CN112028998A - 一种烯效唑单克隆抗体的制备方法 - Google Patents

一种烯效唑单克隆抗体的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种烯效唑单克隆抗体的制备方法，通过琥珀酸酐法合成人工半抗原烯效唑半琥珀酸酯，进一步采用碳二亚胺法将半抗原与牛血清蛋白偶联得到烯效唑免疫抗原，对小鼠进行免疫，采用杂交瘤技术制备得到高度均质、纯度高、专一性强的抗烯效唑单克隆抗体。本发明方法具有重复性好、易于标准化及可保证无限量供应等优势。基于该单克隆抗体建立的间接竞争ELISA方法具有快速、廉价、简便、灵敏、特异的优点，可便携进行现场监测，克服了传统检测方法的缺点。且单抗可望进一步应用到免疫传感器、胶体金免疫层析试纸条等技术的构建，具有广阔的应用前景。

Description

一种烯效唑单克隆抗体的制备方法
技术领域
本发明涉及单克隆抗体技术领域，具体的说，公开了一种烯效唑单克隆抗体的制备方法。
背景技术
烯效唑是20世纪80年代开发的一种三唑类的广谱性植物生长延缓剂，兼有杀菌和除草作用，已被广泛应用到农业和园艺领域中。从毒理学的角度来看，烯效唑可能会对人以及动物的内分泌有一定的副作用，此外烯效唑的光化学稳定性、低生物可降解性以及在环境中易转移的特性使得它能够在土壤中长期存在。因此，长期使用及滥用烯效唑可能会对人类健康造成影响。为此，许多国家和国际组织高度关注其安全性，陆续出台了一些食品中该类植物生长调节剂的限量标准。如加拿大规定番茄中烯效唑的最大残留量为0.01mg/kg；日本规定一些果蔬中烯效唑的最大残留量为0.05-0.5mg/kg；我国食品安全国家标准GB2763-2019(食品中农药最大残留限量)则规定糙米中烯效唑最大残留量为0.1mg/kg、小麦、花生仁和油菜籽均为0.05mg/kg。
目前，烯效唑的检测方法主要有高效液相色谱法、气相色谱法、高效液相色谱-串联质谱法等。这些分析方法重现性好，灵敏度高，但所需仪器设备昂贵，需要专业人员操作，而且操作过程繁琐，分析速度慢，不适用于现场快速检测。免疫分析法是以抗原与抗体的高度特异性结合反应为基础，具有很高的特异性和灵敏度，而且样品用量少、前处理简单、检测成本低，比较适用于大规模的现场样品检测，已在抗生素及其它化学残留物的检测方面得到了广泛的应用。
发明内容
为了解决现有技术的这些不足之处，本发明提供一种烯效唑单克隆抗体的制备方法。
为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
一种烯效唑单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：
S1.合成半抗原：在1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯的催化作用下，以无水吡啶为溶剂，烯效唑和琥珀酸酐发生酰化反应，引入活性基团羧基和连接臂，得到半抗原烯效唑半琥珀酸酯；
S2.合成免疫全抗原和检测全抗原：采用碳二亚胺法将烯效唑半琥珀酸酯分别与牛血清蛋白BSA和卵清蛋白OVA进行偶联，得到免疫全抗原和检测全抗原；
S3.免疫：用上述免疫全抗原免疫小鼠，第一次免疫采用弗氏完全试剂与免疫全抗原充分乳化，腹部皮下多点注射，之后每隔4周加强免疫一次，加强免疫采用弗氏不完全试剂佐剂与抗原充分乳化，最后一次加强免疫通过腹腔注射40μg不加佐剂的抗原；
S4.筛选：测定小鼠血清效价和其特异性；
S5.细胞融合：选择血清效价和特异性最优的小鼠取脾细胞与骨髓瘤细胞体外融合；
S6.杂交瘤细胞的筛选和阳性克隆的验证：
选择性培养基筛选融合细胞，检测筛选阳性细胞，克隆化培养，进一步克隆筛选阳性细胞，阳性克隆扩培与冻存；
每天观察杂交瘤细胞生长情况，约第十天，待杂交瘤细胞长至超过孔底面积的10％时，吸出120μL细胞培养液，进行抗体检测筛选，并用新的2％HAT-LGDMEM+15％小牛血清细胞培养基补足每孔200μL；
采取间接ELISA与间接竞争ELISA筛选；
采用棋盘法，测定阳性血清的效价与半抑制浓度，选定筛选阳性克隆的包被浓度与标准品浓度；
S7.杂交瘤细胞的克隆化：
显微镜下观察阳性孔内细胞数目，用移液枪轻轻吹打附着在孔壁的细胞，吸取的细胞培养液转入提前装有小牛血清细胞培养基的孔细胞板，进行扩大培养；利用梯度稀释法对阳性细胞孔进行亚克隆，两天后，当亚克隆板中出现细胞团时，用移液枪轻轻吹打细胞团，再吸取细胞培养液，通过采取间接ELISA与间接竞争ELISA筛选阳性细胞与特异性强的细胞株，步骤同杂交瘤细胞的筛选和阳性克隆的验证；对于阳性非单克隆孔继续进行亚克隆，直至筛选出效价高，且特异性强的单克隆细胞；每次亚克隆之前都要对筛选到的阳性细胞进行扩培，待培养液变黄后，吸取培养液，验证其效价与特异性，并适时进行分装扩培；对筛选到的高效价且特异性强的单克隆细胞先转至24孔进行扩培，验证其效价与特异性后，再转至细胞培养瓶扩大培养；
S8.杂交瘤细胞的冻存：
待扩大培养的杂交瘤细胞长满培养瓶的80％，且处于对数生长中期，细胞透亮，均匀一致时，于冻存前一日更换全部培养基，并再次通过间接ELISA与间接竞争ELISA验证其效价与特异性；冻存前，将冻存液和冻存管置于4℃预冷2h；用弯头滴管将细胞从瓶壁轻轻吹打下来，收集于10mL离心管中，1000rpm离心8min，弃上清；将沉淀的细胞用预冷的冻存液重悬，调整细胞浓度为106-107个/mL；每管1mL分装至细胞冻存管，标明细胞名称、批次、冻存日期等，于-20℃预冻1h，而后转入-80℃超低温冰箱冷冻过夜，再转入液氮罐保存；
S9.单克隆抗体的大量制备：
