
一种谷婪步甲甲壳素提取与脱色方法，包括以下步骤：
(1)制粉：将新鲜的谷婪步甲成虫洗净后装入铝盒内，置于烘箱内烘至恒重，然后用破壁机破壁后研磨，得到谷婪步甲虫粉；烘箱温度为85℃，谷婪步甲虫粉过60目筛；
(2)脱脂：称取步骤(1)所得谷婪步甲虫粉，用滤纸包包好置入索式提取器的提取筒中，然后按照谷婪步甲虫粉：石油醚＝1g：300mL的比例，将石油醚加入事先恒重的烧瓶中，置于95±2℃水浴中连续提取8h，每小时的虹吸回流次数不少于4次，提取结束后取出滤纸包，放入事先恒重的称量瓶中，将称量瓶置于烘箱内，打开烘箱箱门在105土2℃下烘干30min，待有机溶剂挥发后，用称量瓶瓶盖盖住瓶口一半，关闭烘箱箱门，在105土2℃下烘干2小时，然后取出称量瓶盖上瓶盖，置于干燥器中冷却30min得到脱脂虫粉；
(3)脱蛋白质：称取步骤(2)所得脱脂虫粉，按脱脂虫粉：碱性蛋白酶溶液＝1g：9mL的比例，将脱脂虫粉与质量浓度为0.03％的碱性蛋白酶溶液置于离心管中，将离心管放入超声波清洗器中超声反应2.8h，反应结束后将离心管取出置于低速离心机，在3000r/min转速下离心8min，将上清液弃去，再向离心管底部固体中加蒸馏水水洗数次至中性，将离心管置于烘箱内烘至恒重得到脱蛋白虫粉；超声波清洗器的超声功率为500W；碱性蛋白酶溶液的pH控制为9.0，超声波处理温度为53℃；
(4)脱无机盐：称取步骤(3)所得脱蛋白虫粉，室温条件下，按脱蛋白粉：乙酸溶液＝1g：11mL的比例，将脱蛋白虫粉和质量浓度为18％的乙酸溶液置于离心管中，将离心管放入超声波清洗器中超声反应23min，反应结束后将离心管取出并置于低速离心机，在3000r/min转速下离心8min，将上清液弃去，再向离心管底部的固体中加蒸馏水水洗数次至中性，将离心管置于烘箱内烘至恒重得到甲壳素粗品；超声波清洗器的超声功率为180W，反应温度为室温；
(5)脱色：称取步骤(4)所得甲壳素粗品，按照甲壳素粗品：H2O2＝1g：30mL的比例，将甲壳素粗品和浓度为30％H2O2的脱色剂加入三角瓶中，调节pH为9.0，在67.53℃下以500W的功率超声处理4h后，用4层纱布过滤，将滤渣水洗数次，再将滤渣在85±5℃下烘干得到甲壳素成品。
实施例2：
一种谷婪步甲甲壳素提取与脱色方法，包括以下步骤：
(1)制粉：将新鲜的谷婪步甲成虫洗净后装入铝盒内，置于烘箱内烘至恒重，然后用破壁机破壁后研磨，得到谷婪步甲虫粉；烘箱温度为80℃，谷婪步甲虫粉过60目筛；
(2)脱脂：称取步骤(1)所得谷婪步甲虫粉，用滤纸包包好置入索式提取器的提取筒中，然后按照谷婪步甲虫粉：环己烷＝1g：200mL的比例，将环己烷加入事先恒重的烧瓶中，置于95±5℃水浴中连续提取5h，每小时的虹吸回流次数不少于4次，提取结束后取出滤纸包，放入事先恒重的称量瓶中，将称量瓶置于烘箱内，打开烘箱箱门在105土5℃下烘干20min，待有机溶剂挥发后，用称量瓶瓶盖盖住瓶口一半，关闭烘箱箱门，在105土2℃下烘干1～3小时，然后取出称量瓶盖上瓶盖，置于干燥器中冷却40min得到脱脂虫粉；
(3)脱蛋白质：称取步骤(2)所得脱脂虫粉，按脱脂虫粉：木瓜蛋白酶溶液＝1g：6mL的比例，将脱脂虫粉与质量浓度为0.1％的木瓜蛋白酶溶液置于离心管中，将离心管放入超声波清洗器中超声反应1.5h，反应结束后将离心管取出置于低速离心机，在3000r/min转速下离心5min，将上清液弃去，再向离心管底部固体中加蒸馏水水洗数次至中性，将离心管置于烘箱内烘至恒重得到脱蛋白虫粉；超声波清洗器的超声功率为200W；木瓜蛋白酶溶液的pH控制为5.0～6.0，木瓜蛋白酶溶液超声波处理温度为50±10℃；
