CN112007029A - 二甲基小檗胺类化合物在抑制SARS-CoV-2中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及通式I所示的化合物、其几何异构体或其药学上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物在制备用于预防和/或治疗与冠状病毒特别是SARS‑Cov‑2有关的肺部疾病或症状，或无症状或有症状的SARS‑CoV‑2感染的产品中用途，

Description

二甲基小檗胺类化合物在抑制SARS-CoV-2中的用途

技术领域

本发明属于化学药物领域，具体涉及下面式I所示二甲基小檗胺类化合物，其几何异构体或其药学上可接受的盐和/或两者溶剂化物和/或两者水合物，及含上述化合物的药物组合物，用于治疗SARS-CoV-2感染方面的用途。

背景技术

式I所示二甲基小檗胺类化合物，化学名称为6,6',7,12-四甲氧基-2,2'-二甲基小檗胺，是从防己科植物粉防己(Stephania tetrandra)中提取的双苄基异喹啉类生物碱。式(I)化合物又称汉防己甲素(Tetrandrine)，别名粉防己碱、汉防己碱，为抗高血压药，临床上主要用于治疗轻、中度高血压，亦可用于高血压危象。此外，也可用于风湿痛、关节痛、神经痛。与小剂量放射合并用于肺癌；亦用于单纯硅肺I、II、III期及各期煤硅肺。

冠状病毒(Coronavirus)是有包膜的不分节段的单股正链RNA病毒，具有广泛的动物宿主。来源于动物传染病的SARS冠状病毒和MERS冠状病毒可引起人类的死亡，并分别在2002年和2012年爆发(Zaki et al.,2012；Zhong et al.,2003；Cui et al.,2019)。2019新型冠状病毒(2019-nCoV)是以前从未在人类中发现的冠状病毒新毒株。2020年2月11日，国际病毒分类委员会(ICTV)宣布，2019新型冠状病毒(2019-nCoV)的正式分类名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)。同日，世界卫生组织(WHO)宣布，由这一病毒导致的疾病的正式名称为COVID-19。COVID-19患者的临床表现为，90％以上的患者表现为发热，80％的患者表现为干咳，20％的患者表现为呼吸急促，15％的患者表现为呼吸困难，而最重要的表现是白细胞和淋巴细胞的减少，患者肺部均有不同程度的器官损伤，具有发展成为肺纤维化的潜在风险。该病毒具有很强的传染性，全球范围内的多个国家，包括日本、韩国、意大利和美国等，都出现了SARS-CoV-2感染事件，并有不断扩大的趋势。前期的研究发现，瑞德西韦(remdesivir)和磷酸氯喹(chloroquine)等药物可以很好的抑制SARS-CoV-2病毒的复制(Wang et al.,2020)，也已经在临床上开展了相关研究，相关的疫苗也加紧进行研制。然而，目前尚无一种药物或疫苗获得批准广泛应用。

因此，研发能够有效抑制SARS-CoV-2的产品仍是十分紧迫和必要的。

发明内容

本发明人在研究中发现汉防己甲素能够有效抑制SARS-CoV-2病毒，预防或治疗肺纤维化，从而为有效预防和/或治疗SARS-CoV-2病毒引发的肺部疾病或症状提供了新的途径和选择。本发明基于以上研究现已完成。

本发明第一方面涉及用于预防和/或治疗与SARS-CoV-2有关的肺部疾病或症状或无症状或有症状的SARS-CoV-2感染的通式I所示的化合物，其几何异构体或其药学上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物，或含有通式I所示的化合物，其几何异构体或其药学上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物的药物组合物，

本发明第二方面涉及用于预防和/或治疗与SARS-CoV-2有关且伴有高血压的肺部疾病或症状或伴有高血压的无症状或有症状的SARS-CoV-2感染的通式I所示的化合物，其几何异构体或其药学上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物，或含有通式I所示的化合物，其几何异构体或其药学上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物的药物组合物，

本发明第三方面涉及用于预防和/或治疗COVID-19或伴有高血压的COVID-19，或作为SARS-CoV-2抑制剂，或用于抑制SARS-CoV-2在细胞(例如哺乳动物细胞)中复制或繁殖的通式I所示的化合物，其几何异构体或其药学上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物，或含有通式I所示的化合物，其几何异构体或其药学上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物的药物组合物，

本发明进一步涉及用于预防和/或治疗冠状病毒引起的疾病或感染的通式I所示的化合物，其几何异构体或其药学上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物，或含有通式I所示的化合物，其几何异构体或其药学上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物的药物组合物。

本发明进一步涉及用于预防和/或治疗冠状病毒引起的并伴有高血压的疾病或感染的通式I所示的化合物，其几何异构体或其药学上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物，或含有通式I所示的化合物，其几何异构体或其药学上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物的药物组合物。