取成年Balb/c小鼠，于接种杂交瘤细胞前一周腹腔注射液体石蜡，每只注射0.5mL；一周以后，将准备好的处于对数生长中期的杂交瘤细胞腹腔注射小鼠；腹水的产生需1-2周，期间密切观察小鼠，若腹部明显胀大，且腹部皮肤有紧张感，即可采集腹水；抽取腹水：测定腹水效价和IC50，分装，-20℃冻存备用。
步骤S3中所述免疫过程具体为：从免疫全抗原免疫小鼠中选取八周±7天的雌性小鼠，免疫原与等体积弗氏完全佐剂充分乳化，100μg/只的剂量对其进行皮下多点注射，接下来每隔一个月±7天进行一次加强免疫，将免疫原与等体积弗氏不完全佐剂充分乳化，进行皮下多点注射，其中第二次免疫注射剂量为85μg/只，第三次免疫注射剂量为60μg/只，从第2次免疫后开始，每次加强免疫的前三天断尾取血，检测抗体效价和特异性。
步骤S5中所述细胞融合具体为：将脾细胞与骨髓瘤细胞混合，离心弃上清液，用50％PEG溶液进行融合，将融合后的细胞加入2％HAT-LGDMEM+20％小牛血清选择性培养基培养。
步骤S6中所述采取间接ELISA与间接竞争ELISA筛选具体为：
用2％HAT-LGDMEM+20％小牛血清选择性培养基培养融合后的细胞，接种到96孔细胞培养板中培养，用间接ELISA与间接竞争ELISA法筛选特异性高的阳性孔，将阳性孔中的细胞用有限稀释法进行克隆筛选，直至获得分泌单一的单克隆抗体的杂交瘤细胞。
步骤S5中的所述细胞融合，包括如下步骤：
S51.骨髓瘤细胞的复苏：
细胞融合前十天，复苏骨髓瘤细胞：迅速放至37℃的温水中，不停地摇动至培养基完全解冻；用2～3mL8-氮鸟嘌呤培养液吹打细胞，加入装有7mL8-氮鸟嘌呤培养液的培养瓶中培养优化，使之缺失HGPRT酶，便于后期HAT筛选杂交瘤细胞，置37℃的5％CO2培养箱培养，培养7天后将培养液换为DMEM培养基；
S52.骨髓瘤细胞的准备：
于融合前36h扩大培养骨髓瘤细胞SP2/0：融合当天，用弯头滴管将骨髓瘤细胞从瓶壁轻轻吹下，收集于50mL离心管或融合管内，用DMEM定容至30mL，1000rpm离心7min，弃去上清液；轻轻吹打细胞，将骨髓瘤细胞重悬浮于10mLDMEM培养基中，在显微镜下观察，细胞存活率达到90％则可用于细胞融合；
S53.饲养细胞的准备：
用20～25克Balb/c小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，小鼠在水温中游泳30min后拉颈处死，放入装有0.1％新洁尔灭的生理盐水溶液中浸没，轻轻摇晃两分钟，至老鼠毛发顺遂无气泡，用蒸馏水着重清洗老鼠尾部，腹部，以及头部，再放入75％乙醇中浸泡片刻，放入超净工作台；准备二支10mL离心管加入10mLDMEM培养基，用镊子提起小鼠腹部皮肤，剪一小口，然后用弯头滴管通过小口向腹腔内注入4mL培养液，小心在腹腔内吹打，最后吸出培养液于离心管中。反复2～3次。1000rpm离心7min，弃上清液；配置80mL2％HAT-LGDMEM+20％小牛血清细胞培养基，用5mL培养基将巨噬细胞沉淀重悬，观察细胞形态与数目，细胞密度为2×105个/mL适宜，将上述巨噬细胞悬液加入所配置的培养基中，混合均匀，铺于8块96孔细胞培养板中，每孔100μL，置37℃5％CO2的培养箱中培养；
S54.免疫脾细胞悬液的制备：
取经最后一次用40μg免疫抗原，不加佐剂腹腔注射加强免疫三天后的Balb/c小鼠，摘除眼球采血，眼球血4℃静置5min后，5000r/min离心10min，分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清；通过颈脱位处死小鼠，浸泡于75％酒精中5min，置灭菌平皿中，剪开左侧腹部皮肤，即可见到脾脏，更换灭菌眼科剪镊，在超净台中用无菌手术剪剪开腹膜，取出脾脏置于盛有10mLDMEM培养基的平皿中，轻轻洗涤3次，并小心剥去脾脏周围的结缔组织；将脾脏移入另一盛有10mLDMEM培养基的平皿中，用医用剪刀将脾脏剪成3-4小段，再用经灭菌消毒的研磨棒，轻压脾脏至近白色，制成细胞悬液；用200目不锈钢网过滤除去脾细胞悬液中的大团块，收集脾细胞悬液，1000rpm离心7min，弃上清液，然后将脾细胞重悬于10mLDMEM培养基，显微镜下观察细胞形态与数目；
S55.细胞融合：
将准备的骨髓瘤细胞SP2/0加入到免疫脾细胞悬浮液中，补加DMEM培养基至30mL，充分混匀；800rpm离心7min，将上清液快速倒净；在离心完成前，应于超净工作台内准备好37℃水浴，并将PEG和DMEM培养液预温至37℃；在手掌上轻击融合管底部，使沉淀细胞松散均匀，置37℃水浴中预热；用1mL弯头滴管在1min内滴加1mL预热至37℃的pH＝8.0的50％PEG，边加边轻轻摇动混匀；用1mL弯头滴管在5min内加10mL预热至37℃的DMEM培养基，具体滴加方法：第1min:1mL；第2min:1mL；第3min:1.5mL；第4min:1.5mL；第5min:加完剩下的5mLDMEM，最后补加DMEM至30mL，室温静置10min。800rpm离心5min，弃上清；加入5mL2％HAT-LGDMEM+20％小牛血清细胞培养基，轻轻吹打沉淀细胞，使其悬浮并混匀，然后补加2％HAT-LG DMEM+20％小牛血清细胞培养基至80mL；分装至融合前一天培养的含有饲养细胞的96孔细胞培养板，每孔100μL；置37℃5％CO2培养箱内培养；培养至第5天，用2％HAT-LGDMEM+20％小牛血清细胞培养基换半液；培养至第7天，用2％HAT-LG DMEM+20％小牛血清细胞培养基换出孔内全部培养液。
步骤S9中所述单克隆抗体大量制备具体为：用液体石蜡0.5mL注射小鼠腹腔，一周后腹腔注射处于对数生长中期的杂交瘤细胞0.5mL，3日后每日观察小鼠的腹部情况，若腹部明显胀大，且腹部皮肤有紧张感，即可采集腹水。
