CN111979293A - 一种花生籽仁对黄曲霉菌侵染抗性的室内精准鉴定方法 - Google Patents

一种花生籽仁对黄曲霉菌侵染抗性的室内精准鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种花生籽仁对黄曲霉菌侵染抗性的室内精准鉴定方法，包括黄曲霉菌菌株的选择和培养；待鉴定花生籽仁的灭菌和复水；用黄曲霉菌孢子悬浮液接种健康花生籽仁；接种后在花生籽仁在培养箱中暗培养7天；花生籽仁感染程度分级鉴定与感染指数的计算；最后确定花生籽仁对黄曲霉菌的抗性等级。本发明操作简便，使用花生籽仁量少，重复稳定性高，鉴定结果更加精准，更易于分级与鉴定，可以精准、快速的对花生籽仁抗黄曲霉菌侵染的育种材料进行批量筛选，大幅度提高鉴定速度。

Description

一种花生籽仁对黄曲霉菌侵染抗性的室内精准鉴定方法
技术领域
本发明涉及一种花生籽仁对黄曲霉菌侵染抗性的室内精准鉴定方法，属于植物种质鉴定技术领域。
背景技术
黄曲霉菌(Aspergillus flavus L.)侵染花生而导致的黄曲霉菌毒素(Aflatoxin)污染是影响花生食用卫生安全性、限制花生种植及加工产业健康发展的重要因素。随着花生生产效益的提高，我国花生种植面积逐渐扩大，然而花生产后干燥及储藏条件难以保障，花生籽仁的黄曲霉菌毒素污染问题日益突出。培育和种植高抗黄曲霉菌侵染的花生新品种是解决花生黄曲霉菌毒素污染最为经济和有效的方式，然而建立精准、快速的花生籽仁抗黄曲霉菌侵染的鉴定方法极为关键。
现有技术中鉴定花生对黄曲霉浸染的抗性通常采用的方法有，在花生生育后期的干旱处理或者田间接种花生植株，来鉴定花生对黄曲霉菌侵染的抗性，但此方法鉴定周期长，容易对环境造成污染，且耗费大量的人工；也有通过人工接种后检测黄曲霉的含量，其检测方法为薄层色谱法和高效液相色谱法，但其操作复杂、样品检测费用高、对设备要求高，不能有效应用于花生育种研究中的抗性鉴定；还有在人工接种花生籽仁后，称量不同的花生籽仁在侵染前和侵染后的重量，最后计算黄曲霉菌侵染指数并进行抗性评价，此方法虽然简单，但是不同的花生品种被黄曲霉菌侵染后，其含水量、蛋白质、含油量等会出现不同程度的变化，结果误差较大，难以鉴别花生籽仁的抗性水平。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种花生籽仁对黄曲霉菌侵染抗性的室内精准鉴定方法，该方法在较为简单的试验条件下，利用较少数量的花生籽仁，即可精准、快速的对花生籽仁抗黄曲霉菌侵染的育种材料进行批量的筛选，大幅度的提高鉴定速度。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种花生籽仁对黄曲霉菌侵染抗性的室内精准鉴定方法，包括以下步骤：
(1)黄曲霉菌株的选择和培养：选取侵染能力强的黄曲霉菌菌株As.3.4408置于DG-18琼脂培养基中培养，制备黄曲霉菌孢子悬浮液；
(2)待鉴定花生籽仁的灭菌和复水：选取待鉴定品种饱满、种皮完好、无病斑的健康花生籽仁30粒，分装至3个已编号的无菌烧杯中，每个烧杯10个花生籽仁；在生物安全柜内，向每个烧杯中加入体积浓度为75％的酒精溶液，浸泡2min后，倒掉酒精溶液；再向烧杯中加入无菌水冲洗，并浸泡4～6min，重复浸泡3次后，倒掉无菌水，将花生籽仁放入相应编号的无菌培养皿中；
(3)用黄曲霉菌孢子悬浮液接种健康花生籽仁：向所述无菌培养皿中加入步骤(1)所得的黄曲霉菌孢子悬浮液0.5mL，轻轻转动无菌培养皿，使黄曲霉菌孢子能均匀的附着在花生籽仁表面，调整花生籽仁的间隙，使其均匀分布且互不接触；
(4)将接种后的花生籽仁在培养箱中连续暗培养7天；
(5)花生籽仁感染程度分级鉴定与感染指数的计算：按照花生籽仁表面黄曲霉菌孢子的覆盖率，将花生籽仁受侵染程度进行0～5级分级；
(6)确定花生籽仁对黄曲霉菌的抗性等级：根据花生籽仁对黄曲霉菌感染指数的计算结果，将鉴定的花生籽仁材料分为高抗、抗、中抗、中感、感和高感黄曲霉菌6种类型。
所述步骤(1)的培养方法为：在30℃的条件下培养7天后，用经高温灭菌的质量浓度为0.1％的吐温水溶液冲洗，收集分生孢子，并对分生孢子进行重悬，调整孢子浓度为2×106个孢子/mL，得到黄曲霉菌孢子悬浮液。
