CN111995767A - 改性腐植酸钠和制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
一种改性腐植酸钠和制备方法及应用，获得具有明显小肠炎症的肠炎模型小鼠，主要包括昆明小鼠饮用含3‑4%葡聚糖硫酸钠蒸馏水3‑5天，以后的13‑15天昆明小鼠饮用0.3‑0.5%改性腐植酸钠水溶液与108cfu/mL大肠杆菌K88菌液，隔天交替，肠炎模型建立及治疗过程共计18天；其次，通过控制腐植酸钠改性工艺，获得具有特定酚羟基与羧基摩尔比的改性腐植酸钠，主要包括：称取腐植酸质量含量45%的腐殖酸矿粉100g，氢氧化钠6‑12g，硫代硫酸钠3‑6g，加入1000g蒸馏水，60‑130转/分钟搅拌，80‑120℃反应60‑120分钟，4200转/分钟离心10分钟；上清液置于不锈钢托盘中，80‑180℃烘箱中干燥至恒重，获得改性腐植酸钠制品。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，尤其是涉及一种改性腐植酸钠和制备方法及应用。
背景技术
大肠杆菌性腹泻是畜牧业中常见的发病率、死亡率极高的传染病之一。虽然抗生素已普遍用于此病的治疗，但是长期使用会导致细菌产生耐药性。因此，建立肠炎模型有助于研究其发病机制及新药开发。由于大肠杆菌K88为条件致病菌，因此在以大肠杆菌K88进行的模型建立过程中，经常会出现肠炎症状不明显等问题。葡聚糖硫酸钠是建立肠炎模型的常用化学物质，主要用于结肠炎模型的建立。现有技术中多采用腹腔注射、鼻腔给药或高浓度菌液经口灌服建立肠炎模型，有研究表明单独使用大肠杆菌K88建模，肠炎现象不明显。
发明内容
本发明为了克服现有技术中的不足，采用大肠杆菌K88联合葡聚糖硫酸钠建立肠炎模型，并采用自由饮水的方式建模，更准确的模拟大肠杆菌性腹泻的感染途径及特点，得到了腐植酸钠对大肠杆菌K88与葡聚糖硫酸钠联合诱导的肠炎小鼠影响模型的建立方法。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种改性腐植酸钠，其中的酚羟基与羧基摩尔比为2-2.2。
改性腐植酸钠的制备方法，它包括如下步骤：
（1）称取腐植酸质量含量45%的腐植酸矿粉100g，氢氧化钠6-12g，硫代硫酸钠3-6g，加入1000g蒸馏水，60-130转/分钟搅拌，80-120℃反应60-120分钟，4200转/分钟离心10分钟，取上清液。
（2）上清液置于不锈钢托盘中，80-180℃烘箱中干燥至恒重，获得改性腐植酸钠制品。
一种改性腐植酸钠的应用，其特征是用于小鼠大肠杆菌K88肠炎模型建立。
用于小鼠大肠杆菌K88肠炎模型建立包括如下步骤：（1）昆明小鼠饮用含3-4% 葡聚糖硫酸钠蒸馏水3-5天，以后的13-15天昆明小鼠饮用0.3-0.5%改性腐植酸钠水溶液与108cfu/mL大肠杆菌K88菌液，隔天交替；小鼠大肠杆菌K88肠炎模型建立过程共计18天。
改性腐植酸钠的制备方法包括如下步骤：
（1）称取腐植酸质量含量45%的腐植酸矿粉100g，氢氧化钠6-12g，硫代硫酸钠3-6g，加入1000g蒸馏水，60-130转/分钟搅拌，80-120℃反应60-120分钟，4200转/分钟离心10分钟，取上清液。