本发明的有益效果在于：
本发明通过化学合成烯效唑免疫抗原，对小鼠进行免疫，制备得到高度均质、纯度高、专一性强的抗烯效唑单克隆抗体，制备方法具有重复性好、易于标准化及可保证无限量供应等优势。基于该单克隆抗体建立的间接竞争ELISA方法具有快速、廉价、简便、灵敏、特异的优点，可便携进行现场监测，克服了传统检测方法的缺点。且单抗可望进一步应用到免疫传感器、胶体金免疫层析试纸条等技术的构建，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明方法烯效唑单克隆抗体亚型鉴定图；
图2为本发明方法所述腹水的IC50。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，应当理解，以下所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明；除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
一种烯效唑单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：
S1.合成半抗原：在1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯的催化作用下，以无水吡啶为溶剂，烯效唑和琥珀酸酐发生酰化反应，引入活性基团羧基和连接臂，得到半抗原烯效唑半琥珀酸酯；
采用回流法合成半抗原烯效唑半琥珀酸酯，以无水吡啶为溶剂，1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(DBU)为催化剂，称取0.87g(2.98mmol)烯效唑，1.1g(10.99mmol)琥珀酸酐(烯效唑与琥珀酸酐摩尔质量比为3:11)，40mg(0.26mmol)DBU混合均匀，在120℃下反应10h，反应结束后，旋转蒸发溶剂至近干，加入20mL甲基叔丁基醚溶解残留物，再依次用2mol/L盐酸、饱和食盐水、蒸馏水洗涤有机溶剂(20mL×3)，最后用无水硫酸钠干燥，旋转蒸发溶剂得到烯效唑半抗原；
S2.合成免疫全抗原和检测全抗原：采用碳二亚胺法将烯效唑半琥珀酸酯分别与牛血清蛋白BSA和卵清蛋白OVA进行偶联，得到免疫全抗原和检测全抗原；
准确称取1.95mg(4.97μmol)烯效唑半抗原溶于200μLN，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，缓慢加入2mg(17.38μmol)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS溶于200μLDMF中)，再将混合溶液迅速加入到3.6mg(18.78μmol)称量好的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)中，室温下震荡12h，得到溶液1；称取BSA5mg(0.075μmol；烯效唑半抗原与BSA摩尔质量比为66.7:1)溶于1.8mL1×PBS中，得到溶液2；将溶液1逐滴加入溶液2中，冰浴振荡反应12h；将反应混合物移入透析袋中，用1×PBS溶液透析3d，得烯效唑免疫全抗原；
称取烯效唑半抗原4.7mg(11.98μmol)溶于200μLDMF中，将3.45mg(29.97μmol)NHS溶于200μLDMF中，缓慢加入到半抗原溶液中，再将混合溶液快速加入到2.88mg(15.02μmol)EDC中，室温震荡12h，得到溶液3；称取OVA4.5mg(0.010μmol；烯效唑半抗原与OVA摩尔量比为120:1)溶于1.8mL1×PBS中，得到溶液4。再将溶液3逐滴加入溶液4中，冰浴振荡反应12h。将反应混合物移入透析袋中，用1×PBS溶液透析3d，可得烯效唑检测全抗原；
S3.免疫：用上述免疫全抗原免疫小鼠，第一次免疫采用弗氏完全试剂与免疫全抗原充分乳化，腹部皮下多点注射，之后每隔4周加强免疫一次，加强免疫采用弗氏不完全佐剂与抗原充分乳化，最后一次加强免疫通过腹腔注射40μg不加佐剂的抗原；
S4.筛选：测定小鼠血清效价和其特异性；
选取OD450nm达到1.0～1.5时抗血清的最大稀释倍数为抗体的效价；
通过检测原与烯效唑标准品对血清抗体的竞争实验，以BSA、OVA载体蛋白为对照，得半抑制浓度IC50，同时测定血清抗体与烯效唑类似物的交叉反应率，半抑制浓度越低、与类似物的交叉反应率越低，表明该血清抗体的特异性越强；
S5.细胞融合：选择血清效价和特异性最优的小鼠取脾细胞与骨髓瘤细胞体外融合；具体包括如下步骤：
S51.骨髓瘤细胞的复苏：
细胞融合前十天，复苏骨髓瘤细胞：将一支冻存前细胞数目为5×106个的SP2/0细胞管从液氮罐中取出后迅速放至37℃的温水中，不停地摇动至培养基完全解冻；用2～3mL8-氮鸟嘌呤培养液吹打细胞，加入装有7mL8-氮鸟嘌呤培养液的培养瓶中培养优化，使之缺失HGPRT酶，便于后期HAT筛选杂交瘤细胞，置37℃的5％CO2培养箱培养，培养7天后将培养液换为DMEM培养基；
S52.骨髓瘤细胞的准备：
骨髓瘤细胞SP2/0于融合前36h扩大培养，即1瓶扩至6瓶进行培养。融合当天，用弯头滴管将骨髓瘤细胞从瓶壁轻轻吹下，收集于50mL离心管或融合管内，用DMEM定容至30mL，1000rpm离心7min，弃去上清液；轻轻吹打细胞，将骨髓瘤细胞重悬浮于10mLDMEM培养基中，在显微镜下观察，细胞存活率达到90％则可用于细胞融合；
S53.饲养细胞的准备：