所述步骤(2)中酒精溶液的加入量为没过花生籽仁2～3cm；3次的浸泡时间依次为4min、5min、6min，冲洗后花生籽仁的含水量为20％～25％。
所述步骤(4)的具体方法为：将已接种黄曲霉菌的花生籽仁连同培养皿一起，置于温度为30℃、相对湿度为90％的恒温恒湿培养箱中，连续暗培养7天。
所述步骤(5)中0～5级具体标准为：
5级：籽仁表面的黄曲霉菌孢子覆盖率81％～100％，花生籽仁的种皮全部呈绿色，有大面积厚实的孢子层；
4级：籽仁表面的黄曲霉菌孢子覆盖率51％～80％，花生籽仁的种皮一半以上呈绿色，厚实的孢子层连成一片；
3级：籽仁表面的黄曲霉菌孢子覆盖率21％～50％，花生籽仁的种皮少部分呈现绿色，有厚实的孢子层；
2级：籽仁表面的黄曲霉菌孢子覆盖率11％～20％，花生籽仁的种皮很少一部分呈绿色，有部分厚实的孢子层；
1级：籽仁表面的黄曲霉菌孢子覆盖率1～10％，花生籽仁的种皮表面有零星绿色孢子；
0级：籽仁表面的黄曲霉菌孢子覆盖率为0，花生籽仁表面未见绿色孢子。
所述步骤(5)中计算花生籽仁黄曲霉菌感染指数R的公式：R＝(0级花生籽仁数×0％+1级花生籽仁数×10％+2级花生籽仁数×20％+3级花生籽仁数×50％+4级花生籽仁数×80％+5级花生籽仁数×100％)×100/调查总花生籽仁数。
所述步骤(6)中花生籽仁对黄曲霉菌的感染指数R为0，鉴定为高抗黄曲霉菌侵染花生种质资源；感染指数为0＜R≤10，鉴定为抗黄曲霉菌侵染花生种质资源；感染指数为10＜R≤25，鉴定为中抗黄曲霉菌侵染花生种质资源；感染指数为25＜R≤50，鉴定为中感黄曲霉菌侵染花生种质资源；感染指数为50＜R≤75，鉴定为感黄曲霉菌侵染花生种质资源；感染指数为75＜R≤100，鉴定为高感黄曲霉菌侵染花生种质资源。
本发明有益效果：
本发明选用具有侵染力强、高产毒的黄曲霉菌菌株As.3.4408为接种用菌株，首次进行花生籽仁的侵染抗性精准鉴定，相比采用其他菌株，选择压力更强，鉴定出来的抗性花生种质在生产上具有更广阔的应用空间。
本发明采用酒精溶液对花生籽仁进行杀菌消毒，与现有的采用NaClO溶液或升汞溶液(消毒时间10min以上)相比，消毒更快，消毒时间仅为2min，且消毒效果好，使用更安全，更加适应于批量进行花生籽仁的侵染抗性精准鉴定。
本发明采用30粒花生籽仁(含3个重复)进行鉴定，重复稳定性高，鉴定结果更加精准，并采用精准的冲洗复水时间，保证花生籽仁侵染时含水量一致，且侵染程度采用0～5级，共6个分级进行，操作简便，相比现有方法，使用花生籽仁量更少，更易于分级与鉴定，可以精准、快速的对花生籽仁抗黄曲霉菌侵染的育种材料进行批量的筛选，大幅度提高了鉴定速度。
本发明针对花生籽仁进行黄曲霉菌侵染抗性的接种鉴定，由于农户或公司常采用脱壳后的花生进行储存，储存籽仁相对于荚果更易于受到黄曲霉菌的侵染与定殖，本发明简洁、省时的鉴定方法具有潜在的应用价值。
附图说明
图1本发明实施例不同抗性花生种质籽仁表面黄曲霉菌孢子覆盖情况。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
实施例
一种花生籽仁对黄曲霉菌侵染抗性的室内精准鉴定方法，包括以下步骤：
(1)黄曲霉菌株的选择和培养：以高产毒、侵染力强的黄曲霉菌菌株As.3.4408为接种用菌株；将黄曲霉菌菌株As.3.4408接种于DG-18琼脂培养基中，在30℃的条件下黑暗培养7天后，用经高温灭菌的质量浓度为0.1％的吐温水溶液冲洗，收集分生孢子，并对分生孢子进行重悬，调整孢子浓度为2×106个孢子/mL，得到黄曲霉菌孢子悬浮液。
(2)待鉴定花生籽仁的灭菌和复水：选择待鉴定品种饱满、种皮完好、无病斑的健康花生籽仁，花生籽仁由河南省农业科学院经济作物研究所提供，其中选择花生种质资源CH19-095、CH19-121、CH19-128、CH19-139、CH19-150、CH19-170、CH19-269、CH19-297、CH19-305、CH19-413、CH19-419、CH19-436、CH19-454、CH19-455、CH456、CH19-457为供试材料，选择高感花生种质资源CH19-356(CK)为对照。