本发明进一步涉及通式I所示的化合物，其几何异构体或其药学上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物，或含有通式I所示的化合物，其几何异构体或其药学上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物的药物组合物，其用于预防和/或治疗冠状病毒引起的疾病或感染或冠状病毒引起的并伴有高血压的疾病或感染。

本发明进一步涉及通式I所示的化合物，其几何异构体或其药学上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物，或含有通式I所示的化合物，其几何异构体或其药学上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物的药物组合物，其用于预防和/或治疗与冠状病毒有关且伴有高血压的肺部疾病或症状。

本发明进一步涉及通式I所示的化合物，其几何异构体或其药学上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物，或含有通式I所示的化合物，其几何异构体或其药学上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物的药物组合物，其用于抑制冠状病毒在细胞(例如哺乳动物细胞)中复制或繁殖。

本发明进一步涉及通式I所示的化合物，其几何异构体或其药学上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物，或含有通式I所示的化合物，其几何异构体或其药学上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物的药物组合物，其作为冠状病毒抑制剂。

本发明进一步涉及通式I所示的化合物，其几何异构体或其药学上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物，或含有通式I所示的化合物，其几何异构体或其药学上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物的药物组合物在制备用于预防和/或治疗冠状病毒引起的疾病或感染的产品中用途。

本发明进一步涉及通式I所示的化合物，其几何异构体或其药学上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物，或含有通式I所示的化合物，其几何异构体或其药学上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物的药物组合物在制备用于预防和/或治疗冠状病毒引起的并伴有高血压的疾病或感染的产品中用途。

本发明进一步涉及通式I所示的化合物，其几何异构体或其药学上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物，或含有通式I所示的化合物，其几何异构体或其药学上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物的药物组合物在制备用于预防和/或治疗与冠状病毒有关且伴有高血压的肺部疾病或症状的产品中用途。

本发明进一步涉及通式I所示的化合物，其几何异构体或其药学上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物，或含有通式I所示的化合物，其几何异构体或其药学上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物的药物组合物在制备用于抑制冠状病毒在细胞(例如哺乳动物细胞)中复制或繁殖的产品中的用途。

本发明进一步涉及通式I所示的化合物，其几何异构体或其药学上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物，或含有通式I所示的化合物，其几何异构体或其药学上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物的药物组合物在制备作为冠状病毒抑制剂的产品中的用途。

本发明进一步涉及通式I所示的化合物，其几何异构体或其药学上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物，或含有通式I所示的化合物，其几何异构体或其药学上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物的药物组合物在制备用于预防和/或治疗与SARS-CoV-2有关的肺部疾病或症状，或无症状或有症状的SARS-CoV-2感染的产品中用途。

本发明还涉及通式I所示的化合物，其几何异构体或其药学上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物，或含有通式I所示的化合物，其几何异构体或其药学上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物的药物组合物在制备用于预防和/或治疗与SARS-CoV-2有关且伴有高血压的肺部疾病或症状，或伴有高血压的无症状或有症状的SARS-CoV-2感染的产品中用途。

本发明还涉及通式I所示的化合物，其几何异构体或其药学上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物，或含有通式I所示的化合物，其几何异构体或其药学上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物的药物组合物在制备用于预防和/或治疗COVID-19或伴有高血压的COVID-19的产品中的用途，或在制备作为SARS-CoV-2抑制剂的产品中的用途，或在制备用于抑制SARS-CoV-2在细胞(例如哺乳动物细胞)中复制或繁殖的产品中的用途。

本发明进一步涉及预防和/或治疗冠状病毒引起的疾病或感染或冠状病毒引起的并伴有高血压的疾病或感染的方法，其包括给有需要的宿主施用将预防和/或有效量的通式I所示的化合物，其几何异构体或其药学上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物，或含有通式I所示的化合物，其几何异构体或其药学上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物的药物组合物。

本发明进一步涉及预防和/或治疗与冠状病毒有关的肺部疾病或症状或与冠状病毒有关且伴有高血压的肺部疾病或症状的方法，其包括给有需要的宿主施用将预防和/或有效量的通式I所示的化合物，其几何异构体或其药学上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物，或含有通式I所示的化合物，其几何异构体或其药学上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物的药物组合物。

本发明进一步涉及在有需要的宿主中抑制冠状病毒复制或繁殖的方法，其包括给有需要的宿主施用将预防和/或有效量的通式I所示的化合物，其几何异构体或其药学上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物，或含有通式I所示的化合物，其几何异构体或其药学上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物的药物组合物。