用20～25克Balb/c小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，小鼠在水温中游泳30min后拉颈处死，放入装有0.1％新洁尔灭的生理盐水溶液中浸没，轻轻摇晃两分钟，至老鼠毛发顺遂无气泡，用蒸馏水着重清洗老鼠尾部，腹部，以及头部，再放入75％乙醇中浸泡片刻，放入超净工作台；准备二支10mL离心管加入10mLDMEM培养基，用镊子提起小鼠腹部皮肤，剪一小口，然后用弯头滴管通过小口向腹腔内注入4mL培养液，小心在腹腔内吹打，最后吸出培养液于离心管中，反复2～3次。1000rpm离心7min，弃上清液；配置80mL2％HAT-LGDMEM+20％小牛血清细胞培养基，用5mL培养基将巨噬细胞沉淀重悬，观察细胞形态与数目，细胞密度为2×105个/mL适宜，将上述巨噬细胞悬液加入所配置的培养基中，混合均匀，铺于8块96孔细胞培养板中，每孔100μL，置37℃5％CO2的培养箱中培养。
S54.免疫脾细胞悬液的制备：
取经最后一次用40μg免疫抗原，不加佐剂腹腔注射加强免疫三天后的Balb/c小鼠，摘除眼球采血，眼球血4℃静置5min后，5000r/min离心10min，分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清；通过颈脱位处死小鼠，浸泡于75％酒精中5min，置灭菌平皿中，剪开左侧腹部皮肤，即可见到脾脏，更换灭菌眼科剪镊，在超净工作台中用无菌手术剪剪开腹膜，取出脾脏置于盛有10mLDMEM培养基的平皿中，轻轻洗涤3次，并小心剥去脾脏周围的结缔组织；将脾脏移入另一盛有10mLDMEM培养基的平皿中，用医用剪刀将脾脏剪成3-4小段，再用经灭菌消毒的研磨棒，轻压脾脏至近白色，制成细胞悬液；用200目不锈钢网过滤除去脾细胞悬液中的大团块，收集脾细胞悬液，1000rpm离心7min，弃上清液，然后将脾细胞重悬于10mLDMEM培养基，显微镜下观察细胞形态与数目；
S55.细胞融合：
将准备的骨髓瘤细胞SP2/0加入到免疫脾细胞悬浮液中，补加DMEM培养基至30mL，充分混匀；800rpm离心7min，将上清液快速倒净；在离心完成前，应于超净工作台内准备好37℃水浴，并将PEG和DMEM培养液预温至37℃；在手掌上轻击融合管底部，使沉淀细胞松散均匀，置37℃水浴中预热；用1mL弯头滴管在1min内滴加预热至37℃的50％PEG(pH8.0)1mL，边加边轻轻摇动混匀；用1mL弯头滴管在5min内加10mL预热至37℃的DMEM培养基，具体加法：第1min:1mL；第2min:1mL；第3min:1.5mL；第4min:1.5mL；第5min:加完剩下的5mLDMEM，最后补加DMEM至30mL，室温静置10min。800rpm离心5min，弃上清；加入5mL2％HAT-LGDMEM+20％小牛血清细胞培养基，轻轻吹打沉淀细胞，使其悬浮并混匀，然后补加2％HAT-LG DMEM+20％小牛血清细胞培养基至80mL。分装至融合前一天培养的含有饲养细胞的96孔细胞培养板，每孔100μL；置37℃5％CO2培养箱内培养；培养至第5天，用2％HAT-LGDMEM+20％小牛血清细胞培养基换半液；培养至第7天，用2％HAT-LGDMEM+20％小牛血清细胞培养基换出孔内全部培养液。
S6.杂交瘤细胞的筛选和阳性克隆的验证：
选择性培养基筛选融合细胞，检测筛选阳性细胞，克隆化培养，进一步克隆筛选阳性细胞，阳性克隆扩培与冻存；
每天观察杂交瘤细胞生长情况，约第十天，待杂交瘤细胞长至超过孔底面积的10％时，吸出120μL细胞培养液，进行抗体检测筛选，并用新的2％HAT-LGDMEM+15％小牛血清细胞培养基补足每孔200μL。
采取间接ELISA与间接竞争ELISA筛选；
采用棋盘法，测定阳性血清的效价与半抑制浓度，选定筛选阳性克隆的包被浓度与标准品浓度：用检测原包被96孔酶标板，包被浓度为400ng/mL，每孔100μL，37℃温育2h；PBST洗板三次，用5％脱脂牛奶封闭酶标板，每孔300μL，37℃温育1h；PBST洗板三次，对照板，每孔加入50μL细胞培养液与50μL1×PBS，抑制板每孔加入50μL细胞培养液与50μL200ng/mL的烯效唑标准品，同时设立阳性对照(烯效唑阳性血清1:32000)、阴性对照1(HT培养基)、阴性对照2(M13阳性血清1:8000)、空白对照(1×PBS)，37℃温育30min；PBST洗板三次，每孔加入100μL1:5000羊抗鼠IgG-HRP，37℃保湿30min；PBST洗板三次，每孔加入100μLTMB底物显色液，37℃温育显色7min，每孔加入50μL2mol/LH2SO4溶液终止反应，酶标仪检测450nm吸光值(OD450nm)；对照板中对于显色值超过1.5的孔则初步认定为将阳性克隆，并通过与之对应的抑制孔，初步验证其特异性；
S7.杂交瘤细胞的克隆化：
显微镜下观察阳性孔内细胞数目，用1mL移液枪轻轻吹打附着在孔壁的细胞，适当吸取400～800μL的细胞培养液转入提前装有2％HT-LGDMEM+15％小牛血清细胞培养基的24孔细胞板，进行扩大培养；利用梯度稀释法对阳性细胞孔进行亚克隆，每2列为一个梯度，铺满96孔板，每孔200μL，CO2培养箱中培养，两天后，注意每天观察96孔亚克隆板与24孔扩培板中的细胞生长状况；当亚克隆板中出现细胞团时，用移液枪轻轻吹打细胞团，再吸取120μL细胞培养液，通过采取间接ELISA与间接竞争ELISA筛选阳性细胞与特异性强的细胞株，步骤同杂交瘤细胞的筛选和阳性克隆的验证。对于阳性非单克隆孔继续进行亚克隆，直至筛选出效价高(高于10000)，且特异性强(IC50≤50ng/mL)的单克隆细胞；每次亚克隆之前都要对筛选到的阳性细胞进行扩培，待培养液变黄后，吸取培养液，验证其效价与特异性，并适时进行分装扩培。对筛选到的高效价且特异性强的单克隆细胞先转至24孔进行扩培，验证其效价与特异性后，再转至细胞培养瓶扩大培养；
