CN112056564B - 一种磷酸化修饰大米谷蛋白凝胶包封核黄素的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种磷酸化修饰大米谷蛋白凝胶包封核黄素的制备方法，是以碎米为原料，首先采用碱提酸沉法得到大米谷蛋白，然后将大米谷蛋白与三聚磷酸钠混合后制备磷酸化大米谷蛋白，经加热、冷却等步骤，加入一定量的核黄素，最后加入凝胶诱导剂形成包封核黄素的磷酸化大米谷蛋白凝胶。本方法制备的凝胶包封核黄素的效率>98％，在储藏4周后核黄素损失率<5％。本发明构建的植物蛋白凝胶体系，能有效地提高核黄素的包封效率和储存稳定性，大大提高了核黄素的生物利用率，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种磷酸化修饰大米谷蛋白凝胶包封核黄素的制备方法，属于食品蛋白质加工的技术领域。
背景技术
功能性食品中的大多数功效成分包括脂溶性和水溶性维生素、花青素、单萜类以及多酚类植物化合物等生物利用度往往比较低，在提取、加工、运输及储藏过程中，或在食品应用过程中，暴露于空气、水、紫外线等物理条件下，因其自身稳定性差容易导致活性成分分解、破坏；另外，直接添加的天然活性物质因溶解性差异(水溶性/脂溶性)，在体内消化时易被酶解或随体液排出，难以实现良好吸收利用。所以研制食品/药品输送系统可以保护功能性食品在外界环境中不被破坏分解，同时也能提高其在人体胃肠道内的吸收利用效率。
为了提高药物及活性物质的生物利用率，国内外研究学者做了大量研究工作，各种技术也层出不穷。目前对生物活性物质的包封方法主要有：
1、脂质体
脂质体能运载疏水和亲水的分子，这种独特的优良性质使其成为被广泛应用的疏水药物靶向输送运载系统。
2、微乳液
微乳液是一个液态-非液态分散系统，具有良好的热力学稳定性，并且自发形成。其液滴大小一般为0.005-0.05μm。微乳液是在油相、水相和表面活性剂混合物中自体装配的产物。它具有光学各向同性和热力学稳定性的优势。表面活性剂的选择是微乳液组成成分的关键所在。表面活性剂亲水性-亲脂性平衡可通过加入短链的醇来调节，或者加入非离子型表面活性剂以制备稳定的微乳液。
3、纳米颗粒
因为尺寸足够小，对于生物膜屏障，纳米颗粒表现出非常好的穿透性。除此之外，它对于特定靶向器官的独特修饰作用，让它成为药物载体的不二之选。纳米颗粒运输系统非常适合包封高度疏水的化合物以增强其水溶性。
4、凝胶
凝胶作为载体用于包封药物或者营养物质，不但可以保护活性营养物质，还可以达到靶向释放的效果。
大米蛋白具有低过敏性、高营养价值和氨基酸种类丰富等特点。大米蛋白根据其溶解性的不同可以分为清蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白。其中，谷蛋白约占大米蛋白的80％，通常通过疏水相互作用和二硫键形成聚集体和水不溶性大分子。大米蛋白在食品加工中最重要的功能特性之一是其在加热时的凝胶特性，这显著影响最终产品的质地和感官特性。
蛋白凝胶化包括蛋白质肽链的伸展、裂解、结合及聚集等四个复杂的过程，通过伸展肽链间的相互作用而形成凝胶。首先，蛋白在适当的条件下，蛋白质分子开始缓慢伸展，原来埋在分子链内部的巯基、二硫键、疏水性基团等功能基团暴露出来，相邻的分子通过氢键、疏水相互作用、二硫键、范德华力以及静电相互作用等作用力形成网状的空间结构，从而形成凝胶。形成凝胶后，蛋白凝胶结构内部具有水通道和大量空腔可以包封生物活性成分。此外，这种凝胶还可以抵抗胃蛋白酶的消化水解，能够顺利转运活性物质至肠道，被小肠吸收利用，从而提高活性物质的生物利用率。