(4)脱无机盐：称取步骤(3)所得脱蛋白虫粉，室温条件下，按脱蛋白粉：柠檬酸溶液＝1g：6mL的比例，将脱蛋白虫粉和质量浓度为22％的柠檬酸溶液置于离心管中，将离心管放入超声波清洗器中超声反应20min，反应结束后将离心管取出并置于低速离心机，在3000r/min转速下离心5min，将上清液弃去，再向离心管底部的固体中加蒸馏水水洗数次至中性，将离心管置于烘箱内烘至恒重得到甲壳素粗品；超声波清洗器的超声功率为500W；
(5)脱色：称取步骤(4)所得甲壳素粗品，按照甲壳素粗品：NaClO＝1g：10mL的比例，将甲壳素粗品和质量浓度为5％～10％的NaClO加入三角瓶中，调节pH为9.5，在60±10℃下以500W的功率超声处理2h后，用4层纱布过滤，将滤渣水洗数次，再将滤渣在85±5℃下烘干得到甲壳素成品。
实施例3：
一种谷婪步甲甲壳素提取与脱色方法，包括以下步骤：
(1)制粉：将新鲜的谷婪步甲成虫洗净后装入铝盒内，置于烘箱内烘至恒重，然后用破壁机破壁后研磨，得到谷婪步甲虫粉；烘箱温度为80～90℃，谷婪步甲虫粉过60目筛；
(2)脱脂：称取步骤(1)所得谷婪步甲虫粉，用滤纸包包好置入索式提取器的提取筒中，然后按照谷婪步甲虫粉：异丙醇＝1g：400mL的比例，将异丙醇加入事先恒重的烧瓶中，置于95±5℃水浴中连续提取10h，每小时的虹吸回流次数不少于4次，提取结束后取出滤纸包，放入事先恒重的称量瓶中，将称量瓶置于烘箱内，打开烘箱箱门在105土5℃下烘干40min，待有机溶剂挥发后，用称量瓶瓶盖盖住瓶口一半，关闭烘箱箱门，在105土2℃下烘干3小时，然后取出称量瓶盖上瓶盖，置于干燥器中冷却40min得到脱脂虫粉；
(3)脱蛋白质：称取步骤(2)所得脱脂虫粉，按脱脂虫粉：胰蛋白酶溶液＝1g：15mL的比例，将脱脂虫粉与质量浓度为0.05％的胰蛋白酶溶液置于离心管中，将离心管放入超声波清洗器中超声反应3h，反应结束后将离心管取出置于低速离心机，在3000r/min转速下离心10min，将上清液弃去，再向离心管底部固体中加蒸馏水水洗数次至中性，将离心管置于烘箱内烘至恒重得到脱蛋白虫粉；超声波清洗器的超声功率为400W；胰蛋白酶溶液的pH控制为8.0；胰蛋白酶溶液超声波处理温度为37±5℃；
(4)脱无机盐：称取步骤(3)所得脱蛋白虫粉，室温条件下，按脱蛋白粉：苹果酸溶液＝1g：15mL的比例，将脱蛋白虫粉和质量浓度为10％的苹果酸溶液置于离心管中，将离心管放入超声波清洗器中超声反应10min，反应结束后将离心管取出并置于低速离心机，在3000r/min转速下离心10min，将上清液弃去，再向离心管底部的固体中加蒸馏水水洗数次至中性，将离心管置于烘箱内烘至恒重得到甲壳素粗品；超声波清洗器的超声功率为300W；
(5)脱色：称取步骤(4)所得甲壳素粗品，按照甲壳素粗品：KMnO4＝1g：30mL的比例，将甲壳素粗品和质量浓度为3％～4％KMnO4加入三角瓶中，调节pH为9.5，在60±10℃下以500W的功率超声处理5h后，以甲壳素粗品：草酸＝1g：(70～80)mL的比例加入质量浓度为2～5％的草酸溶液中和滤渣中剩余的KMnO4，用4层纱布过滤，将滤渣水洗数次，再将滤渣在85±5℃下烘干得到甲壳素成品。
表1：本发明具体实施例中所得甲壳素的指标
Figure BDA0002580707780000101
本发明各工艺单因素试验对比：
一、脱脂效果对比
1、脱脂剂的效果对比
三种脱脂剂脱除油脂的结果如图1所示。通过图1可知，石油醚脱油脂后脱脂剂中粗脂肪含量高于异丙醇和环己烷，环己烷和异丙醇与石油醚有显著性差异(P＜0.05)，所以，脱除油脂效果较适宜的有机溶剂是石油醚。