S8.杂交瘤细胞的冻存：
待扩大培养的杂交瘤细胞长满培养瓶的80％，且处于对数生长中期，细胞透亮，均匀一致时，于冻存前一日更换全部培养基，并再次通过间接ELISA与间接竞争ELISA验证其效价与特异性。冻存前，将冻存液和冻存管置于4℃预冷2h。用弯头滴管将细胞从瓶壁轻轻吹打下来，收集于10mL离心管中，1000rpm离心8min，弃上清。将沉淀的细胞用预冷的冻存液重悬，调整细胞浓度为106-107个/mL。每管1mL分装至细胞冻存管，标明细胞名称、批次、冻存日期等，于-20℃预冻1h，而后转入-80℃超低温冰箱冷冻过夜，再转入液氮罐保存；
S9.单克隆抗体的大量制备：
取成年Balb/c小鼠，于接种杂交瘤细胞前一周腹腔注射液体石蜡，每只注射0.5mL；一周以后，将准备好的处于对数生长中期的杂交瘤细胞腹腔注射小鼠(每只0.5mL，细胞量为1×106个)。腹水的产生需1-2周，期间密切观察小鼠，若腹部明显胀大，且腹部皮肤有紧张感，即可采集腹水。抽取腹水：用一只手抓取并固定小鼠，绷紧腹部皮肤。另一只手将针头刺入腹腔0.5-1cm。针头刺入时应选择右下腹或左下腹，避开上腹部的重要脏器和腹中线的大血管。在针头刺入前，先确保针的尾部已对准10mL塑料离心管，流出的腹水可直接滴入离心管中。3000rpm离心10min，收集上清液，测定腹水效价和IC50，分装，-20℃冻存备用。
步骤S3中所述免疫过程具体为：所述的Balb/c小鼠为八周±7天的雌性小鼠，免疫原与等体积弗氏完全佐剂充分乳化，100μg/只的剂量对其进行皮下多点注射，接下来每隔一个月±7天进行一次加强免疫，将免疫原与等体积弗氏不完全佐剂充分乳化，进行皮下多点注射，其中第二次免疫注射剂量为85μg/只，第三次免疫注射剂量为60μg/只，从第2次免疫后开始，每次加强免疫的前三天断尾取血，检测抗体效价和特异性。
步骤S5中所述细胞融合具体为：将脾细胞与骨髓瘤细胞混合，离心弃上清液，用50％PEG溶液进行融合，将融合后的细胞加入2％HAT-LGDMEM+20％小牛血清选择性培养基培养。
步骤S6中所述采取间接ELISA与间接竞争ELISA筛选具体为：
用2％HAT-LGDMEM+20％小牛血清选择性培养基培养融合后的细胞，接种到96孔细胞培养板中培养，用间接ELISA与间接竞争ELISA法筛选特异性高的阳性孔，将阳性孔中的细胞用有限稀释法进行克隆筛选，直至获得分泌单一的单克隆抗体的杂交瘤细胞。
步骤S9中所述单克隆抗体大量制备具体为：用液体石蜡0.5mL注射小鼠腹腔，一周后腹腔注射处于对数生长中期的杂交瘤细胞0.5mL，3日后每日观察小鼠的腹部情况，若腹部明显胀大，且腹部皮肤有紧张感，即可采集腹水。
本发明实施例中用到的检测方法有：
小鼠血清效价及特异性测定实验：采用间接ELISA法检测小鼠血清中抗体效价。具体方法如下：
包被：向96孔酶标板中加入包被抗原溶液，包被抗原溶液是将检测抗原用PBS梯度稀释得到的(800、400、200、100ng/mL)，每孔100μL，4℃过夜。
封闭：倾去包被液，用PBST(含0.05％Tween-20的PBS溶液)洗板3次，加入300μL5％脱脂牛奶(溶于PBS)，37℃保湿封闭1h。
加一抗：倾去封闭液，PBST洗板三次。在每孔中先加入100μLPBS缓冲液，然后用1:4000稀释的抗血清从第一孔开始做倍比稀释，浓度依次为1:8000、1:16000、1:32000、1:64000、1:128000、1:2560000(以此类推)倍比稀释，以空白对照孔调零，37℃保湿温育30min。
加二抗：倾去反应液，PBST洗板三次，每孔加入100μL二抗(1:5000稀释的羊抗鼠IgG-HRP)，37℃保湿30min。
显色：倾去反应液，PBST洗板3次，每孔加入TMB底物显色液100μL，37℃保湿避光显色7min。TMB显色液配制方法如下：A液：柠檬酸0.21g，乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)0.036g，用超纯水溶解并定容至60mL，然后加入溶有0.05g3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)的丙酮溶液40mL；B液：乙酸钠0.49g，过氧化脲0.1g，冰乙酸60mL，加超纯水定容至100mL。使用时A、B液等体积混合。
终止：每孔加入终止液(2mol/LH2SO4)50μL溶液终止反应，轻轻摇匀，然后用酶标仪检测每孔在波长450nm下的吸光值(OD450nm)。选OD450nm达到1.0～1.5时抗血清的最大稀释倍数为抗体的效价。通过检测原与烯效唑标准品对血清抗体的竞争实验，以BSA、OVA载体蛋白为对照，得半抑制浓度IC50，同时测定血清抗体与烯效唑类似物的交叉反应率，半抑制浓度越低、与类似物的交叉反应率越低，表明该血清抗体的特异性越强。
单克隆抗体亚型的鉴定方法：
运用购买的北京奥龙免疫技术有限公司的小鼠单抗Ig类/亚类鉴定用酶标二抗套装，对腹水做抗体亚型鉴定。测定过程如下：
(1)包被：检测抗原用PBS稀释到400ng/mL，每孔100uL包被ELISA板，37℃温育2h。
(2)加一抗：甩去包被液，PBST洗涤1次，每孔加入100μLPBST稀释的单抗腹水(1:1000)，每种加16孔，37℃湿盒温育30min。
(3)加酶标物：吸掉样品液，PBST洗板5次，依次加入GoatAnti-MouseIg(G1\G2a\G2b\G3\M\A\K\λ)*HRP八种酶标物，每种加2孔每孔100μl共16孔，37℃保湿30min。