发明内容
本发明旨在提供一种磷酸化修饰大米谷蛋白凝胶包封核黄素的制备方法，本方法制得的蛋白凝胶包封核黄素具有包封效率高和储存稳定性好的特点。本发明方法新颖，安全性好，工艺简单，过程可控，无需复杂设备，有利于生产包封效率高、网络结构致密的蛋白质凝胶。
本发明通过三聚磷酸钠与大米谷蛋白混合，得到磷酸化修饰大米谷蛋白，将磷酸化修饰的大米谷蛋白在加入凝固剂后形成蛋白凝胶，利用其包封生物活性物质(核黄素)。与天然大米谷蛋白凝胶相比，磷酸化改性后大米谷蛋白凝胶包封核黄素的包封效率更高，在储存4周后核黄素的损失率更低。
本发明磷酸化修饰大米谷蛋白凝胶包封核黄素的制备方法，是以碎米为原料，首先采用碱提酸沉法得到大米谷蛋白，然后将大米谷蛋白与三聚磷酸钠混合后制备磷酸化大米谷蛋白，经加热、冷却等步骤，加入一定量的核黄素，最后加入凝胶诱导剂形成包封核黄素的磷酸化大米谷蛋白凝胶。具体包括以下步骤：
步骤1：将碎米研磨过100目筛后，将碎米粉与蒸馏水以1g:10mL的比例混合，室温下搅拌2h后离心，将所得沉淀物与浓度为5wt％的NaCl溶液以1g:10mL的比例混合，室温下搅拌2h后离心，将所得沉淀物与浓度为0.05M的NaOH溶液以1g:10mL的比例混合，室温下搅拌2h后离心，取上清液，使用1M的HCl溶液调节上清液的pH值至5.4，离心取沉淀，水洗两次，冷冻干燥得到大米谷蛋白；
步骤2：将大米谷蛋白与蒸馏水以1g:10mL的比例混合，并调节pH值至大米谷蛋白完全溶解，4℃过夜，使其充分水合；将磷酸化试剂与上述大米谷蛋白溶液混合，pH值调至8.5，在45℃下反应90min；反应结束后，调pH至5.4，以5000g离心10min，取沉淀回调pH至中性，冷冻干燥得磷酸化大米谷蛋白；
步骤3：将大米谷蛋白和磷酸化大米谷蛋白以0.6-1.0g:10mL的比例分散在蒸馏水中，过夜充分水合，在75-95℃加热30min，冷却后，将50mg的核黄素加入到变性的蛋白溶液中，搅拌均匀，加入凝胶诱导剂诱导蛋白形成凝胶，然后在4℃储存。
步骤2中，所述磷酸化试剂为三聚磷酸钠，添加量为大米谷蛋白质量的1％-7％。
步骤3中，所述凝胶诱导剂为葡萄糖酸-δ-内酯(GDL)，浓度为5％(w/v)。
磷酸化改性可以提高大米谷蛋白的功能性质，促进大米谷蛋白的热聚集，改善大米谷蛋白的凝胶性质，因此大米谷蛋白的磷酸化程度对于凝胶包封核黄素的包封效率以及损失率具有重要影响，适当磷酸化改性程度的大米谷蛋白凝胶能够提高核黄素的包封效率以及降低核黄素的损失率。另外，凝胶剂的选择以及添加量对核黄素的包封效率以及损失率也有着显著的影响。不同的凝胶剂诱导的冷凝胶其凝胶强度和凝胶行为有所不同，对于核黄素的包封效果也有显著差异。
与已有技术相比，本发明的有益效果体现在：
1、因植物蛋白本身具有较高的营养价值以及良好的包封性能，本发明利用的改性植物蛋白凝胶包封法是一种绿色、健康、有效地活性物质包封技术。
2、本发明使用的磷酸化改性试剂是三聚磷酸钠，它是FDA允许使用的食品添加剂，因此保证了产品的安全性。
3、本发明使用磷酸化修饰的大米谷蛋白凝胶包封核黄素，与天然大米谷蛋白凝胶相比，本发明制备的蛋白凝胶包封核黄素的包封效率提高到98.91％，储存4周后核黄素的损失率降低至4.77％。由此可知，由磷酸化改性大米谷蛋白制备的凝胶包封核黄素的包封效率和储存稳定性大大提高，提高了其在生物活性成分递送中的应用价值。
4、本发明安全性好，无环境污染，工艺简单，无需复杂设备，易于工业化生产。
附图说明