最佳脱脂工艺为：脱脂剂为石油醚，反应时间为8h。
二、脱蛋白效果对比
1、蛋白酶的效果对比
三种蛋白酶脱除蛋白质后的蛋白质残余量如图2所示。通过图2可知，碱性蛋白酶脱除蛋白质后的蛋白质残余量明显低于胰蛋白酶和木瓜蛋白酶，碱性蛋白酶与其它两种蛋白酶有显著性差异(P＜0.05)，所以，脱除蛋白质效果较好的是碱性蛋白酶。
2、pH值对碱性蛋白酶的酶解效果的影响
pH值对碱性蛋白酶酶解效果的影响如图3所示。通过图3可知，蛋白质的残余量随着pH的升高而升高，在pH为10.5和11时趋于平衡，pH值为9时与pH值为9.5时无显著性差异(P＞0.05)，而pH值为9与pH为10、10.5和11有显著性差异(P＜0.05)，且pH值为9时蛋白质的残余量最低。所以，较为适宜的pH值是9，此时蛋白质的残余量为3.4630mg/ml。在pH为9时，碱性蛋白酶的活性最好，此时脱除蛋白质的效果最好，随着pH的升高，会使碱性蛋白酶的活性降低，影响脱除效果。
3、超声功率对碱性蛋白酶的酶解效果的影响
超声功率对碱性蛋白酶酶解效果的影响如图4所示。由图4可知，蛋白质的残余量随着超声功率的升高而降低，功率为500w时蛋白质的残余量最低。因此，较为适宜的功率为500w，且此时蛋白质残余量为2.4186mg/ml。因随着超声功率的增加，细胞会加速破裂，从而导致蛋白质的溶出量增加，残余蛋白质含量随之降低。
4、酶解时间对碱性蛋白酶的酶解效果的影响
酶解时间对碱性蛋白酶酶解效果的影响如图5所示。通过图5可知，蛋白质的残余量随着酶解时间的延长而呈降低的变化，且酶解时间在1.5h后显著降低，时间为3h与酶解时间为1h和1.5h均有显著性差异(P<0.05)，但与酶解时间2h和2.5h的差异不显著，且时间为2.5h与3h时蛋白质的残余量差别不大。因此，考虑时间的消耗，较适宜的酶解时间为2.5h，此时的蛋白质残余量为2.5868mg/ml。分析其原因可能是随着酶解时间的延长，更多碱性蛋白酶进入细胞，使反应更完全。当经过2.5h的反应后，反应已经充分进行，到3h时残余蛋白质含量不再明显降低。
5、酶用量对蛋白质的酶解效果的影响
碱性蛋白酶酶用量对蛋白质酶解效果的影响如图6所示。由图6可知，蛋白质的残余量随着酶用量的增加呈现先降低再升高的变化，且在酶用量为0.04％时蛋白质的残余量最低，为2.7557mg/ml，酶用量为0.04％与其他酶用量无显著性差异(P＞0.05)，但酶用量为0.04％时蛋白质的脱除效果最好，所以，较适宜的酶用量是0.04％。分析其原因可能当升高蛋白酶浓度到0.04％时，更多的碱性蛋白酶分子与底物反应，增加酶促反应速率，使更多的蛋白质溶出。而继续升高蛋白酶的浓度，由于本发明的反应体系中底物较少，酶分子又过量，反应过程中的中间产物(多肽)增多并堆积，导致现有的酶分子尚未发挥作用甚至会阻碍反应的进行，所以蛋白质的溶出量减少。
6、液料比对碱性蛋白酶的酶解效果的影响
液料比对碱性蛋白酶酶解效果的影响如图7所示。通过图7可见，蛋白质的残余量随着液料比的增大出现先降低后升高的变化，在液料比为8：1时蛋白质的残余量最低，为2.7098mg/ml。经方差分析可知，8：1的液料比与其它液料比无显著性差异(P＞0.05)。分析其原因可能是随着液料比的提高，蛋白酶溶液与谷婪步甲虫粉接触，液料比为8：1脱除蛋白质的效果最好，因此，较适宜的液料比为8：1。蛋白酶溶液与谷婪步甲虫粉接触的面积增大，对扩散速度的提高有利，故而有利于蛋白质的溶出。当继续升高液料比大于8：1时，蛋白质的提取率减少，可能是因为溶液中蛋白质的浓度与虫粉中蛋白质的浓度相当，使得虫粉组织内外的浓度差消失，蛋白质的溶出量趋于平衡，甚至会影响反应的进行，故而蛋白质的残余量逐渐升高，但是升高幅度不是很大。