(4)显色：吸去酶标抗体液，用PBST洗板5次，随后每孔加入TMB底物显色液100μL，37℃保湿避光显色5-10min即可判定结果肉眼观察兰色孔即为阳性；参看此孔对应的酶标二抗即可判断此单株的Ig类别。
本发明实施例中动物、细胞株的选择：
Balb/c小鼠(江西医学院动物科学部)；SP2/0骨髓瘤细胞(南京凯基生物科技发展公司)。
本发明实施例中主要仪器的选择：
Nanodrop1000超微量分光光度计(美国Thermo公司)；96孔细胞培养板(美国Costar公司)；酶标仪(Thermo/芬兰Labsystems公司)；细胞培养瓶(美国Costar公司)；超净工作台(美国Thermo公司)；CO2恒温培养箱(美国SL公司)；倒置光学显微镜(LEITZ)；CD-196/HC超低温冰箱(美国thermo)；96孔酶标板(深圳金灿华公司)；TGL-16G离心机(上海安亭科学仪器公司)。
本发明实施例中主要试剂的选择或配制方法
烯效唑、牛血清蛋白、卵清蛋白(Sigma公司)；琥珀酸酐、N-羟基琥珀酰亚胺、碳酰二亚胺(上海百灵威公司)；羊抗鼠IgG-HRP(GeneTex公司)。
10×PBS(0.1M，pH7.4)：NaCl80g，KH2PO42g，Na2HPO4·12H2O29g，KCl2g，蒸馏水定容至1000mL；
1×PBS(10×PBS稀释十倍配制)；
PBST：1×PBS1L，Tween-200.5mL，混匀后使用(现配现用)；
终止液(2mol/LH2SO4)：取20mL浓硫酸(质量分数为98％)，加入160mL蒸馏水中；
TMB显色液：A液：柠檬酸0.21g，乙二胺四乙酸二钠0.036g，超纯水定容至60mL，然后加入溶有0.05gTMB的丙酮溶液40mL；B液：乙酸钠0.49g，过氧化脲0.1g，冰乙酸60mL，加蒸馏水定容至100mL。使用时A、B液等体积混合。
8-氮鸟嘌呤培养液：1mL8-氮鸟嘌呤，49mLDMEM
DMEM培养基：2L超纯水，DMEM-F1213.5g，DMEM-高糖13.5g，碳酸氢钠3.6g，双抗20mL，20％小牛血清，调pH至7.2-7.4，过滤除菌，分装4℃保存。
2％HAT-LGDMEM+20％小牛血清细胞培养基：2L超纯水，DMEM-F1213.5g，DMEM-高糖13.5g，碳酸氢钠3.6g，双抗20mL，20％小牛血清，2％HAT。
2％HAT-LGDMEM+15％小牛血清细胞培养基：2L超纯水，DMEM-F1213.5g，DMEM-高糖13.5g，碳酸氢钠3.6g，双抗20mL，15％小牛血清，2％HAT。
2％HT-LGDMEM+15％小牛血清细胞培养基：2L超纯水，DMEM-F1213.5g，DMEM-高糖13.5g，碳酸氢钠3.6g，双抗20mL，15％小牛血清，2％HT。
结果分析：
1、杂交瘤细胞的筛选与克隆
采用间接竞争ELISA挑选具有较强特异性的阳性克隆，阳性杂交瘤细胞经有限稀释法进行亚克隆以后，取孔内只长有一个克隆的细胞上清液进行测定，最终筛选到18株能稳定分泌强特异性的单克隆抗体的细胞株。
2、腹水的获取
将扩大培养的杂交瘤细胞接种于Balb/c小鼠腹腔，生产抗烯效唑单克隆抗体腹水，接种后第四天，小鼠腹腔明显胀大，收集腹水并进行鉴定。综合腹水产率、效价、IC50、以及交叉反应率等因素的考虑，最终选定的细胞株为1B11-G11-D10-C11-A7。
3、腹水效价的测定
采用间接ELISA测定腹水效价，1B11-G11-D10-C11-A7细胞株所产腹水效价测定结果如表1所示。当包被浓度为400ng/mL时，腹水效价为1:128000。
表1腹水效价的测定
Figure BDA0002635876010000131
4、腹水IC50的测定
以3得到的腹水工作浓度的两倍稀释腹水，采用间接竞争ELISA测定腹水的IC50，以烯效唑浓度的对数为横坐标，结合率为纵坐标绘制竞争抑制曲线，见附图2。分析结果可知，腹水的IC50为11.26ng/mL。
5、基于单克隆抗体的间接竞争ELISA方法加标回收率的测定
准确称取粉碎或匀浆好的10g左右的食品样品(大豆和脐橙)于50mL离心管中，添加一定量的烯效唑标准溶液，使加标水平分别为0.005、0.01、0.05、0.1mg/kg，加入20mL乙腈，于迷你振荡器上振荡2min。再加入5g无水MgSO4，振荡2min，以4000r/min离心15min。将其上清液转移至浓缩瓶中，氮气吹至近干。残留物加入1mL甲醇，振荡溶解，取100μL用PBS稀释成10％CH3OH-PBS溶液进行间接竞争ELISA测定，计算加标回收率。结果表明大豆、脐橙样品加标回收率分别为86.0-114.7％、86.6-100.5％，RSD为0.9％～13.4％(n＝3)，表明所建立的方法能够满足实际样品快速分析要求。
6、抗烯效唑单克隆抗体的鉴定
用单抗亚型鉴定酶即用装测定腹水，确定抗体的亚型为IgG2b，轻链类型为IgK。
根据以上分析结果可知，按照本发明方法能够成功制备抗烯效唑单克隆抗体，抗体特异性好，灵敏度高，可保证无限量供应。基于该单克隆抗体建立的间接竞争ELISA方法IC50为11.26ng/mL，当加标水平在0.005-0.1mg/kg范围内，实际样品的加标回收率为86.0-1147％，能够满足GB2763-2019《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》规定的烯效唑残留限量(0.05mg/kg)的测定要求。该方法具有快速、廉价、简便、灵敏、特异的优点，可便携进行现场监测，克服了传统检测方法的缺点。且单抗可望进一步应用到免疫传感器、胶体金免疫层试纸条等技术的构建，具有广阔的应用前景。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解，依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，而未脱离本发明精神和范围的任何修改或者等同替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (6)