图1是实施例1中大米谷蛋白和磷酸化大米谷蛋白凝胶包封核黄素的包封率和储存4周后核黄素的损失率。样品1和2分别代表大米谷蛋白凝胶和磷酸化大米谷蛋白凝胶。从图1中可以看出，磷酸化大米谷蛋白凝胶包封核黄素的包封率和储存4周后核黄素的损失率分别为82.19％和13.46％。与纯大米谷蛋白凝胶相比，磷酸化改性的大米谷蛋白凝胶包封核黄素的包封效率显著提高，储存4周后核黄素的损失率显著降低。
图2是实施例2中大米谷蛋白和磷酸化大米谷蛋白凝胶包封核黄素的包封率和储存4周后核黄素的损失率。样品1和2分别代表大米谷蛋白凝胶和磷酸化大米谷蛋白凝胶。从图2中可以看出，磷酸化大米谷蛋白凝胶包封核黄素的包封率和储存4周后核黄素的损失率分别为88.38％和9.73％。与纯大米谷蛋白凝胶相比，磷酸化改性的大米谷蛋白凝胶包封核黄素的包封效率显著提高，储存4周后核黄素的损失率显著降低。
图3是实施例3中大米谷蛋白和磷酸化大米谷蛋白凝胶包封核黄素的包封率和储存4周后核黄素的损失率。样品1和2分别代表大米谷蛋白凝胶和磷酸化大米谷蛋白凝胶。从图3中可以看出，磷酸化大米谷蛋白凝胶包封核黄素的包封率和储存4周后核黄素的损失率分别为98.91％和4.77％。与纯大米谷蛋白凝胶相比，磷酸化改性的大米谷蛋白凝胶包封核黄素的包封效率显著提高，储存4周后核黄素的损失率显著降低。
具体实施方式
非限定实施方式叙述如下：
实施例1：
1、将碎米研磨过100目筛后，将碎米粉与蒸馏水以1g:10mL的比例混合，室温下搅拌2h后离心，将所得沉淀物与浓度为5wt％的NaCl溶液以1g:10mL的比例混合，室温下搅拌2h后离心，将所得沉淀物与浓度为0.05M的NaOH溶液以1g:10mL的比例混合，室温下搅拌2h后离心，取上清液，使用1M的HCl溶液调节上清液的pH值至5.4，离心取沉淀，水洗两次，冷冻干燥得到大米谷蛋白；
2、将大米谷蛋白与蒸馏水以1g:10mL的比例混合，并调节pH值至大米谷蛋白完全溶解，4℃过夜，使其充分水合；将三聚磷酸钠(占大米谷蛋白的1％，w/w)与上述大米谷蛋白溶液混合，pH调至8.5，在45℃下反应90min；反应结束后，调pH至5.4，以5000g离心10min，取沉淀回调pH至中性，冷冻干燥得磷酸化大米谷蛋白；
3、将大米谷蛋白和磷酸化大米谷蛋白以0.6g:10mL的比例分散在10mL蒸馏水中，过夜充分水合，在75℃加热30min，冷却后，将50mg的核黄素加入到变性的蛋白溶液中，搅拌均匀，加入GDL(5％，w/v)诱导蛋白形成凝胶，然后在4℃储存。
经测定，磷酸化改性大米谷蛋白凝胶包封的核黄素包封率由76.31％增加到82.19％，储存4周后核黄素的损失率由25.55％降低到13.46％。
实施例2：
1、将碎米研磨过100目筛后，将碎米粉与蒸馏水以1g:10mL的比例混合，室温下搅拌2h后离心，将所得沉淀物与浓度为5wt％的NaCl溶液以1g:10mL的比例混合，室温下搅拌2h后离心，将所得沉淀物与浓度为0.05M的NaOH溶液以1g:10mL的比例混合，室温下搅拌2h后离心，取上清液，使用1M的HCl溶液调节上清液的pH值至5.4，离心取沉淀，水洗两次，冷冻干燥得到大米谷蛋白；
2、将大米谷蛋白与蒸馏水以1g:10mL的比例混合，并调节pH值至大米谷蛋白完全溶解，4℃过夜，使其充分水合；将三聚磷酸钠(占大米谷蛋白的4％，w/w)与上述大米谷蛋白溶液混合，pH调至8.5，在45℃下反应90min；反应结束后，调pH至5.4，以5000g离心10min，取沉淀回调pH至中性，冷冻干燥得磷酸化大米谷蛋白；
3、将大米谷蛋白和磷酸化大米谷蛋白以0.8g:10mL的比例分散在10mL蒸馏水中，过夜充分水合，在85℃加热30min，冷却后，将50mg的核黄素加入到变性的蛋白溶液中，搅拌均匀，加入GDL(5％，w/v)诱导蛋白形成凝胶，然后在4℃储存。