本发明还涉及预防和/或治疗与SARS-CoV-2有关的肺部疾病或症状或无症状或有症状的SARS-CoV-2感染的方法，其包括将预防和/或有效量的通式I所示的化合物，其几何异构体或其药学上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物，或含有通式I所示的化合物，其几何异构体或其药学上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物的药物组合物给予与患有SARS-CoV-2有关的肺部疾病或症状或患有无症状或有症状的SARS-CoV-2感染的宿主。

本发明还涉及预防和/或治疗与SARS-CoV-2有关且伴有高血压的肺部疾病或症状或伴有高血压的无症状或有症状的SARS-CoV-2感染的方法，其包括将预防和/或有效量的通式I所示的化合物，其几何异构体或其药学上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物，或含有通式I所示的化合物，其几何异构体或其药学上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物的药物组合物给予与SARS-CoV-2有关且患有高血压的肺部疾病或症状或患有高血压的无症状或有症状的SARS-CoV-2感染的宿主。

本发明还涉及在有需要的宿主中治疗和/或预防COVID-19或伴有高血压的COVID-19的方法或者在有需要的宿主中抑制SARS-CoV-2复制或繁殖的方法，该方法包括给有需要的宿主施用治疗和/或预防有效量的通式I所示的化合物，其几何异构体或其药学上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物，或含有通式I所示的化合物，其几何异构体或其药学上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物的药物组合物。

在某些实施方案中，本发明所述冠状病毒为SARS-CoV-2。

在某些实施方案中，本发明所述的冠状病毒引起的疾病为COVID-19。

在某些实施方案中，本发明所述的冠状病毒引起的并伴有高血压的疾病为伴有高血压的COVID-19。

在某些实施方案中，本发明所述的与冠状病毒有关的肺部疾病或症状为SARS-CoV-2有关的肺部疾病或症状。

在某些实施方案中，本发明所述与冠状病毒有关且伴有高血压的肺部疾病或症状为SARS-CoV-2有关且伴有高血压的肺部疾病或症状。

在某些实施方案中，本发明所述的冠状病毒引起的感染为无症状或有症状的SARS-CoV-2感染。

在某些实施方案中，本发明所述的冠状病毒引起的并伴有高血压的感染为伴有高血压的无症状或有症状的SARS-CoV-2感染。

在某些实施方案中，本发明所述产品为人用药品或动物用兽药。

在某些实施方案中，本发明所述产品为固体制剂、注射剂、喷剂、液体制剂、吸入制剂或复方制剂。

在某些实施方案中，本发明所述宿主为哺乳动物。

在某些实施方案中，本发明所述哺乳动物包括牛科动物、马科动物、羊科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物、灵长类动物，其中优选的哺乳动物是人，狗或猪。

在某些实施方案中，本发明所述COVID-19是由SARS-CoV-2导致的疾病。

在某些实施方案中，本发明所述的药物组合物还包含药学上可接受的载体或辅料。具体地，所述药物组合物可以为固体制剂、注射剂、吸入制剂、喷剂、液体制剂、或复方制剂。

本申请所述药物组合物可以根据不同给药途径而制备成各种形式，例如口服片剂，胶囊，粉剂，口服液，注射剂和透皮制剂。根据常规的药物上的惯例，药学上可接受的载体包括稀释剂、填充剂、崩解剂、润湿剂、润滑剂、着色剂、调味剂或其它常规添加剂。典型的药学上可接受的载体包括例如微晶纤维素、淀粉、交连聚维酮、聚维酮、聚乙烯吡咯烷酮、麦芽糖醇，柠檬酸，十二烷基磺酸钠或硬脂酸镁等。

根据申请，所述的药物组合物可以以下面的任意方式施用：口服、喷雾吸入、直肠用药、鼻腔用药、颊部用药、阴道用药、局部用药、非肠道用药如皮下、静脉、肌内、腹膜内、鞘内、心室内、胸骨内和颅内注射或输入、或借助一种外植储器用药。其中优选口服、腹膜内或静脉内用药方式。

当口服用药时，所述通式I所示的化合物或其几何异构体、其药物上可接受的盐、其溶剂化物和/或其水合物可制成任意口服可接受的制剂形式，包括但不限于片剂、胶囊、水溶液或水悬浮液。其中，片剂一般使用的载体包括乳糖和玉米淀粉，另外也可加入润滑剂如硬质酸镁。胶囊制剂一般使用的稀释剂包括乳糖和干燥玉米淀粉。水悬浮液制剂则通常是将活性成分与适宜的乳化剂和悬浮剂混合使用。如果需要，以上口服制剂形式中还可加入一些甜味剂、芳香剂或着色剂。