1.一种烯效唑单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.合成半抗原：在1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯的催化作用下，以无水吡啶为溶剂，烯效唑和琥珀酸酐发生酰化反应，引入活性基团羧基和连接臂，得到半抗原烯效唑半琥珀酸酯；
S2.合成免疫全抗原和检测全抗原：采用碳二亚胺法将烯效唑半琥珀酸酯分别与牛血清蛋白BSA和卵清蛋白OVA进行偶联，得到免疫全抗原和检测全抗原；
S3.免疫：用上述免疫全抗原免疫小鼠，第一次免疫采用弗氏完全试剂与免疫全抗原充分乳化，腹部皮下多点注射，之后每隔4周加强免疫一次，加强免疫采用弗氏不完全试剂佐剂与抗原充分乳化，最后一次加强免疫通过腹腔注射40 µg不加佐剂的抗原；
S4.筛选：测定小鼠血清效价和其特异性；
S5.细胞融合：选择血清效价和特异性最优的小鼠取脾细胞与骨髓瘤细胞体外融合；
S6.杂交瘤细胞的筛选和阳性克隆的验证：
选择性培养基筛选融合细胞，检测筛选阳性细胞，克隆化培养，进一步克隆筛选阳性细胞，阳性克隆扩培与冻存；
每天观察杂交瘤细胞生长情况，约第十天，待杂交瘤细胞长至超过孔底面积的10%时，吸出120 µL细胞培养液，进行抗体检测筛选，并用新的2% HAT - LG DMEM + 15%小牛血清细胞培养基补足每孔200 µL；
采取间接ELISA与间接竞争ELISA筛选；
采用棋盘法，测定阳性血清的效价与半抑制浓度，选定筛选阳性克隆的包被浓度与标准品浓度；
S7.杂交瘤细胞的克隆化：
显微镜下观察阳性孔内细胞数目，用移液枪轻轻吹打附着在孔壁的细胞，吸取的细胞培养液转入提前装有小牛血清细胞培养基的孔细胞板，进行扩大培养；利用梯度稀释法对阳性细胞孔进行亚克隆，两天后，当亚克隆板中出现细胞团时，用移液枪轻轻吹打细胞团，再吸取细胞培养液，通过采取间接ELISA与间接竞争ELISA筛选阳性细胞与特异性强的细胞株，步骤同杂交瘤细胞的筛选和阳性克隆的验证；对于阳性非单克隆孔继续进行亚克隆，直至筛选出效价高，且特异性强的单克隆细胞；每次亚克隆之前都要对筛选到的阳性细胞进行扩培，待培养液变黄后，吸取培养液，验证其效价与特异性，并适时进行分装扩培；对筛选到的高效价且特异性强的单克隆细胞先转至24孔进行扩培，验证其效价与特异性后，再转至细胞培养瓶扩大培养；
S8.杂交瘤细胞的冻存：
待扩大培养的杂交瘤细胞长满培养瓶的80%，且处于对数生长中期，细胞透亮，均匀一致时，于冻存前一日更换全部培养基，并再次通过间接ELISA与间接竞争ELISA验证其效价与特异性；冻存前，将冻存液和冻存管置于4 ℃预冷2 h；用弯头滴管将细胞从瓶壁轻轻吹打下来，收集于10 mL离心管中，1000 rpm 离心8 min，弃上清；将沉淀的细胞用预冷的冻存液重悬，调整细胞浓度为106 - 107 个/mL；每管1 mL分装至细胞冻存管，标明细胞名称、批次、冻存日期等，于-20 ℃预冻1 h，而后转入-80 ℃超低温冰箱冷冻过夜，再转入液氮罐保存；
S9.单克隆抗体的大量制备：
取成年Balb/c 小鼠，于接种杂交瘤细胞前一周腹腔注射液体石蜡，每只注射0.5 mL；一周以后，将准备好的处于对数生长中期的杂交瘤细胞腹腔注射小鼠；腹水的产生需1-2周，期间密切观察小鼠，若腹部明显胀大，且腹部皮肤有紧张感，即可采集腹水；抽取腹水：测定腹水效价和 IC50，分装，-20 ℃冻存备用。
2.根据权利要求1所述的一种烯效唑单克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤S3中所述免疫过程具体为：从免疫全抗原免疫小鼠中选取八周±7天的雌性小鼠，免疫原与等体积弗氏完全佐剂充分乳化，100 µg/只的剂量对其进行皮下多点注射，接下来每隔一个月±7天进行一次加强免疫，将免疫原与等体积弗氏不完全佐剂充分乳化，进行皮下多点注射，其中第二次免疫注射剂量为85 µg/只，第三次免疫注射剂量为60 µg/只，从第2次免疫后开始，每次加强免疫的前三天断尾取血，检测抗体效价和特异性。
3.根据权利要求1所述的一种烯效唑单克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤S5中所述细胞融合具体为：将脾细胞与骨髓瘤细胞混合，离心弃上清液，用50% PEG溶液进行融合，将融合后的细胞加入2% HAT - LG DMEM + 20%小牛血清选择性培养基培养。
4.根据权利要求1所述的一种烯效唑单克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤S6中所述采取间接ELISA与间接竞争ELISA筛选具体为：
用2% HAT - LG DMEM + 20%小牛血清选择性培养基培养融合后的细胞，接种到96孔细胞培养板中培养，用间接ELISA与间接竞争ELISA法筛选特异性高的阳性孔，将阳性孔中的细胞用有限稀释法进行克隆筛选，直至获得分泌单一的单克隆抗体的杂交瘤细胞。
5.根据权利要求1所述的一种烯效唑单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤S5中的所述细胞融合，包括如下步骤：
S51.骨髓瘤细胞的复苏：
