CN111991404A - 防治真菌感染的复合维生素d及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种防治真菌感染的复合维生素D，包括功效成分维生素D2和维生素D3，维生素D2和维生素D3的质量比为1～3:1～5。还公开了该复合维生素D在制备防治真菌感染的药物中的应用。本发明的复合维生素D具有防治曲霉属真菌、新生隐球菌等感染的作用。除此之外，该复合物细胞毒性低，可作为临床抗真菌感染治疗的候选药物。

Description

防治真菌感染的复合维生素D及其应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种能够防治真菌感染的复合维生素D及其应用。

背景技术

已有相关研究报道维生素D在防治酵母型真菌方面具有显著作用，但是在防治曲霉属(Aspergillus)真菌以及新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)方面的相关研究尚未见报道。曲霉属真菌，尤其是烟曲霉，是一种能够通过空气传播的重要条件致病性真菌。近年来，随着抗生素的滥用、免疫抑制剂的治疗、侵入性器械的开展、器官移植手术的发展等，导致烟曲霉菌感染率急剧增加，且预后差，目前已成为继酵母菌感染的第二大真菌感染性疾病。更为严重的是耐药性烟曲霉的不断出现，严重威胁着人们的生命健康。新生隐球菌是继白色念珠菌、烟曲霉菌的第三大人类致病性真菌，可引起肺、脑膜、皮肤、黏膜等部位感染，在国外已成为艾滋病患者常见的并发症之一，是导致患者死亡的重要原因，新生隐球菌的发病率逐年上升。而传统的抗真菌药物容易使真菌产生耐药性，给临床治疗真菌感染产生极大困难。此外，传统抗真菌药物的肝、肾毒性较大，价格昂贵，相对而言，维生素D在临床上应用历史悠久，且人体自身均可合成一定量的维生素D，其安全性大有保障，并且易获得，价格相对低廉。

发明内容

本发明的目的是针对上述问题，提供一种能够防治真菌感染的药物,即所述复合维生素D。

本发明为了实现其目的，采用的技术方案是：

一种防治真菌感染的复合维生素D，功效成分主要包括维生素D2和维生素D3。

所述维生素D2和维生素D3的质量比为1～3:1～5。

所述维生素D3选自25-羟维生素D3、1,25-二羟维生素D3、24,25-二羟维生素D3中的一种或多种。

作为优选地，所述复合维生素D还包括可以药剂学上可接受的辅料。

所述辅料包括润湿剂和/或黏合剂。

所述润湿剂为水，所述黏合剂为质量百分比10％的淀粉浆。

作为优选地，所述复合维生素D为膏剂、片剂、注射剂、胶囊剂、颗粒剂。

本发明还提供前述任一的复合维生素D在制备防治真菌感染的药物中的应用。

所述真菌为曲霉属真菌或新生隐球菌。

本发明复合维生素D可采用皮肤给药(搽剂)、口服、皮下注射、肌内注射等方式，从而达到不同的效果，间接增加了其应用范围。

维生素D的种类很多，根据其侧链的不同分为维生素D2、D3、D4、D5、D6、D7等多种形式，但迄今为止发现只有维生素D2(麦角钙化醇)、D3(胆钙化醇)有活性。1,25-二羟基维生素D3除传统的调节钙、磷代谢平衡和骨骼生长外，其对机体的非骨骼效应也更为关键，如参与免疫调节、抗炎、抗氧化、诱导肿瘤细胞分化、抑制肿瘤细胞增殖及促进凋亡。维生素D在临床上有长期的广泛应用，使得本发明的应用安全也得以保障。

本发明的有益效果是：

本发明的复合维生素D在防治曲霉属真菌(包括耐药或非耐药的烟曲霉、黄曲霉等)和新生隐球菌方面展示出良好的抑制作用；通过实验证实复合维生素D对曲霉属真菌孢子的产生、菌丝的形成、生物膜的形成等呈现出不同程度的抑制作用，可以用于抑制曲霉属真菌的生长、黏附、侵袭；对新生隐球菌孢子的形成也呈现出显著的抑制作用。

本发明采用传统的体外抑菌实验，包括抗性平板培养观察孢子产量等、萌发试验、生物膜形成等，进行了药物效果的初步验证，与未经该复合药物处理的曲霉属真菌相比，处理过后的曲霉属真菌菌苔变薄、色素减少、孢子量明显减少、孢子萌发率以及生物膜形成率均显著下降，对新生隐球菌进行点板实验，其孢子产量及孢子大小相对于对照组来说也被明显抑制。这些效果表明该复合维生素D制剂在抗曲霉属真菌以及新生隐球菌等感染方面具有重要意义，且与传统的抗真菌药物相比，不易使真菌产生耐药性。

