CN111996285B - 一种与丝瓜白粉病相关的分子标记及其应用 - Google Patents

一种与丝瓜白粉病相关的分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物分子标记技术领域，公开了一种与丝瓜白粉病相关的分子标记及其应用。该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，命名为M5349。本发明首次发现了与丝瓜白粉病相关的分子标记M5349，该分子标记与丝瓜白粉病性状显著相关；可作为丝瓜抗白粉病性状的分子标记，用于鉴定或辅助鉴定丝瓜的抗白粉病性状和/或丝瓜辅助育种中。

Description

一种与丝瓜白粉病相关的分子标记及其应用
技术领域
本发明属于生物分子标记技术领域，具体涉及一种与丝瓜白粉病相关的分子标记及其应用。
背景技术
丝瓜是一种重要的多功能蔬菜。丝瓜果实富含维生素、氨基酸、微量元素和抗氧化物质，具有清热消暑、止血消炎的功效，是一种药食兼用的多功能蔬菜。近年来，随着人们对营养健康的重视，丝瓜的播种面积逐年增大，已成为重要的日常消费蔬菜。
丝瓜白粉病是一种由病菌引起的的病害，在丝瓜种植的过程中十分常见，这种病主要发生在4月上旬和6月下旬，此时气温较温和，相对湿度大，在通风不良、栽培密度大的田地容易发病。丝瓜白粉病发病初期叶片局部产生圆形小白粉斑，后逐渐扩大为不规则形、边缘不明显的白粉状小霉斑（即病菌的分生孢子梗和分生孢子）。发生严重时，数十个白粉病斑汇集连成一片，最后造成叶片发黄，有时病斑上产生小黑点，严重影响丝瓜产量和品质。
因此，深入挖掘、利用丝瓜白粉病相关分子标记，对于丝瓜产业的发展具有重要意义。
发明内容
为了克服现有技术所存在的不足，本发明的第一方面的目的，在于提供一种与丝瓜白粉病相关的分子标记。
本发明的第二个方面的目的，在于提供用于扩增上述与丝瓜白粉病相关的分子标记的引物对。
本发明的第三个方面的目的，在于提供一种用于鉴定或辅助鉴定丝瓜白粉病形状的试剂盒。
本发明的第四个方面的目的，在于提供上述与丝瓜白粉病相关的分子标记在鉴定或辅助鉴定丝瓜白粉病性状和/或丝瓜育种中的应用。
本发明的第五方面的目的，在于提供上述用于扩增上述与丝瓜白粉病相关的分子标记的引物对在鉴定或辅助鉴定丝瓜白粉病性状和/或丝瓜育种中的应用。
本发明的第六方面的目的，在于提供上述用于鉴定或辅助鉴定丝瓜白粉病形状的试剂盒在鉴定或辅助鉴定丝瓜白粉病性状和/或丝瓜育种中的应用。
本发明的第七方面的目的，在于提供一种鉴定丝瓜白粉病性状的方法。
本发明的第八方面的目的，在于提供一种丝瓜辅助育种的方法。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供一种与丝瓜白粉病相关的分子标记，位于8号染色体52.69Mb和53.49Mb区域内。
优选的，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，命名为M5349。
所述分子标记的多态性为丝瓜基因组中含有SEQ ID NO.1第109~151位或缺失SEQID NO.1第109~151位。
所述分子标记的突变型为缺失第109~151位的SEQ ID NO.1，其核苷酸序列如SEQID NO.2所示。
本发明的第二个方面，提供用于扩增上述与丝瓜白粉病相关的分子标记的引物对，其中，上游引物设计在SEQ ID NO.1的第1bp～108bp处，下游引物设计在152-195bp处。
优选的，所述引物对（M5349引物对）的序列如下所示：
M5349-F:TTGAGGTATTACTTCCATC（SEQ ID NO.3）；
M5349-R:GCATCTTGAAATCTAGGT（SEQ ID NO.4）。
本发明的第三个方面，提供一种用于鉴定或辅助鉴定丝瓜白粉病形状的试剂盒，包含用于扩增上述与丝瓜白粉病相关的分子标记的引物对。
本发明的第四个方面，提供上述与丝瓜白粉病相关的分子标记在鉴定或辅助鉴定丝瓜白粉病性状和/或丝瓜辅助育种中的应用。
本发明的第五方面，提供上述用于扩增上述与丝瓜白粉病相关的分子标记的引物对在鉴定或辅助鉴定丝瓜白粉病性状和/或丝瓜辅助育种中的应用。
本发明的第六方面，提供上述用于鉴定或辅助鉴定丝瓜白粉病形状的试剂盒在鉴定或辅助鉴定丝瓜白粉病性状和/或丝瓜辅助育种中的应用。
本发明的第七个方面，提供一种鉴定丝瓜白粉病性状的方法，采用M5349引物对丝瓜样品基因组进行PCR扩增得到PCR产物，根据PCR产物的序列或片段大小鉴定丝瓜白粉病性状，具体如下：
1）采用M5349引物对丝瓜样品基因组进行PCR扩增得到PCR产物；
2）如M2）或N2):
M2):检测步骤1)得到的PCR产物的序列，如果PCR产物含有SEQ ID NO.1所示序列、不含有SEQ ID NO.2所示序列，则该样品为感白粉病；如果PCR产物含有SEQ ID NO.2所示序列、不含有SEQ ID NO.1所示序列，则该样品为抗白粉病；如果PCR产物含有SEQ ID NO.1所示序列和SEQ ID NO.2所示序列，则该样品为感白粉病；
N2):检测步骤1)得到的PCR产物的大小，如果PCR产物仅含有195bp的DNA片段，则该样品为感白粉病；如果PCR产物仅含有151bp的DNA片段，则该样品为抗白粉病；如果PCR产物含有195bp的DNA片段和151bp的DNA片段，则该样品为感白粉病。
本发明的第八方面，在于提供一种丝瓜辅助育种方法，包括检测与丝瓜白粉病相关的分子标记或者通过用于扩增上述与丝瓜白粉病相关的分子标记的引物对/用于鉴定或辅助鉴定丝瓜白粉病形状的试剂盒进行分子标记检测的步骤。
本发明的有益效果是：
本发明首次发现了与丝瓜白粉病相关的分子标记M5349，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，该分子标记与丝瓜白粉病性状显著相关：利用M5349标记检测F2群体，发现90.9%（30/33）抗白粉病系扩增出的条带为151bp；87.5%（42/48）感白粉病系扩增出的条带为195bp，或者是195bp和151bp；可作为丝瓜抗白粉病性状的分子标记，用于鉴定或辅助鉴定丝瓜的抗白粉病性状和/或丝瓜辅助育种中。
附图说明
图1是抗白粉病丝瓜93075和感白粉病丝瓜S1174的外观图。
图2是白粉病基因定位图：其中，上半部分为BSA-Seq定位结果；下半部分为分子标记精细定位结果。