细胞融合前十天，复苏骨髓瘤细胞：迅速放至37 ℃的温水中，不停地摇动至培养基完全解冻；用2~3 mL 8-氮鸟嘌呤培养液吹打细胞，加入装有7 mL 8-氮鸟嘌呤培养液的培养瓶中培养优化，使之缺失HGPRT酶，便于后期HAT筛选杂交瘤细胞，置37 ℃的5% CO2培养箱培养，培养7天后将培养液换为DMEM培养基；
S52.骨髓瘤细胞的准备：
于融合前36 h扩大培养骨髓瘤细胞SP2/0：融合当天，用弯头滴管将骨髓瘤细胞从瓶壁轻轻吹下，收集于50 mL离心管或融合管内，用DMEM定容至30 mL，1000 rpm离心7 min，弃去上清液；轻轻吹打细胞，将骨髓瘤细胞重悬浮于10 mL DMEM培养基中，在显微镜下观察，细胞存活率达到90%则可用于细胞融合；
S53.饲养细胞的准备：
用20～25克Balb/c小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，小鼠在水温中游泳30 min后拉颈处死，放入装有0.1%新洁尔灭的生理盐水溶液中浸没，轻轻摇晃两分钟，至老鼠毛发顺遂无气泡，用蒸馏水着重清洗老鼠尾部，腹部，以及头部，再放入75%乙醇中浸泡片刻，放入超净工作台；准备二支10 mL离心管加入10 mL DMEM培养基，用镊子提起小鼠腹部皮肤，剪一小口，然后用弯头滴管通过小口向腹腔内注入4 mL培养液，小心在腹腔内吹打，最后吸出培养液于离心管中；
反复2～3次；1000 rpm离心7 min，弃上清液；配置80 mL 2% HAT - LG DMEM + 20%小牛血清细胞培养基，用5 mL培养基将巨噬细胞沉淀重悬，观察细胞形态与数目，细胞密度为2 × 105个/mL适宜，将上述巨噬细胞悬液加入所配置的培养基中，混合均匀，铺于8块96孔细胞培养板中，每孔100 μL，置37 ℃ 5% CO2的培养箱中培养；
S54.免疫脾细胞悬液的制备：
取经最后一次用40 µg免疫抗原，不加佐剂腹腔注射加强免疫三天后的Balb/c小鼠，摘除眼球采血，眼球血4 ℃静置5 min后，5000 r/min 离心10 min，分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清；通过颈脱位处死小鼠，浸泡于75%酒精中5 min，置灭菌平皿中，剪开左侧腹部皮肤，即可见到脾脏，更换灭菌眼科剪镊，在超净台中用无菌手术剪剪开腹膜，取出脾脏置于盛有10 mL DMEM培养基的平皿中，轻轻洗涤3次，并小心剥去脾脏周围的结缔组织；将脾脏移入另一盛有10 mL DMEM培养基的平皿中，用医用剪刀将脾脏剪成3 - 4小段，再用经灭菌消毒的研磨棒，轻压脾脏至近白色，制成细胞悬液；用200目不锈钢网过滤除去脾细胞悬液中的大团块，收集脾细胞悬液，1000 rpm离心7 min，弃上清液，然后将脾细胞重悬于10 mL DMEM培养基，显微镜下观察细胞形态与数目；
S55.细胞融合：
将准备的骨髓瘤细胞SP2/0加入到免疫脾细胞悬浮液中，补加DMEM培养基至30 mL，充分混匀；800 rpm离心7 min，将上清液快速倒净；在离心完成前，应于超净工作台内准备好37 ℃水浴，并将PEG和DMEM培养液预温至37 ℃；在手掌上轻击融合管底部，使沉淀细胞松散均匀，置37 ℃水浴中预热；用1 mL弯头滴管在1 min内滴加1 mL预热至37 ℃的pH=8.0的50% PEG，边加边轻轻摇动混匀；用1 mL弯头滴管在5 min内加10 mL预热至37 ℃的DMEM培养基，具体滴加方法：第1 min: 1 mL；第2 min: 1 mL；第3 min: 1.5 mL；第4 min: 1.5mL；第5 min: 加完剩下的5 mL DMEM，最后补加DMEM至30 mL，室温静置10 min；800 rpm离心5min，弃上清；加入5 mL 2% HAT - LG DMEM + 20%小牛血清细胞培养基，轻轻吹打沉淀细胞，使其悬浮并混匀，然后补加2% HAT - LG DMEM + 20%小牛血清细胞培养基至80 mL；分装至融合前一天培养的含有饲养细胞的96孔细胞培养板，每孔100 μL；置37 ℃ 5% CO2培养箱内培养；培养至第5天，用2% HAT - LG DMEM + 20%小牛血清细胞培养基换半液；培养至第7天，用2% HAT - LG DMEM + 20%小牛血清细胞培养基换出孔内全部培养液。
6.根据权利要求1所述的一种烯效唑单克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤S9中所述单克隆抗体大量制备具体为：用液体石蜡0.5 mL注射小鼠腹腔，一周后腹腔注射处于对数生长中期的杂交瘤细胞0.5 mL，3日后每日观察小鼠的腹部情况，若腹部明显胀大，且腹部皮肤有紧张感，即可采集腹水。
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CN104356237A (zh) * 2014-10-31 2015-02-18 南昌大学 一种多效唑单克隆抗体的制备方法

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CN104356237A (zh) * 2014-10-31 2015-02-18 南昌大学 一种多效唑单克隆抗体的制备方法

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欧阳秋丽等: "烯效唑人工抗原的制备及其免疫原性鉴定", 《南昌大学学报(理科版)》 *

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