本发明的复合维生素D具有防治曲霉属真菌、新生隐球菌等感染的作用。除此之外，该复合物细胞毒性低，可作为临床抗真菌感染治疗的候选药物。

附图说明

图1是本发明的复合维生素D对曲霉菌的体外抑菌实验。

图2是本发明的复合维生素D对新生隐球菌的体外抑菌实验。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

主要试剂来源：

维生素D2、D3：购自于上海麦克林生化科技有限公司。

本发明所有实施例中用到的菌株来源为：(1)曲霉菌：烟曲霉标准菌株AF293通过商购获得；黄曲霉、黑曲霉均为申请人从临床患者肺泡灌洗液中分离得到的菌株，保存于本实验室。(2)新生隐球菌：H99标准菌株，常规市售菌株。

YPD固体培养基：即酵母浸出粉胨葡萄糖培养基，具体配制方法为：无水葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母10g，琼脂粉18g，加双蒸水1000ml，搅拌均匀，高压蒸汽灭菌后，室温放置冷却，放置4℃冰箱待用。

YPD液体培养基：不含琼脂粉，其它步骤同YPD固体培养基配制。

PBS缓冲液：1升PBS缓冲液的配方：磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.24g，磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)氯化钠(NaCl)8g，氯化钾(KCl)0.2g，PH为7.4。

其余试剂如未表明，均为本领域常规试剂，也可商购获得。

实施例1液基稀释液法药物敏感性试验(MIC₉₀试验)

实验前将三种曲霉菌株(烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉)于YPD固体养基中37℃连续转种两次，将新生隐球菌于YPD液体养基中37℃，180rpm/min条件下培养24h，保证菌株的活力与纯度保证菌株的活力与纯度。将活化两次的曲霉孢子用含有1％Tween 80的无菌双蒸水洗脱后，曲霉孢子和新生隐球菌用双蒸水进行稀释后，用血球计数板进行计数，确定孢子浓度，用RPMI-1640稀释调整菌液浓度均为2×10⁵cfu/ml备用。参照CLSI M38-A方案的微量稀释法，96孔板的第1～10孔内分别加入100μL倍比稀释的复合维生素D(复合维生素D的组分维生素D2与维生素D3的质量比为1﹕2，终浓度为3.2mg/mL～0.0625mg/mL)和100μL受试菌液(终浓度为10⁵cfu/mL)。阴性对照孔加入200μL的RPMI-1640，正常生长对照孔加入100μLRPMI-1640和100μL受试菌液，混匀，37℃培养48h，以视觉法和OD值(490nm)测定法判读结果。维生素D3分别采用25-羟维生素D3、1,25-二羟维生素D3、24,25-二羟维生素D3与维生素D2配制成不同的复合维生素D样品按照前述方法进行实验，结果如表1所示，不同维生素D3与维生素D2配制成的复合维生素D样品对三种曲霉菌株和新生隐球菌的MIC₉₀均为0.4mg/ml。

表1

实施例2体外抑菌实验

一、对曲霉菌的抑菌实验

制备含不同浓度的复合维生素D的YPD固体培养基：将维生素D2、维生素D3按不同质量比混合后，用DMSO溶解制备储备液浓度为50mg/ml，4℃保存备用。

制备曲霉孢子悬液：实验前将三种曲霉菌株于YPD固体培养基中在37℃恒温培养箱中连续转种两次，保证菌株的活力与纯度。将活化两次的烟曲霉孢子用含有1％Tween80的无菌双蒸水洗脱，用无菌双蒸水制备不同浓度的曲霉孢子悬液(10⁵cfu/ml、10⁴cfu/ml、10³cfu/ml)进行点板实验，即每次取3μl的孢子悬液点在制备好的含复合维生素D(其组分维生素D2和维生素D3的初始质量比不同，但配制的终浓度均为0.4mg/ml的复合维生素D，维生素D3采用1,25-二羟维生素D3)的YPD固体培养皿上，在37℃培养4d，每天进行拍照观察曲霉生长形态、菌苔大小等变化，直至阴性对照(不含复合维生素D)长满整个平板即停止观察。