图3是用M5349引物对扩增实施例1中抗白粉病丝瓜93075、感白粉病丝瓜S1174、F1、以及部分F2的电泳图：其中，第1泳道为Marker，2-14泳道为F2，15泳道为93075，16泳道为S1174，17泳道为F1；其中，第2、3、5、6、9、10、14、15、17为感白粉病，第4、7、8、11-13、16为抗白粉病。
具体实施方式
以下结合具体的实施例及附图对本发明的内容作进一步详细的说明。
应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
实施例1 与丝瓜白粉病性状相关基因的定位
1、实验材料
抗白粉病丝瓜93075来源于：广东省农业科学院蔬菜研究所选育的丝瓜自交系。
感白粉病丝瓜S1174来源于：广东省农业科学院蔬菜研究所选育的丝瓜自交系。
上述抗白粉病丝瓜93075和感白粉病丝瓜S1174的白粉病性状如图1所示。
2、实验步骤
2.1 将抗白粉病丝瓜93075和感白粉病丝瓜S1174杂交，获得F1，F1自交得到F2，将131株F2定植于大棚，自然发病，观察并统计感病指数情况，叶片完全未感染记为0，叶片感染面积小于1/4记为1，感染面积介于1/4至1/2记为2，感染面积介于1/2至3/4记为3，叶片完全感染记为4。调查统计发现感病指数为0和1的有33株，感染病数为4的有48株。
2.2 利用F2群体，分别选取感病指数为1和感病指数为4的植株，分别利用Trizol法提取RNA，分别取感病指数为1的植株的RNA等摩尔量混合成抗病池，分别取感病指数为4的植株的RNA等摩尔量混合成感病池，利用NEBNext® Ultra™ Directional RNA LibraryPrep Kit for Illumina，对感病池和抗病池进行RNA建库，通过Illumina HiSeq2000测序。获得的原始数据利用自主开发的Perl脚本提取多态性SNP，并且计算SNP指数（SNP-index）；进一步计算两个池SNP-index的差值（即deltaSNP-index)并作图，结果如图2所示：最终确定目的基因位于8号染色体51.46-55.52Mb区间；分析抗病基因组和感病基因组的DNA序列变异，开发InDel标记，对目标区段内重组单株进行分析，最终把目的基因定位于M5269和M5349之间，物理位置为52.69-53.49Mb。
2.3 针对分子标记M5349(SEQ ID NO.1)设计引物序列：M5349-F:TTGAGGTATTACTTCCATC（SEQ ID NO.3）；M5349-R:GCATCTTGAAATCTAGGT（SEQ ID NO.4）。利用M5349的引物对抗白粉病丝瓜93075、感白粉病丝瓜S1174、以及步骤2.1中F2群体中33株感病指数为0和1的植株及48株感病指数为4的植株进行感病/抗病鉴定：提取丝瓜基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用M5349的引物（M5349-F、M5349-R）进行PCR扩展（PCR反应体系为：10×buffer 1uL，Mg离子(25mM) 1uL，dNTP (2.5mM) 1uL，M5349-F (10uM) 0.5uL，M5349-R(10uM) 0.5uL，DNA模板（100ng/uL）1uL，Tap酶0.25uL，ddH2O 4.75uL；PCR反应程序为98℃2min；98℃ 30s，55℃30s，72℃25s，35次循环；72℃ 2min），PCR反应产物用1％的琼脂糖凝胶进行检测，结果如图3所示：抗白粉病丝瓜93075可以扩增出151bp条带，感白粉病丝瓜S1174可以扩增出195bp的条带；F2群体中90.9%（30/33）抗白粉病系扩增出的条带为151bp；87.5%（42/48）感白粉病系扩增出的条带为195bp，或者是195bp和151bp；可见分子标记M5349在抗白粉病系和感白粉病系之间具有多态性，抗白粉病系扩增出的条带为151bp；感白粉病系扩增出的条带为为195bp，或者是195bp和151bp。
实施例2 M5349标记作为丝瓜白粉病性状分子标记的应用
1、M5349标记和/或M5349引物对用于鉴定或辅助鉴定丝瓜白粉病形状
在苗期提取样本DNA，用M5349引物对扩增，根据PCR扩增结果判断样品的白粉病性状：如果样品扩增得到的序列为195bp的片段，标注为A序列，且在所述分子标记位点纯合，该样品经自然发病鉴定，表现为感白粉病；如果样品扩增得到的序列为151bp，标注为B序列，且在分子标记位点纯合，该样品经自然发病鉴定，表现为抗白粉病；如果样品扩增得到的序列有两条，一条为A序列，一条为B序列，则该样品在在所述分子标记位点杂合，该样品经自然发病鉴定，表现为感白粉病。
以上实验结果表明M5349标记和/或M5349引物对可作为丝瓜白粉病性状的分子标记，可用于鉴定或辅助鉴定丝瓜的白粉病性状。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东省农业科学院蔬菜研究所
<120> 一种与丝瓜白粉病相关的分子标记及其应用
<130>
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 195
<212> DNA
<213> 丝瓜
<400> 1
ttgaggtatt acttccatct ccattctttt tctcaattct cttttcatta aaattaaatt 60
acagaataat attgtaattg gcacatgagt attttagata aaagttaaaa atcaatttag 120
tttaattggt tttttactat cgaatggaac caataatgtt gagaataaga acatttgacc 180
tagatttcaa gatgc 195
<210> 2
<211> 151
<212> DNA
<213> 丝瓜
<400> 2
ttgaggtatt acttccatct ccattctttt tctcaattct cttttcatta aaattaaatt 60
acagaataat attgtaattg gcacatgagt attttagata aaagttaaat aatgttgaga 120
ataagaacat ttgacctaga tttcaagatg c 151
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ttgaggtatt acttccatc 19
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gcatcttgaa atctaggt 18