7、温度对碱性蛋白酶的酶解效果的影响
温度对碱性蛋白酶酶解效果的影响如图8所示。通过图8可见，随着温度的升高，蛋白质的残余量出现先降低后升高的变化，在温度为55℃时蛋白质的残余量最低，为1.9152mg/ml。温度为55℃与温度为40℃有显著性差异(P＜0.05)，与其它几个温度无显著性差异(P＞0.05)，但在几个温度梯度中55℃时的蛋白质残余量最低，因此，较为适宜的温度为55℃。分析其原因是当温度升高到55℃时，碱性蛋白酶的活性最高，故脱除蛋白质的效果最好，当继续升高温度，超出碱性蛋白酶的最适温度40～55℃时，会降低碱性蛋白酶的活性甚至破坏其内部结构使其失活，影响脱除效果。
以上各因素之间存在交互影响，最终的最佳脱蛋白工艺为：碱性蛋白酶溶液的浓度为0.03％，脱脂虫粉：蛋白酶溶液＝1g：9mL，反应温度为53℃，pH为9.0，超声功率500W，反应时间为2.8h。
三、脱无机盐效果对比
1、有机酸的筛选
三种有机酸脱除无机盐后的灰分含量如图9所示。由图9可见，乙酸脱完无机盐后的灰分明显低于柠檬酸和苹果酸。乙酸与其它两种酸无显著性差异(P＞0.05)，但乙酸的脱除效果最好，所以，脱除无机盐效果较好的是乙酸。
2、酸浸时间对乙酸脱除无机盐效果的影响
酸浸时间对乙酸脱除无机盐效果的影响如图10所示。由图10可知，随着时间的延长，灰分的含量出现降低并逐渐趋于平衡的变化，在时间为25min和30min时脱除效果差别不大。时间为25min时的灰分含量与时间为10、15、20min时差异显著(P＜0.05)，而与30min差异不显著(P＞0.05)，且25min的脱除效果与30min的脱除效果差别不大。因此考虑到节省时间，较为适宜的酸浸时间为25min。分析原因可能是随着时间的延长，谷婪步甲虫粉与乙酸充分接触，所以脱除无机盐的效果逐渐显著。但时间继续延长，超声波的空化效应作用力会减小,乙酸就很难完全渗透到甲壳素胶体分子里面,导致乙酸与谷婪步甲干粉反应不完全。当时间至25min时，就已基本达到平衡，所以继续延长时间对脱除无机盐的效果影响不大。
3、酸浓度对乙酸脱除无机盐效果的影响
酸浓度对乙酸脱除无机盐效果的影响如图11所示。通过图11可知，随着乙酸浓度的升高，灰分的含量出现下降并逐渐趋于平衡的变化，从6％到10％下降最为明显。乙酸浓度为6％时与浓度为10％、14％、18％、22％时差异显著(P＜0.05)，而浓度为10％、14％、18％、22％之间的差异不显著(P＞0.05)，且乙酸浓度为18％和22％时脱除无机盐的效果都较好且两者之间的差异又不明显，基本趋于平衡。因此考虑到节省成本和保护环境，较为适宜的乙酸浓度为18％。分析其原因可能是随着乙酸浓度的升高，乙酸与谷婪步甲的接触面积增大，更多的乙酸分子使反应进行的更加彻底，从而脱除无机盐的效果越来越好。而当乙酸浓度升高到18％时，虫粉中的无机盐基本已脱除干净，故乙酸浓度升高到22％时，无机盐脱除效果基本不变。
4、酸浸液料比对乙酸脱除无机盐效果的影响
酸浸液料比对乙酸脱除无机盐效果的影响如图12所示。通过图12可知，随着液料比的升高，灰分的含量出现下降并逐渐趋于平衡的变化，且从6：1到8：1的下降最为明显。液料比为6：1时与液料比为8：1、10：1、12：1、14：1时差异显著(P＜0.05)，而液料比为8：1、10：1、12：1、14：1之间的差异不显著(P＞0.05)，且液料比为12：1和14：1时脱除无机盐的效果都比较好，差别不大。因此从原料和成本的角度考虑，较为适宜的液料比为12：1。分析其原因可能是随着液料比的升高，乙酸与谷婪步甲虫粉接触的面积增大，使无机盐的溶出量增多，当液料比升高到12：1时，虫粉中的无机盐含量基本脱除干净，再增大液料比意义不大。