当直肠用药时，所述通式I所示的化合物或其几何异构体、其药物上可接受的盐、其溶剂化物和/或其水合物一般可制成栓剂的形式，其通过将药物与一种适宜的非刺激性赋形剂混合而制得。该赋形剂在室温下呈现固体状态，而在直肠温度下熔化释出药物。该类赋形剂包括可可脂、蜂蜡和聚乙二醇。

当局部用药时，特别是治疗局部外敷容易达到的患面或器官，如眼睛、皮肤或下肠道神经性疾病时，所述通式I所示的化合物或其几何异构体、其药物上可接受的盐、其溶剂化物和/或其水合物可根据不同的患面或器官制成不同的局部用药制剂形式，具体说明如下：

当眼部局部施用时，所述通式I所示的化合物或其几何异构体、其药物上可接受的盐、其溶剂化物和/或其水合物可配制成一种微粉化悬浮液或溶液的制剂形式，所使用载体为等渗的一定pH的无菌盐水，其中可加入也可不加防腐剂如氯化苄基烷醇盐。此外对于眼用，也可将化合物制成膏剂形式如凡士林膏。

当皮肤局部施用时，所述通式I所示的化合物或其几何异构体、其药物上可接受的盐、其溶剂化物和/或其水合物可制成适当的软膏、洗剂或霜剂制剂形式，其中活性成分悬浮或溶解于一种或多种载体中。这里软膏即可使用的载体包括但不限于：矿物油、液体凡士林、白凡士林、丙二醇、聚氧化乙烯、聚氧化丙烯、乳化蜡和水；洗剂或霜剂可使用的载体包括但不限于：矿物油、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、吐温60、十六烷酯蜡、十六碳烯芳醇、2-辛基十二烷醇、苄醇和水。

当下肠道局部施用时，所述通式I所示的化合物或其几何异构体、其药物上可接受的盐、其溶剂化物和/或其水合物可制成如上所述的直肠栓剂制剂或适宜的灌肠制剂形式，另外也可使用局部透皮贴剂。

所述通式I所示的化合物或其几何异构体、其药物上可接受的盐、其溶剂化物和/或其水合物还可以无菌注射制剂形式用药，包括无菌注射水或油悬浮液，或无菌注射溶液。其中，可使用的载体和溶剂包括水，林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，灭菌的非挥发油也可用作溶剂或悬浮介质，如单甘油酯或二甘油酯。

上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

如本文所述的，“治疗有效量”或“预防有效量”是指在合理的医学判断范围内，足以治疗或预防患者疾病但足够低地避免严重副作用(在合理的利益/风险比)的量。化合物的治疗有效量将根据所选择的具体化合物(例如考虑化合物的效力、有效性和半衰期)、所选择的给药途径、所治疗的疾病、所治疗的疾病的严重性、所治疗的患者的年龄、大小、体重和身体疾病、所治疗的患者的医疗史、治疗持续时间、并行疗法的性质、所需的治疗效果等因素发生变化，但仍可以由本领域技术人员常规确定。

另外需要指出，所述通式I所示的化合物或其几何异构体、其药物上可接受的盐、其溶剂化物和/或其水合物针对不同患者的特定使用剂量和使用方法决定于诸多因素，包括患者的年龄，体重，性别，自然健康状况，营养状况，药物的活性强度，服用时间，代谢速率，病症的严重程度以及诊治医师的主观判断。这里优选使用剂量介于0.001-1000mg/kg体重/天。

附图说明

图1为实施例1中，汉防己甲素、瑞得西韦和磷酸氯喹抑制SARS-CoV-2的量效曲线，其中蓝色点代表药物在不同浓度下的细胞毒性百分率；红色曲线为药物在不同浓度下抑制病毒产量百分率，上图病毒感染复数MOI＝0.01；下图病毒感染复数为MOI＝0.05。

图2为实施例2中，汉防己甲素、瑞得西韦和磷酸氯喹抑制SARS-CoV-2的量效曲线，其中蓝色点代表药物在不同浓度下的细胞毒性百分率；红色曲线为药物在不同浓度下抑制病毒产量百分率，上图病毒感染复数MOI＝0.01；下图病毒感染复数为MOI＝0.05。

图3为汉防己甲素在Vero细胞上抑制SARS-CoV-2病毒感染的定量RT-PCR检测结果。

具体实施方式

下面结合本发明的具体实施例来进一步说明本发明的实质性内容，应理解，以下实施例仅用于说明本发明，但并不以此来限定本发明的保护范围。下面实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的进行。所用药品或试剂未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

虽然以下实施例中所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，如果未特别说明，下面实施例中所用的材料和操作方法是本领域公知的。