（2）上清液置于不锈钢托盘中，80-180℃烘箱中干燥至恒重，获得改性腐植酸钠制品。
小鼠肠炎症状评价：
（1）每天记录小鼠大便的性状及腹泻率；每2天称量小鼠的体重变化，计算小鼠疾病活动指数（DAI）。
（2）试验结束后解剖小鼠，结合小鼠疾病活动指数，通过小鼠结肠长度、肠绒毛及肠壁完整性、肠道菌群结构比较，评价模型小鼠是否具有典型的大肠杆菌性肠炎特征以及腐植酸钠对肠炎模型小鼠的治疗效果。
本发明具有如下有益效果：
1、本发明利用葡聚糖硫酸钠对机体消化系统造成微弱影响，以便为大肠杆菌提供良好定植环境，同时还要控制葡聚糖硫酸钠不能对动物肠道有明显致炎影响，避免干扰大肠杆菌作用，这对葡聚糖硫酸钠的剂量及摄入量有了更高要求。本发明通过短期饮用葡聚糖硫酸钠破坏肠壁为大肠杆菌K88提供优良定植环境，实现利用大肠杆菌K88与葡聚糖硫酸钠联合诱导构建肠炎模型。针对单独利用大肠杆菌K88建模肠炎效果不明显的缺点，通过葡聚糖硫酸钠的结肠急性致炎作用，首先引起肠道系统功能紊乱，导致小肠对病原微生物侵害的抵抗能力下降，这样为大肠杆菌K88在小肠内的定植提供有力条件，促进大肠杆菌K88肠炎模型的病理表现，使模型小鼠出现明显的肠炎症状。
2、由于养殖过程中动物感染大肠杆菌主要是因为摄入了被大肠杆菌污染的饲料或饮水，而使用腹腔注射、鼻腔给药或经口直接高浓度灌服菌液不能准确模拟临床大肠杆菌性腹泻经口随被污染食物或饮水摄入的特点，本发明通过小鼠自由饮用108 cfu/mL大肠杆菌K88菌液，模拟临床过程实现大肠杆菌的连续、低浓度摄入。
3、腐植酸钠是以风化煤、泥炭和褐煤为原料经特殊工艺加工制成的一种具有多种功能的大分子有机弱酸钠盐，其结构比较复杂，已知腐植酸分子中含有苯环、稠环和某些杂环（如吡咯、呋喃、吲哚等），芳香环上有各种功能基团，主要是羧基、酚基、羟基、甲氧基、醌基等，其中酚羟基与羧基是腐植酸钠发挥抗炎、止泻功能的分子基础。通过改变腐植酸矿粉与氢氧化钠比例及反应条件，获得改性腐植酸钠中最优酚羟基与羧基摩尔比，提高其抗炎、止泻效果。
4、针对酚羟基在碱性条件下易被氧化成醌基，导致酚羟基损失的问题，反应过程成中加入硫代硫酸钠对酚羟基进行保护。
具体实施方式
实施例1：改性腐植酸钠是通过如下步骤制备：
1、称取腐植酸质量含量45%的腐植酸矿粉100g，氢氧化钠6 g，硫代硫酸钠6g，加入1000g蒸馏水，60转/分钟搅拌，80℃反应60分钟，4200转/分钟离心10分钟，取上清液。
2、上清液置于不锈钢托盘中，180℃烘箱中干燥至恒重，获得腐植酸钠制品。
3、酚羟基与羧基含量采用非水电导率滴定法进行测定，最优滴定条件为样品pH为4、KOH-异丙醇滴定液浓度0.05mol/L、氮气通入速率为80mL/min，测得腐植酸钠制品中酚羟基与羧基含量共计129.79 cmol/kg，酚羟基与羧基摩尔比为2.14。
实施列2：本实施例与实施例1相同之处不再赘述，不同之处在于改性腐植酸钠是通过如下步骤制备：
1、称取腐植酸质量含量45%的腐植酸矿粉100g，氢氧化钠11g，硫代硫酸钠5 g，加入1000g蒸馏水，120转/分钟搅拌，100℃反应80分钟，4200转/分钟离心10分钟，取上清液。