以上各因素之间存在交互影响，最终的最佳脱无机盐工艺为：乙酸溶液浓度20％，脱蛋白粉：酸溶液＝1g：11mL，反应温度为室温，超声功率为180W，反应时间为23min。
四、脱色效果对比
1、谷婪步甲脱色剂的选择
对3种常见的脱色剂及6种不同浓度(20％H2O2、30％H2O2、5％NaClO、10％NaClO、3％KMnO4、4％KMnO4)进行比较选择，脱色效果见下由图13可知，在这常见的3种脱色剂6种浓度中，白度值由大到小依次为30％H2O2、20％H2O2、4％KMnO4、10％NaClO、5％NaCLO、3％KMnO4，其中30％H2O2的白度值最高，可高达50.01，表明脱色效果最好，所得的甲壳素白度最高。虽然KMnO4氧化能力强，但是MnO4 －体积较大，难以进入甲壳素分子中，因此脱色效果差。H2O2是以O2 2－形式起作用，H2O2价格低廉，分解后的产物是水，不会产生浓烈的气味，污染水及空气。30％H2O2与20％H2O2之间无显著差异(P>0.05)，30％H2O2与4％KMnO4、10％NaClO、5％NaCLO、3％KMnO4之间有显著差异(P<0.05)，故采用H2O2做脱色剂进行脱色效果最好。
2、过氧化氢浓度对脱色效果的影响
过氧化氢浓度对脱色效果的影响见图14。由图14可知，随着过氧化氢浓度的不断增加，甲壳素白度逐渐提高，脱色效果明显，表明脱色效果与H2O2浓度呈正相关。过氧化氢浓度为30％时，白度值达到最大值，脱色能力最佳。过氧化氢浓度为30％时与过氧化氢浓度为20％、25％和35％时无显著差异(P＞0.05)，而过氧化氢浓度为30％时与过氧化氢浓度为10％和15％有显著性差异(P＜0.05)。产生这种现象的原因可能是由于等离子间的反应接近饱和，H2O2浓度的增加不会再影响脱色效果。因此，选择30％的H2O2浓度进行脱色较为合适。
3、固液比对脱色效果的影响
固液比对脱色效果的影响见图15。由图15可知，随着固液比的增加，白度值呈现出缓慢增加的趋势。当固液比为1：35时，白度值达到最大值，可达43.32，脱色能力最佳。固液比为1：35与固液比为1：10、1：15、1：20和1：25均有显著性差异(P＜0.05)，而与1：30无显著差异。由此可见，当过氧化氢液体足够多时，白度值增加较为显著，脱色效果较为明显。这可能是因为当固液比较大时，谷婪步甲甲壳素与过氧化氢液体充分接触，更多的过氧化氢分子使反应进行的较为彻底，从而使脱色效果更好。由于固液比为1：35与1：30白度值相差不大，为了节约脱色成本，采用1：30的固液比进行试验，不进行后期结果优化。
4、超声时间对脱色效果的影响
超声时间对脱色效果的影响见图16。由图16可知，随着超声时间的延长，甲壳素白度值随超声时间的增加而增加，在时间为1h、1.5h、2h时脱色效果变化不明显，3h时脱色能力最佳，效果最好，可达61.49。超声时间为3h与超声时间为1h、1.5h、2h和2.5h均有显著性差异(P＜0.05)。在单因素分析中，P＝0.000<0.05，说明这五个组之间是存在显著性差异的，即超声时间对谷婪步甲甲壳素脱色效果有显著影响。
5、脱色温度对脱色效果的影响