实施例1汉防己甲素对SARS-CoV-2的药效学研究1

1.材料和方法

1.1药物：汉防己甲素来源于浙江金华康恩贝制药有限公司，批号YG1910005，含量为99.3％。对照药品磷酸氯喹购置于Sigma公司，货号C6628；瑞得西韦购自MedChemExpresss公司，货号HY-104077。汉防己甲素用DMSO配成10mM母液，瑞得西韦用DMSO配成100mM母液，磷酸氯喹用PBS配成100mM母液。实验时用含2％胎牛血清的MEM培养液稀释成实验所需的浓度。

1.2细胞：Vero-E6细胞，购自ATCC，货号1586。

1.3病毒：SARS-CoV-2病毒(nCoV-2019BetaCoV/Wuhan/WIV04/2019分离株，GISAID登录号EPI_ISL_402124)由中国科学院武汉病毒研究所分离传代培养。实验时，用含2％胎牛血清的MEM培养液将病毒稀释至实验所需浓度。

1.4.试剂、实验用品及仪器：

1.4.1试剂：MEM干粉，购自美国GIBCO公司，货号10370021；胎牛血清(FBS)，购自美国GIBCO公司，货号16000044；碳酸氢钠，购自国药集团；青霉素、链霉素和卡那霉素：均购自华北制药厂；PBS购自Gibco公司，货号C10010500BT。

1.4.2实验用品及仪器：培养瓶，购自美国Corning公司；培养板96孔板，购自美国Corning公司；二氧化碳孵箱，购自美国Thermo公司；

1.4.3细胞培养液及试剂配制：

细胞培养液为：MEM培养液，每100ml含胎牛血清10％，青霉素，链霉素和卡那霉素各100U/ml，NaHCO₃ 5％。

细胞消化液：0.25％胰酶，用Hanks液配制，0.02％EDTA。

1.5.实验方法：

1.5.1 Vero E6细胞培养：在长满细胞的培养瓶内加0.25％胰酶0.1ml，0.02％EDTA 5ml，37℃消化5分钟，废弃消化液，加细胞培养液吹打，1:3传代，3天长满，配制成每毫升10万个细胞，接种96孔细胞培养板，每孔0.1ml，37℃，5％CO₂培养24小时，细胞长成单层后进行实验。

1.5.2药物对细胞毒性实验：

药物对细胞毒性的检测利用CellTiter-Glo试剂盒(Promega)测定。具体步骤如下：

①96孔板中接种1×10⁴个Vero-E6细胞，37℃培养8小时。

②将药物的母液用含2％FBS的MEM培养液稀释到所需浓度，弃96孔板中原培养液，取100μL含药物的MEM培养液加入到对应的孔中，使孔中药物最终浓度分别如表1至表3中所示，每个浓度做三个复孔。同时设置阴性对照(细胞孔中加DMSO或PBS，和含2％FBS的MEM培养液，而不加药物)和空白对照(不含细胞，加DMSO和含2％FBS的MEM培养液)。加药完毕，将细胞置于37℃培养24小时。

③向待测孔中加入100μL CellTiter-Glo溶液(Promega)，震荡混匀2min使细胞充分裂解，室温孵育10min后，在酶标仪(购自Molecular Devices公司，型号SpectraMax M5)上读取化学发光信号OD450，将读数带入以下公式，计算细胞活性：

细胞活性(％)＝(A_{(药物处理组)}-A_{(空白对照)})/(A_{(阴性对照)}-A_{(空白对照)})×100％

其中A为酶标仪读数。

1.5.3抗病毒实验：

①药物处理

将Vero E6细胞接种到48孔板中，每孔约1×10⁵个细胞，待第二天实验。先将100μL含相应浓度药物的MEM培养液(含有2％FBS)加入细胞板中，预处理细胞1小时，然后加入20μL稀释的病毒(病毒量为1000TCID₅₀,即MOI＝0.01，以及病毒量为5000TCID₅₀,即MOI＝0.05)，置于培养箱孵育1小时。然后弃病毒培养液，用PBS洗去未感染的残留病毒，再加入含相应浓度的汉防己甲素、瑞得西韦和磷酸氯喹的MEM培养液(含有2％FBS)，使孔中药物最终浓度分别如表4至表6中所示，然后放入37℃、5％CO₂孵箱继续培养48h，细胞对照组加入终浓度0.3％DMSO的含有2％FBS的MEM培养液，或0.5％PBS的含有2％FBS的MEM培养液。

②RNA提取

采用TaKaRa公司生产的试剂盒(TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA ExtractionKit，货号9766)进行RNA提取。如果没有特别指出，下述RNA提取步骤中所涉及的耗材及试剂均为试剂盒的组成部分。下述提取步骤均为试剂盒说明书所推荐的步骤。