2、上清液置于不锈钢托盘中，100℃烘箱中干燥至恒重，获得腐植酸钠制品。
3、腐植酸钠制品中酚羟基与羧基含量共计132.85 cmol/kg，酚羟基与羧基摩尔比为2.12。
实施例3：本实施例与实施例1相同之处不再赘述，不同之处在于改性腐植酸钠是通过如下步骤制备：
1、称取腐植酸质量含量45%的腐植酸矿粉100g，氢氧化钠12g，硫代硫酸钠3g，加入1000g蒸馏水， 130转/分钟搅拌， 120℃反应120分钟，4200转/分钟离心10分钟，取上清液。
2、上清液置于不锈钢托盘中，100℃烘箱中干燥至恒重，获得腐植酸钠制品。
3、腐植酸钠制品中酚羟基与羧基含量共计128.49 cmol/kg，酚羟基与羧基摩尔比为2.09。
实施例4：本实施例与实施例1相同之处不再赘述，不同之处在于改性腐植酸钠是通过如下步骤制备：
1、称取腐植酸质量含量45%的腐植酸矿粉100g，氢氧化钠11g，硫代硫酸钠2 g，加入1000g蒸馏水，120转/分钟搅拌，100℃反应80分钟，4200转/分钟离心10分钟，取上清液。
2、上清液置于不锈钢托盘中，100℃烘箱中干燥至恒重，获得腐植酸钠制品。
3、腐植酸钠制品中酚羟基与羧基含量共计100.17cmol/kg，酚羟基与羧基摩尔比为1.59。
实施例5：本实施例与实施例1相同之处不再赘述，不同之处在于改性腐植酸钠是通过如下步骤制备：
（1）称取腐植酸质量含量45%的腐植酸矿粉100g，氢氧化钠5g，硫代硫酸钠6g，加入1000g蒸馏水，140转/分钟搅拌， 130℃反应130分钟，4200转/分钟离心10分钟，取上清液。
（2）上清液置于不锈钢托盘中，70℃烘箱中干燥至恒重，获得改性腐植酸钠制品。
改性腐植酸钠中酚羟基与羧基含量共计70.37 cmol/kg，酚羟基与羧基摩尔比为1.36。
实施例6：本实施例与实施例1相同之处不再赘述，不同之处在于改性腐植酸钠是通过如下步骤制备：
（1）称取腐植酸质量含量45%的腐植酸矿粉100g，氢氧化钠13g，硫代硫酸钠6g，加入1000g蒸馏水，50转/分钟搅拌，130℃反应130分钟，4200转/分钟离心10分钟，取上清液。
（2）上清液置于不锈钢托盘中，190℃烘箱中干燥至恒重，获得改性腐植酸钠制品。
改性腐植酸钠中酚羟基与羧基含量共计57.10 cmol/kg，酚羟基与羧基摩尔比为3.14。
由实施例1-6可以看出，腐植酸矿粉与氢氧化钠比例、反应温度、反应时间、转速及干燥温度对腐植酸钠中酚羟基与羧基总含量及摩尔比有明显影响。同时，实施例4与实施例2的唯一区别是硫代硫酸钠的浓度降低了，改性腐植酸钠中酚羟基与羧基含量及摩尔比均发生改变，主要是因为缺少硫代硫酸钠的保护，部分酚羟基被氧化成醌基等基团。
实施例7：一种小鼠大肠杆菌K88肠炎模型建立方法，它包括如下步骤：
（1）昆明小鼠按每组18只分成3组，饲喂普通小鼠日粮。对照组：自由饮用蒸馏水，共18天；肠炎组：前4天饮用3.5%葡聚糖硫酸钠蒸馏水，后14天蒸馏水与108cfu/mL大肠杆菌K88菌液隔天交替自由饮用，共计18天。
（2）每天记录小鼠大便的性状及腹泻率；每2天称量小鼠的体重变化，计算小鼠疾病活动指数（DAI）。