Claims (8)

1.一种与丝瓜白粉病相关的分子标记，其特征在于：
所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.用于扩增权利要求1所述与丝瓜白粉病相关的分子标记的引物对，其特征在于，所述引物对的序列如下所示：
M5349-F:TTGAGGTATTACTTCCATC（SEQ ID NO：3）；
M5349-R:GCATCTTGAAATCTAGGT（SEQ ID NO：4）。
3.一种用于鉴定或辅助鉴定丝瓜白粉病形状的试剂盒，其特征在于：包含权利要求2所述引物对。
4.权利要求1所述与丝瓜白粉病相关的分子标记在鉴定或辅助鉴定丝瓜白粉病性状和/或丝瓜辅助育种中的应用。
5.权利要求2所述引物对在鉴定或辅助鉴定丝瓜白粉病性状和/或丝瓜辅助育种中的应用。
6.权利要求3所述试剂盒在鉴定或辅助鉴定丝瓜白粉病性状和/或丝瓜辅助育种中的应用。
7.一种鉴定丝瓜白粉病性状的方法，其特征在于：采用权利要求2所述的引物对丝瓜样品基因组进行PCR扩增得到PCR产物，根据PCR产物的序列或片段大小鉴定丝瓜白粉病性状。
8.一种丝瓜辅助育种方法，其特征在于：包括检测权利要求1所述与丝瓜白粉病相关的分子标记或者通过权利要求2所述引物对或权利要求3所述试剂盒进行分子标记检测的步骤。
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