1)取受试培养板的上清液100μL，加入无核酸酶EP管(购自Axygen，货号mct-150-c)中，然后每孔加入321μL裂解液(100μL PBS,200μL buffer VGB,2μL proteinase K,1μLcarrier RNA)，混匀后置于56℃消化15min；

2)向1)中所得混合液加200μL无水乙醇，混匀；

3)将上述2)中所得混合液转入无RNA酶的离心柱中，12000rpm离心15s，弃废液；

4)加入500μL Buffer RW1，12000rpm离心15s清洗离心柱，弃废液；

5)加入650μL Buffer RW2，12000rpm离心15s清洗离心柱，弃废液；

6)加入650μL Buffer RW2，12000rpm离心2min清洗离心柱，弃废液，然后将离心柱整体转移至7)中的新的无RNA酶的2ml收集管中；

7)换新的无RNA酶的2ml收集管，12000rpm离心1min，干燥离心柱，然后将离心柱整体转移至8)中的1.5ml收集管中；

8)换上新的1.5ml收集管，放入7)中干燥的离心柱，向每个离心柱中加入30μl不含RNA酶的水，12000rpm离心2min，洗脱液即含有相应的RNA。

③RNA反转录

实验采用TaKaRa公司生产的反转录试剂盒(PrimeScript^TM RT reagent Kit withgDNA Eraser，货号RR047Q)进行RNA反转录。步骤如下：

1)进行gDNA去除：收集各实验组RNA样品，分别取3μL RNA进行反转录。首先，向各实验组RNA中加入2μl 5×gDNA Eraser Buffer，用RNase Free水补足反应体系至10μl，充分混匀，42℃水浴2min去除样品中可能存在的g DNA；

2)进行逆转录：向1)中所得样品中加入适量的酶和引物Mix及反应缓冲液，用RNase Free水补足体积至20μl，37℃水浴反应15min，之后投入85℃水中5sec，既可转录得到cDNA。

④Real-time PCR。

采用荧光定量PCR检测原病毒液每毫升所含拷贝数。

采用TB Green Premix(Takara，Cat#RR820A)混好反应体系，在StepOne PlusReal-time PCR仪(品牌：ABI)进行扩增反应和读数。计算原病毒液每毫升所含拷贝数。步骤如下：

1)首先建立标准品：将质粒pMT-RBD稀释成5×10⁸copies/μL,5×10⁷copies/μL,5×10⁶copies/μL,5×10⁵copies/μL,5×10⁴copies/μL,5×10³copies/μL,5×10²copies/μL。取2μL标准品或cDNA模板用于qPCR反应。；

2)实验过程中所用引物序列如下(均为5’-3’方向表示)：

RBD-qF:CAATGGTTTAACAGGCACAGG

RBD-qR:CTCAAGTGTCTGTGGATCACG

3)反应程序如下：

预变性：95℃5分钟；

循环参数：95℃15秒，54℃15秒，72℃30秒。共40个循环。

2.结果

2.1.汉防己甲素、磷酸氯喹和瑞得西韦对VeroE6细胞的毒性

细胞毒性结果显示，在所有受试浓度下，受试化合物的处理均未改变细胞活力，即受试化合物在所有浓度下对细胞均无毒性作用(表1-3)。

表1.受试化合物汉防己甲素的细胞毒性实验

表2.受试化合物瑞得西韦的细胞毒性实验

表3.受试化合物磷酸氯喹的细胞毒性实验

2.2.汉防己甲素、磷酸氯喹和瑞得西韦的抗病毒活性

病毒增殖抑制实验的结果显示，受试化合物在不同的浓度下，均能够有效抑制SARS-CoV-2感染上清中病毒基因组的复制(表4-6和图1)。

表4.受试化合物汉防己甲素的抗病毒实验

表5.受试化合物瑞得西韦的抗病毒实验

表6.受试化合物磷酸氯喹的抗病毒实验

经计算，在病毒感染复数MOI＝0.01的条件下：

汉防己甲素EC₅₀＝1.71μM，CC₅₀＝24.51μM，SI＝14.33

瑞得西韦EC₅₀＝0.30μM，CC₅₀＝160.30μM，SI＝534.33

磷酸氯喹EC₅₀＝1.54μM，CC₅₀＝92.93μM，SI＝60.34

在病毒感染复数MOI＝0.05的条件下：

汉防己甲素EC₅₀＝2.88μM，CC₅₀＝24.51μM，SI＝8.51

瑞得西韦EC₅₀＝0.59μM，CC₅₀＝160.30μM，SI＝271.69

磷酸氯喹EC₅₀＝3.77μM，CC₅₀＝92.93μM，SI＝24.49

3.结论

汉防己甲素(对照品磷酸氯喹和瑞得西韦)在不同受试浓度下在体外水平对受试细胞具有良好的安全性。汉防己甲素、瑞得西韦和磷酸氯喹对SARS-CoV-2病毒分离株nCoV-2019BetaCoV/Wuhan/WIV04/2019有明显的抑制作用，在病毒感染的MOI为0.01时，EC₅₀值分别为1.71μM，0.30μM和1.54μM，相应的治疗指数分别为14.33，534.33，60.34。在病毒感染的MOI为0.05时，EC₅₀值分别为2.88μM，0.59μM和3.77μM，相应的治疗指数分别为8.51，271.69，24.49。