表1 DAI评分标准
*正常大便：成形大便；软便：不黏附于肛门的糊状、半成形大便；稀便：可黏附于肛门的稀水样便。
实施例8：一种小鼠大肠杆菌K88肠炎模型建立方法，本实施例中与实施例6相同之处不再赘述，它包括如下步骤：
（1）肠炎组：前6天饮用3.5%葡聚糖硫酸钠蒸馏水，后12天蒸馏水与108cfu/mL大肠杆菌K88菌液隔天交替自由饮用，共计18天。
（2）DAI计算方法同实施例7。
实施例9：一种小鼠大肠杆菌K88肠炎模型建立方法，它包括如下步骤：
（1）肠炎组：前4天饮用2.5%葡聚糖硫酸钠蒸馏水，后14天蒸馏水与108cfu/mL大肠杆菌K88菌液隔天交替自由饮用，共计18天。
（2）DAI计算方法同实施例7。
由表2可以看出，浓度与饮用时间二者协同发挥作用。与实施例7相比，葡聚糖硫酸钠浓度相同，只是葡聚糖硫酸钠饮用时间延长了2天，DAI评分发生明显提高，且在养殖过程中发现，实施例8中小鼠出现明显便血，有4只小鼠因便血堵塞肛门而死亡。实施例9与实施例7相比，葡聚糖硫酸钠浓度降低了，但是由于葡聚糖硫酸钠浓度过低，虽然饮用时间与实施例7相同，DAI评分指数远低于实施例7，未能获得满意的肠炎症状。
实施例10-14：一种小鼠大肠杆菌K88肠炎模型建立方法（表2），它包括如下步骤：
（1）肠炎模型建立同实施例7。
（2）腐植酸钠治疗：前4天饮用含3.5 %葡聚糖硫酸钠蒸馏水，后14天改性腐植酸钠水溶液（改性腐植酸钠来源及浓度如表2）与108 cfu/mL大肠杆菌K88菌液隔天交替，共计18天。
（3）每天记录小鼠大便的性状及腹泻率；每2天称量小鼠的体重变化，计算小鼠疾病活动指数（DAI）。
表2实施例9-13分组及结果
如表2所示，实施例10-12，均以实施例7中肠炎小鼠为对象，同时改性腐植酸钠也均来自于实施例2，其中腐植酸钠制品中酚羟基与羧基含量共计132.85 cmol/kg，酚羟基与羧基摩尔比为2.12。三个实施例中虽然饮用浓度略有不同，改性腐植酸钠的浓度在0.3%-0.5%之间，但最终结果表明DAI值非常接近，且与实施例7中的肠炎小鼠相比，DAI值下降明显，说明肠炎、腹泻得到非常好的治疗。同时可以看出，实施例13、14与实施例10-12中改性腐植酸钠虽然工艺略有不同，酚羟基与羧基总量及摩尔比也非常接近，分别为129.79 cmol/kg、128.49 cmol/kg和2.14、2.09，对于肠炎的治疗效果相当。
实施例15、16、17同样以实施例7中肠炎小鼠为对象，与实施例10-12的区别在于，实施例15、16、17所用改性腐植酸钠分别来自于实施例5、实施例6和实施例4，无论酚羟基与羧基的含量，还是酚羟基与羧基的摩尔比均不同。为了验证酚羟基与羧基含量及二者的摩尔比在改性腐植酸钠对肠炎的治疗效果的作用，我们通过调整改性腐植酸钠的添加量，实施例15饮用0.76%来自于实施例5的改性腐植酸钠，实施例16饮用0.93%来自于实施例6的改性腐植酸钠，实施例17饮用0.53%来自于实施例4的改性腐植酸钠，此时实施例10、15、16、17组中所饮用改性腐植酸钠中酚羟基与羧基的总量相同，唯一区别是在4个实施例中酚羟基与羧基的摩尔比不同。