脱色温度对脱色效果的影响见图17。由图17可知，在45～50℃时脱色效果变化不明显，温度为60℃与温度为55℃无显著性差异(P＜0.05)，与65℃、50℃、45℃有显著性差异(P＞0.05)这可能是由于在低温环境下，H2O2的分解反应速率较慢；而在55℃以上时，随着温度升高，H2O2的分解反应速度加快，产生大量气体，脱色效果快速提高。当脱色温度达到60℃时，白度值最大，达到57.07。而后在60℃以后，再提高温度白度值反而减小，脱色效果不佳，这可能是由于温度过高时，H2O2受热分解加剧，从而降低了H2O2的浓度，与温度提高反应速度的效应相抵消，从而反应速度基本保持不变，因此，可选60℃为适宜脱色的温度。
6、pH对脱色效果的影响
pH对脱色效果的影响见图18。由图18可知，白度值随pH的增加呈现出先增加后减少的趋势。pH为9时与pH为11、13、7、5均有显著性差异(P<0.05)。当pH＝9时，可达43.06，即在偏碱性环境下，白度值最大，脱色效果最佳，脱色能力最好，是因为H2O2分解反应的发生，碱性环境能够促进H2O2的分解，加快的产生速度。因此，谷婪步甲甲壳素的脱色宜在碱性条件下进行。同时，碱性环境也有利于去除粗甲壳素残留的蛋白质，所以pH选择9，不另作后期响应面优化试验的考察因素。
以上各因素之间存在交互影响，最终的最佳脱色工艺为：H2O2浓度为30％，甲壳素粗品：脱色剂＝1g：30mL，反应温度为67.53℃，pH为9.0，超声功率为500W，反应时间为4h。
本发明利用索氏提取法脱除谷婪步甲成虫干粉中的油脂，再通过超声波辅助蛋白酶和有机酸分别脱除蛋白质和无机盐，最后再利用脱色剂进行脱色。脱除油脂的最佳有机溶剂是石油醚脱脂8h；脱除蛋白质的最适宜条件是：碱性蛋白酶溶液的浓度为0.03％，脱脂虫粉：蛋白酶溶液＝1g：9mL，反应温度为53℃，pH为9.0，超声功率500W，反应时间为2.8h；脱除无机盐的最适宜条件是：乙酸溶液浓度20％，脱蛋白粉：酸溶液＝1g：11mL，反应温度为室温，超声功率为180W，反应时间为23min；最佳脱色工艺为：H2O2浓度为30％，甲壳素粗品：脱色剂＝1g：30mL，反应温度为67.53℃，pH为9.0，超声功率为500W，反应时间为4h。在该条件下甲壳素的得率为32.57％，谷婪步甲的白度值为74.2371。
由图19红外光谱图中可见，通过比对在最佳条件下制备的甲壳素样品与标准甲壳素样品红外光谱图可知，本工艺制备的谷婪步甲甲壳素样品与标准甲壳素样品化学结构完全一致，说明从谷婪步甲中提取的确系甲壳素。

Claims (10)

1.一种谷婪步甲甲壳素提取与脱色方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制粉：将新鲜的谷婪步甲成虫洗净后装入铝盒内，置于烘箱内烘至恒重，然后用破壁机破壁后研磨，得到谷婪步甲虫粉；
(2)脱脂：称取步骤(1)所得谷婪步甲虫粉，用滤纸包包好置入索式提取器的提取筒中，然后按照谷婪步甲虫粉：脱脂剂＝1g：(200～400)mL的比例，将脱脂剂加入事先恒重的烧瓶中，置于95±5℃水浴中连续提取5～10h，每小时的虹吸回流次数不少于4次，提取结束后取出滤纸包，放入事先恒重的称量瓶中，将称量瓶置于烘箱内，打开烘箱箱门在105土5℃下烘干20～40min，待有机溶剂挥发后，用称量瓶瓶盖盖住瓶口一半，关闭烘箱箱门，在105土2℃下烘干1～3小时，然后取出称量瓶盖上瓶盖，置于干燥器中冷却20～40min得到脱脂虫粉；
(3)脱蛋白质：称取步骤(2)所得脱脂虫粉，按脱脂虫粉：蛋白酶溶液＝1g：(6～15)mL的比例，将脱脂虫粉与质量浓度为0.02～0.1％的蛋白酶溶液置于离心管中，将离心管放入超声波清洗器中超声反应1～3h，反应结束后将离心管取出置于低速离心机，在3000r/min转速下离心3～10min，将上清液弃去，再向离心管底部固体中加蒸馏水水洗数次至中性，将离心管置于烘箱内烘至恒重得到脱蛋白虫粉；