汉防己甲素、磷酸氯喹和瑞得西韦在体外水平对SARS-CoV-2病毒具有抑制活性。

实施例2汉防己甲素对SARS-CoV-2的药效学研究2

实验材料、方法同实施例1，具体区别在于抗病毒实验中，实施例1中药物处理步骤是先将100μL含相应浓度药物的MEM培养液(含2％FBS)加入细胞板中，预处理细胞1小时，而本实施例中的药物处理步骤不用药物预处理细胞，具体步骤如下：

将Vero E6细胞接种到48孔板中，每孔约1×10⁵个细胞，然后加入20μL稀释的病毒(病毒量为1000TCID₅₀,即MOI＝0.01，以及病毒量为5000TCID₅₀,即MOI＝0.05)，置于培养箱孵育1小时。1h后弃病毒培养液，用PBS洗去未感染的残留病毒，再加入含相应浓度的汉防己甲素、瑞得西韦和磷酸氯喹的MEM培养液(含2％FBS)，使孔中药物最终浓度同实施例1表4、5、6所示的各个药物浓度，然后放入37℃、5％CO₂孵箱继续培养48h，细胞对照组加入终浓度0.3％DMSO的含有2％FBS的细胞培养液，或0.5％PBS的含有2％FBS的细胞培养液。

后续的RNA提取、RNA反转录和Real-time PCR方法均与实施例1相同。

经计算，在病毒感染复数MOI＝0.01的条件下：

汉防己甲素EC₅₀＝1.61μM，CC₅₀＝24.51μM，SI＝15.22

瑞得西韦EC₅₀＝0.23μM，CC₅₀＝160.30μM，SI＝696.96

磷酸氯喹EC₅₀＝4.52μM，CC₅₀＝92.93μM，SI＝20.56

在病毒感染复数MOI＝0.05的条件下：

汉防己甲素EC₅₀＝1.95μM，CC₅₀＝24.51μM，SI＝12.51

瑞得西韦EC₅₀＝0.62μM，CC₅₀＝160.30μM，SI＝258.55

磷酸氯喹EC₅₀＝3.63μM，CC₅₀＝92.93μM，SI＝25.60

结论：

抗病毒实验结果表明，汉防己甲素、瑞得西韦和磷酸氯喹对SARS-CoV-2病毒分离株nCoV-2019BetaCoV/Wuhan/WIV04/2019有明显的抑制作用，在病毒感染的MOI为0.01时，EC₅₀值分别为1.61μM，0.23μM和4.52μM，相应的治疗指数分别为15.22，696.96，20.56。在病毒感染的MOI为0.05时，EC₅₀值分别为1.95μM，0.62μM和3.63μM，相应的治疗指数分别为12.51，258.55，25.60。(见图2)

汉防己甲素、磷酸氯喹和瑞得西韦在病毒感染细胞后对SARS-CoV-2病毒具有抑制活性。

实施例3汉防己甲素对SARS-CoV-2的半数最大有效浓度(EC₅₀)

采取核酸定量法测定药物的EC₅₀。具体如下，提前一天将Vero细胞以约10000个/孔浓度接种至48孔板。用含有2％FBS(购自Gibco公司，货号16000044)的DMEM培养液将药物汉防己甲素配制成终浓度为20、10、5、2.5、1.25、0.625和0.3125μM，加入细胞中，放置37℃5％CO₂孵箱预处理1小时。然后，用含有2％FBS的DMEM培养液稀释SARS-CoV-2病毒(nCoV-2019BetaCoV/Wuhan/WIV04/2019分离株，GISAID登录号EPI_ISL_402124，由中国科学院武汉病毒研究所分离传代培养)，将其加入到相应的孔中，使病毒载量为100TCID₅₀，37℃吸附培养2小时，弃病毒液，每孔加入不同浓度的汉方己甲素(200μl/孔)，使每孔中汉方己甲素的终浓度为20、10、5、2.5、1.25、0.625和0.3125μM，每个药物浓度设置3个复孔，并设立病毒对照和正常细胞对照组，放置37℃5％CO₂孵箱培养，每天观察细胞病变(CPE)。在感染后2天，每孔取50μl细胞上清提取核酸，用定量RT-PCR检测病毒载量。