我们从表2可以看出，在酚羟基与羧基摄入总量相同，且初始肠炎小鼠也相同的情况下，实施例15、16、17中小鼠的DAI值明显高于实施例10，说明实施例15、16、17中改性腐植酸钠无法达到治疗小鼠肠炎的目的，而区别仅仅是因为改性工艺不同导致的酚羟基与羧基摩尔比的差异。同时可以看到，实施例10与实施例17的区别在于所用改性腐植酸钠不同，而在改性腐植酸钠制备过程中的唯一区别是实施例17所用实施例4的改性腐植酸钠反应过程中硫代硫酸钠浓度降低了，导致酚羟基与羧基含量下降，酚羟基与羧基的摩尔比同时下降，这进一步说明酚羟基与羧基比例的重要性。
对实施例10进一步分析发现，与对照组相比，试验第4天，肠炎组与腐植酸钠治疗组均出现腹泻症状，粪便变软，粪便与垫料粘附，小鼠懒动，精神萎靡，停止饲喂葡聚糖硫酸钠后腹泻症状得到缓解。 第5天起，肠炎组与腐植酸钠治疗组开始通过饮水摄入大肠杆菌K88，肠炎组与腐植酸钠治疗组小鼠未再出现明显腹泻现象。肠炎组较腐植酸钠治疗组粪便较软。对照组DAI评分总体上为0，而腐植酸钠治疗组小鼠虽然体重变化、精神较正常组有一定差距，但是已经显著好于肠炎组。
肠炎组及腐植酸钠治疗组与对照组相比，结肠肠道长度差别不明显，说明葡聚糖硫酸钠与K88联合作用对于结肠长度影响不明显，进一步说明葡聚糖硫酸钠在建模过程中只是选择性发挥了辅助功能，肠炎小鼠所表现出的肠炎症状主要为大肠杆菌所致。与对照组相比，肠炎组结肠肠壁偏黄，有轻微水肿现象出现，粪便成型度比对照组有下降，但基本仍呈粒状，肠炎组小鼠并未出现明显的腹泻、拉稀现象。腐植酸钠治疗组经过饲喂腐植酸钠，与肠炎组相比，结肠形态及粪便成型度具有明显提升。同时可以看出，葡聚糖硫酸钠与K88联合作用虽然能够引起结肠炎症，但三组结肠形态及HE染色形态差异不大。
大肠杆菌K88与葡聚糖硫酸钠共同诱导的肠炎，肠炎组在十二指肠最为严重，肠道表现为明显的肠腺畸形，淋巴细胞浸润，黏膜上皮受损，部分上皮细胞脱落，黏膜下层增厚，明显充血水肿，肠炎后饲喂腐植酸钠的一组，这类症状明显改善，肠绒毛排列整齐，结构完整，杯状细胞明显，肠腺完整，大肠杆菌K88与葡聚糖硫酸钠对肠道的损伤有所改善。葡聚糖硫酸钠与大肠杆菌K88引起的肠炎在空肠表现为明显的肌层细胞空泡样变性，溶解坏死，饲喂腐植酸钠后，这类现象有所改善。肠炎组回肠有明显的隐窝畸形，肠绒毛不完整，有肠绒毛脱落现象，腐植酸钠治疗组肠绒毛保存完整，隐窝较浅。小肠隐窝深度、肠绒毛完整度是评价小肠黏膜发育和吸收的重要指标，隐窝深度的增加及畸形，能间接反映小肠吸收能力的下降，本发明中肠炎模型造模成功后，饲喂腐植酸钠后，隐窝正常，较肠炎组较浅，反映出腐植酸钠能降低肠炎，提高小肠的发育和吸收能力。
肠炎组与腐植酸钠治疗组在属水平的丰度差异较大而对照组介于肠炎组组与腐植酸钠治疗组之间，说明葡聚糖硫酸钠与K88诱导肠炎及腐植酸钠干预对于小鼠肠道菌群结构影响比较明显。所有OTU被划分为7个门，其中厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）为3组肠道菌群的优势菌门，在对照组、腐植酸钠治疗及肠炎组三组中占总序列数为94.9%，其中厚壁菌门的丰度最高，占总序列数的66.4%，其次是Actinobacteria，占总序列数的13.9%，而变形菌门、拟杆菌门和TM7的占比分别为9.6%、5.0%和4.5%。