本实验采用了烟曲霉Aspergillus fumigatus、黄曲霉Aspergillus flavus、黑曲霉Aspergillus niger。图1为培养3d时曲霉的生长情况：Treatemnt 1、Treatemnt 2、Treatemnt 3分别是维生素D2与维生素D3(采用1,25-二羟维生素D3)的质量比为1﹕1、3﹕1、1﹕2的复合维生素D处理3天之后的生长情况，其复合维生素D的浓度均为0.4mg/ml；从图中可见，与对照组相比，经复合维生素D处理后，菌苔变薄，色素变浅，菌圈明显变小。

二、对新生隐球菌的抑菌实验

实验前将新生隐球菌于YPD液体培养基中37℃，180rpm/min条件下培养24h，保证菌株的活力与纯度。将活化好的新生隐球菌经血细胞计数板计数后，用无菌双蒸水制备不同浓度的新生隐球菌孢子悬液(10⁴cfu/ml、10³cfu/ml)进行点板实验，即每次取3μl的孢子悬液点在制备好的含复合维生素D(其组分维生素D2与维生素D3的质量比为1﹕2，维生素D3采用1,25-二羟维生素D3)的YPD固体培养基(设置含不同浓度梯度的复合维生素D的YPD培养基，复合维生素D的梯度浓度为0.1、0.2、0.3、0.4mg/ml)上，在37℃培养24h后，拍照观察新生隐球菌生长情况。结果如图2所示：与对照组相比，经复合维生素D处理后的新生隐球菌孢子变小，孢子量也有所减少，且随着复合维生素D浓度的增加，抑制效果变得更加明显。

实施例3细胞毒实验

采用CCK-8实验检测复合维生素D(其组分维生素D2与1,25-二羟维生素D3的质量比为1﹕2)对肝癌细胞(HepG2细胞)的细胞毒作用。将生长汇合度90％左右的肝癌细胞弃去培养基，PBS洗涤两次，加入适量胰蛋白酶-EDTA，在含5％CO₂、37℃的潮湿细胞培养箱培养2～3min。待细胞呈饱满椭圆状时，加入适量完全培养基终止消化，离心、去上清、收集细胞。加入适量常规细胞完全培养基，重悬细胞，用吸管轻轻吹打混匀，进行细胞计数，并用常规细胞完全培养基将细胞调整至5×10⁴个/ml，并吹打均匀。将细胞悬液以100μl/孔的量种入96孔板，种植3块板(三个重复)，每块96孔板设置7个给药组和1个空白对照组，每组设置6个复孔，置于37℃并且含5％CO₂的潮湿细胞培养箱中培养。经过24h贴壁培养后，弃去培养基并洗涤细胞2遍，将复合维生素D用相应培养基稀释成不同浓度(0.2mg/ml，0.4mg/ml，0.8mg/ml)，各吸取100μl加入给药组，之后每孔再加入100μl相应培养基(200μl体系)，分别继续培养24H、48H。完成药物干预后，弃去原培养基，每孔加入CCK-8稀释液100μl，并设置6个空孔加入相应培养基，在细胞培养箱中孵育30min，在酶标仪下测量450nm波长的各孔吸光度，即可计算出细胞生存率。结果显示浓度为0.8mg/ml时，细胞生存率>90％,即其毒性可忽略不计。

Claims (9)

1.一种防治真菌感染的复合维生素D，其特征在于：包括功效成分维生素D2和维生素D3。

2.如权利要求1所述的复合维生素D，其特征在于：所述维生素D2和维生素D3的质量比为1～3:1～5。

3.如权利要求1或2所述的复合维生素D，其特征在于：所述维生素D3选自25-羟维生素D3、1,25-二羟维生素D3、24,25-二羟维生素D3中的一种或多种。

4.如权利要求1或2所述的复合维生素D，其特征在于：还包括药剂学上可接受的辅料。

5.如权利要求4所述的复合维生素D，其特征在于：所述辅料包括润湿剂和/或黏合剂。

6.如权利要求5所述的复合维生素D，其特征在于：所述润湿剂为水，所述黏合剂为质量百分比10％的淀粉浆。

7.如权利要求1所述的复合维生素D，其特征在于：所述复合维生素D为膏剂、片剂、注射剂、胶囊剂或颗粒剂。

8.权利要求1至7任一项所述的复合维生素D在制备防治真菌感染的药物中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述真菌为曲霉属真菌或新生隐球菌。

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