经测定，磷酸化改性大米谷蛋白凝胶包封的核黄素包封率由78.39％增加到88.38％，储存4周后核黄素的损失率由19.61％降低到9.73％。
实施例3：
1、将碎米研磨过100目筛后，将碎米粉与蒸馏水以1g:10mL的比例混合，室温下搅拌2h后离心，将所得沉淀物与浓度为5wt％的NaCl溶液以1g:10mL的比例混合，室温下搅拌2h后离心，将所得沉淀物与浓度为0.05M的NaOH溶液以1g:10mL的比例混合，室温下搅拌2h后离心，取上清液，使用1M的HCl溶液调节上清液的pH值至5.4，离心取沉淀，水洗两次，冷冻干燥得到大米谷蛋白；
2、将大米谷蛋白与蒸馏水以1g:10mL的比例混合，并调节pH值至大米谷蛋白完全溶解，4℃过夜，使其充分水合；将三聚磷酸钠(占大米谷蛋白的7％，w/w)与上述大米谷蛋白溶液混合，pH调至8.5，在45℃下反应90min；反应结束后，调pH至5.4，以5000g离心10min，取沉淀回调pH至中性，冷冻干燥得磷酸化大米谷蛋白；
3、将大米谷蛋白和磷酸化大米谷蛋白以1.0g:10mL的比例分散在10mL蒸馏水中，过夜充分水合，在95℃加热30min，冷却后，将50mg的核黄素加入到变性的蛋白溶液中，搅拌均匀，加入GDL(5％，w/v)诱导蛋白形成凝胶，然后在4℃储存。
经测定，磷酸化改性大米谷蛋白凝胶包封的核黄素包封率由83.26％增加到98.91％，储存4周后核黄素的损失率由16.55％降低到4.77％。
Claims (2)
1.一种磷酸化修饰大米谷蛋白凝胶包封核黄素的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤1：将碎米研磨过100目筛后，将碎米粉与蒸馏水混合，室温下搅拌2 h后离心，将所得沉淀物与浓度为5wt%的NaCl溶液混合，室温下搅拌2 h后离心，将所得沉淀物与浓度为0.05M的NaOH溶液混合，室温下搅拌2 h后离心，取上清液，使用1M的HCl溶液调节上清液的pH值至5.4，离心取沉淀，水洗两次，冷冻干燥得到大米谷蛋白；
步骤2：将大米谷蛋白与蒸馏水以1g:10mL的比例混合，并调节pH值至大米谷蛋白完全溶解，4℃过夜，使其充分水合；将磷酸化试剂与大米谷蛋白溶液混合，pH值调至8.5，在45℃下反应90min；反应结束后，调pH至5.4，以5000g离心10 min，取沉淀回调pH至中性，冷冻干燥得磷酸化大米谷蛋白；
步骤3：将大米谷蛋白和磷酸化大米谷蛋白分散在蒸馏水中，过夜充分水合，在75-95℃加热30 min，冷却后，将核黄素加入到变性的蛋白溶液中，搅拌均匀，加入凝胶诱导剂诱导蛋白形成凝胶，然后在4 ℃储存；
步骤2中，所述磷酸化试剂为三聚磷酸钠，添加量为大米谷蛋白质量的1%-7%；
步骤3中，将大米谷蛋白和磷酸化大米谷蛋白分别以0.6-1.0g:10mL的比例分散在10mL蒸馏水中；核黄素的添加量为50 mg；
步骤3中，所述凝胶诱导剂为葡萄糖酸-δ-内酯，添加浓度为5%。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
步骤1中，将碎米粉与蒸馏水以1g:10mL的比例混合，室温下搅拌2 h后离心，将所得沉淀物与浓度为5wt%的NaCl溶液以1g:10mL的比例混合，室温下搅拌2 h后离心，将所得沉淀物与浓度为0.05M的NaOH溶液以1g:10mL的比例混合。
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