其余的如无壁菌门（Tenericutes）和蓝细菌门（Cyanobacteria）的占比只有0.5%和0.1%。3组小鼠肠道菌群结构中门水平相对丰度的差异较明显，腐植酸钠治疗组肠道菌群结构中厚壁菌门菌群相对丰度为84.5%，不仅远远超过KHO组的49.6%，而且高于CON组的65.0%；值得注意的是腐植酸钠治疗组放线菌门、变形菌门、拟杆菌门和TM7的相对丰度分别为7.8%、3.8%、2.1%和1.6%，分别低于对照组的13.5%、10.5%、7.1%、2.7%与肠炎组的20.5%、14.5%、5.8%、9.3%； 同时可看到，放线菌门、变形菌门在小鼠接触大肠杆菌K88之后均出现上升趋势，分别由对照组的13.5%、10.5%，提高至肠炎组的20.5%和14.5%。
本发明在利用大肠杆菌K88和葡聚糖硫酸钠成功获得小肠肠炎模型的基础之上，通过控制反应工艺条件，获得最适酚羟基与羧基摩尔比的改性腐植酸钠制品，建立了改性腐植酸钠影响小鼠肠炎的模型。总而言之，本发明通过控制腐植酸钠改性工艺条件，可以获得酚羟基与羧基总量及摩尔比有明显区别的改性腐植酸钠，而由结果也可以看出，改性腐植酸钠中酚羟基与羧基的摩尔比是真正影响其抗炎、止泻效果的关键。
Claims (5)
1.一种改性腐植酸钠，其特征是其中的酚羟基与羧基摩尔比为2-2.2。
2.改性腐植酸钠的制备方法，其特征是它包括如下步骤：
（1）称取腐植酸质量含量45%的腐植酸矿粉100g，氢氧化钠6-12g，硫代硫酸钠3-6g，加入1000g蒸馏水，60-130转/分钟搅拌，80-120℃反应60-120分钟，4200转/分钟离心10分钟，取上清液；
（2）上清液置于不锈钢托盘中，80-180℃烘箱中干燥至恒重，获得改性腐植酸钠制品。
3.一种如权利要求1所述的改性腐植酸钠的应用，其特征是用于小鼠大肠杆菌K88肠炎模型建立。
4.根据权利要求3所述的改性腐植酸钠的应用，其特征是改性腐植酸钠用于小鼠大肠杆菌K88肠炎模型建立包括如下步骤：（1）昆明小鼠饮用含3-4% 葡聚糖硫酸钠蒸馏水3-5天，以后的13-15天昆明小鼠饮用0.3-0.5%改性腐植酸钠水溶液与108cfu/mL大肠杆菌K88菌液，隔天交替；小鼠大肠杆菌K88肠炎模型建立过程共计18天。
5.根据权利要求4所述的改性腐植酸钠的应用，其特征是改性腐植酸钠的制备方法包括如下步骤：
（1）称取腐植酸，腐植酸质量含量45%的腐殖酸矿粉100g，氢氧化钠6-12g，硫代硫酸钠3-6g，加入1000g蒸馏水，60-130转/分钟搅拌，80-120℃反应60-120分钟，4200转/分钟离心10分钟，取上清液；
（2）上清液置于不锈钢托盘中，80-180℃烘箱中干燥至恒重，获得改性腐植酸钠制品。
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| CN111995767B (zh) | 2022-02-15 |
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