(4)脱无机盐：称取步骤(3)所得脱蛋白虫粉，室温条件下，按脱蛋白粉：酸溶液＝1g：(6～15)mL的比例，将脱蛋白虫粉和质量浓度为6～22％的酸溶液置于离心管中，将离心管放入超声波清洗器中超声反应10～30min，反应结束后将离心管取出并置于低速离心机，在3000r/min转速下离心3～10min，将上清液弃去，再向离心管底部的固体中加蒸馏水水洗数次至中性，将离心管置于烘箱内烘至恒重得到甲壳素粗品；
(5)脱色：称取步骤(4)所得甲壳素粗品，按照甲壳素粗品：脱色剂＝1g：(10～30)mL的比例，将甲壳素粗品和脱色剂加入三角瓶中，调节pH为8.5～9.5，在60±10℃下以500W的功率超声处理2～5h后，用4层纱布过滤，将滤渣水洗数次，再将滤渣在85±5℃下烘干得到甲壳素成品。
2.根据权利要求1所述的谷婪步甲甲壳素提取与脱色方法，其特征在于，所述步骤(1)中烘箱温度为80～90℃，谷婪步甲虫粉过60目筛。
3.根据权利要求2所述的谷婪步甲甲壳素提取与脱色方法，其特征在于，所述步骤(2)中脱脂剂为石油醚、环己烷、异丙醇中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的谷婪步甲甲壳素提取与脱色方法，其特征在于，所述步骤(3)中蛋白酶溶液为碱性蛋白酶溶液、木瓜蛋白酶溶液和胰蛋白酶溶液中的一种或几种。
5.根据权利要求4所述的谷婪步甲甲壳素提取与脱色方法，其特征在于，碱性蛋白酶溶液的pH控制为9.0～11.0，木瓜蛋白酶溶液的pH控制为5.0～6.0，胰蛋白酶溶液的pH控制为7.5～8.5。
6.根据权利要求4所述的谷婪步甲甲壳素提取与脱色方法，其特征在于，碱性蛋白酶溶液和木瓜蛋白酶溶液超声波处理温度为50±10℃，胰蛋白酶溶液超声波处理温度为37±5℃。
7.根据权利要求1所述的谷婪步甲甲壳素提取与脱色方法，其特征在于，所述步骤(4)中酸溶液为柠檬酸、苹果酸和乙酸溶液中的一种或几种。
8.根据权利要求1所述的谷婪步甲甲壳素提取与脱色方法，其特征在于，所述步骤(5)中脱色剂为H2O2、NaClO和KMnO4中的一种或几种。
9.根据权利要求8所述的谷婪步甲甲壳素提取与脱色方法，其特征在于，所述H2O2的质量浓度为10％～30％；所述NaClO的质量浓度为5％～10％；所述KMnO4的质量浓度为3％～4％，利用KMnO4脱色处理后，需要以甲壳素粗品：草酸＝1g：(70～80)mL的比例加入质量浓度为2～5％的草酸溶液中和滤渣中剩余的KMnO4，再水洗过滤数次并干燥。
10.根据权利要求1至9任意一项所述的谷婪步甲甲壳素提取与脱色方法，其特征在于，所述步骤(3)至步骤(5)中超声波清洗器的超声功率为150～500W；
步骤(2)中脱脂剂为石油醚，反应时间为8h；
步骤(3)中蛋白酶溶液为碱性蛋白酶溶液，碱性蛋白酶溶液的浓度为0.03％，脱脂虫粉：蛋白酶溶液＝1g：9mL，反应温度为53℃，pH为9.0，超声功率500W，反应时间为2.8h；
步骤(4)中酸溶液为乙酸溶液，乙酸溶液浓度20％，脱蛋白粉：酸溶液＝1g：11mL，反应温度为室温，超声功率为180W，反应时间为23min；
步骤(5)中脱色剂为H2O2，H2O2浓度为30％，甲壳素粗品：脱色剂＝1g：30mL，反应温度为67.53℃，pH为9.0，超声功率为500W，反应时间为4h。
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