RNA提取、RNA反转录和RT-PCR的方法均与实施例1相同。

依据病毒RNA拷贝数和CT值的换算公式：RNA Copies/mL＝CT*(-0.3)+13.17，计算病毒载量。采用公式(感染率(％)＝药物组RNA拷贝数/病毒对照组RNA拷贝数×100％)计算病毒在不同浓度药物处理下的感染率(％)，利用Graphpad Prism 7软件对数据进行S拟合分析，拟合结果如图3所示，并计算EC₅₀。

结果显示，汉防己甲素在细胞水平对SARS-CoV-2病毒具有抑制作用，其EC₅₀为8.99μM(图3)。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解，根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

参考文献：

Zaki AM,van Boheemen S,Bestebroer T M,et al.Isolation of a novelcoronavirus from a man with pneumonia in Saudi Arabia[J].N Engl J Med,2012,367(19):1814-1820.

Zhong NS,Zheng BJ,Li YM,et al.Epidemiology and cause of severe acuterespiratory syndrome(SARS)in Guangdong,People's Republic of China,inFebruary,2003[J].The Lancet,2003,362(9393):1353-1358.

Cui J,Li F,Shi ZL.Origin and evolution of pathogenic coronaviruses[J].Nat Rev Microbiol,2019,17(3):181-192.

Wang M,Cao R,Zhang L,et al.Remdesivir and chloroquine effectivelyinhibit the recently emerged novel coronavirus(2019-nCoV)in vitro[J].CellRes,2020,0:1-3.

SEQUENCE LISTING

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

浙江金华康恩贝生物制药有限公司

<120> 二甲基小檗胺类化合物在抑制SARS-CoV-2中的用途

<130> IDC200198

<150> CN202010140356.0

<151> 2020-03-03

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 1

caatggttta acaggcacag g 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 2

ctcaagtgtc tgtggatcac g 21

Claims (10)

1.通式I所示的化合物，其几何异构体或其药学上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物，

或含有通式I所示的化合物，其几何异构体或其药学上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物的药物组合物在制备用于预防和/或治疗冠状病毒引起的疾病或感染或冠状病毒引起的并伴有高血压的疾病或感染的产品中用途。

2.通式I所示的化合物，其几何异构体或其药学上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物，

或含有通式I所示的化合物，其几何异构体或其药学上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物的药物组合物在制备用于预防和/或治疗与冠状病毒有关且伴有高血压的肺部疾病或症状的产品中用途。

3.通式I所示的化合物，其几何异构体或其药学上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物，

或含有通式I所示的化合物，其几何异构体或其药学上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物的药物组合物在制备用于抑制冠状病毒在细胞(例如哺乳动物细胞)中复制或繁殖的产品中的用途，或在制备作为冠状病毒抑制剂的产品中的用途。

4.通式I所示的化合物，

其几何异构体或其药学上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物，或含有通式I所示的化合物，其几何异构体或其药学上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物的药物组合物在制备用于预防和/或治疗与SARS-CoV-2有关的肺部疾病或症状，或无症状或有症状的SARS-CoV-2感染的产品中用途。

5.通式I所示的化合物，

其几何异构体或其药学上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物，或含有通式I所示的化合物，其几何异构体或其药学上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物的药物组合物在制备用于预防和/或治疗与SARS-CoV-2有关且伴有高血压的肺部疾病或症状，或伴有高血压的无症状或有症状的SARS-CoV-2感染的产品中用途。

6.通式I所示的化合物，

其几何异构体或其药学上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物，或含有通式I所示的化合物，其几何异构体或其药学上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物的药物组合物在制备用于预防和/或治疗COVID-19或伴有高血压的COVID-19的产品中的用途，或在制备作为SARS-CoV-2抑制剂的产品中的用途，或在制备用于抑制SARS-CoV-2在细胞(例如哺乳动物细胞)中复制或繁殖的产品中的用途。

7.权利要求1-6任一项的用途，其中所述产品为人用药品或动物用兽药。

8.权利要求7的用途，其中所述产品为固体制剂、注射剂、喷剂、液体制剂、吸入制剂或复方制剂。

9.权利要求3或6的用途，其中所述哺乳动物包括牛科动物、马科动物、羊科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物、灵长类动物，例如是人，狗或猪。

10.权利要求1-6任一项的用途，其中所述的药物组合物还包含药学上可接受的载体或辅料，具体地，所述药物组合物为固体制剂、注射剂、吸入制剂、喷剂、液体制剂、或复方制剂。

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