每个种质资源选取30个品种饱满、种皮完好、无病斑的花生籽仁为供试样品，分装至3个已编号的无菌烧杯中，每个烧杯10个花生籽仁，在生物安全柜内向每个烧杯中加入灭菌用体积浓度为75％的酒精溶液，酒精溶液的加入量为没过花生籽仁2～3cm，期间间歇摇动烧杯使花生籽仁表面均匀接触酒精溶液，浸泡灭菌2min后，倒掉酒精溶液；再向烧杯中加入无菌水冲洗，并浸泡4～6min，倒掉多余的无菌水，将花生籽仁放入相应编号的无菌培养皿中；其中花生籽仁冲洗复水的时间应严格控制，无菌水冲洗次数为3次，3次的浸泡时间依次为4min、5min、6min，使花生籽仁冲洗复水后的含水量(质量％)为20％～25％，以利于黄曲霉菌孢子的侵染。
(3)用黄曲霉菌孢子悬浮液接种健康花生籽仁：向上述无菌培养皿中，加入步骤(1)所得的黄曲霉菌孢子悬浮液0.5mL，轻轻转动无菌培养皿，使孢子能均匀的附着在花生籽仁表面，调整花生籽仁的间隙，使其均匀分布且互不接触。
(4)将接种后的花生籽仁在培养箱中连续暗培养7天：将已接种黄曲霉菌的花生籽仁连同培养皿一起，置于温度为30℃，相对湿度为90％的恒温恒湿培养箱中，连续暗培养7天。
(5)花生籽仁感染程度分级鉴定与感染指数的计算：按照花生籽仁表面黄曲霉菌孢子覆盖率，将花生籽仁受侵染程度进行0～5级分级；
5级：籽仁表面的黄曲霉菌孢子覆盖率81％～100％，花生籽仁的种皮全部呈绿色，有大面积厚实的孢子层；
4级：籽仁表面的黄曲霉菌孢子覆盖率51％～80％，花生籽仁的种皮一半以上呈绿色，厚实的孢子层连成一片；
3级：籽仁表面的黄曲霉菌孢子覆盖率21％～50％，花生籽仁的种皮少部分呈现绿色，有厚实的孢子层；
2级：籽仁表面的黄曲霉菌孢子覆盖率11％～20％，花生籽仁的种皮很少一部分呈绿色，有部分厚实的孢子层；
1级：籽仁表面的黄曲霉菌孢子覆盖率1～10％，花生籽仁的种皮表面有零星绿色孢子；
0级：籽仁表面的黄曲霉菌孢子覆盖率为0，花生籽仁表面未见绿色孢子。花生籽仁黄曲霉菌感染指数R的公式：R＝(0级花生籽仁数×0％+1级花生籽仁数×10％+2级花生籽仁数×20％+3级花生籽仁数×50％+4级花生籽仁数×80％+5级花生籽仁数×100％)×100/调查总花生籽仁数。
如CH19-297的01号培养皿中的花生籽仁感染等级对应的花生籽仁数：0级5个，1级4个，2级0个，3级1个，4级0个，5级0个。所有供试花生籽仁均按该方法记录，按照花生籽仁黄曲霉菌感染指数R计算公式，分别计算每个供试材料的感染指数R。如CH19-297的01号样品，将每个等级的病果数和其对应等级的代表值代入公式计算感染指数R，则CH19-297的01号样品的R＝(5×0％+4×10％+0×20％+1×50％+0×80％+0×100％)×100/10＝9.00(结果见表1)。
(6)确定籽仁对黄曲霉菌的抗性等级：根据花生籽仁黄曲霉菌感染指数的计算结果，将鉴定的花生籽仁材料分为高抗、抗、中抗、中感、感和高感黄曲霉菌6种类型；
其中花生籽仁对黄曲霉菌感染指数为0，鉴定为高抗黄曲霉菌侵染花生种质资源；感染指数(0＜R≤10)，鉴定为抗黄曲霉菌侵染花生种质资源；感染指数(10＜R≤25)，鉴定为中抗黄曲霉菌侵染花生种质资源；感染指数(25＜R≤50)，鉴定为中感黄曲霉菌侵染花生种质资源；感染指数(50＜R≤75)，鉴定为感黄曲霉菌侵染花生种质资源；感染指数(75＜R≤100)，鉴定为高感黄曲霉菌侵染花生种质资源。
表1 花生籽仁抗性鉴定结果
Figure BDA0002654439430000051
Figure BDA0002654439430000061
上述实施例为本发明较优的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他任何未背离本发明的精神实质下所作的简化、替代、组合、改变、修饰，均应为等效的置换方式，均包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种花生籽仁对黄曲霉菌侵染抗性的室内精准鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)黄曲霉菌株的选择和培养：选取侵染能力强的黄曲霉菌菌株As.3.4408置于DG-18琼脂培养基中培养，制备黄曲霉菌孢子悬浮液；
(2)待鉴定花生籽仁的灭菌和复水：选取待鉴定品种饱满、种皮完好、无病斑的健康花生籽仁30粒，分装至3个已编号的无菌烧杯中，每个烧杯10个花生籽仁；在生物安全柜内，向每个烧杯中加入体积浓度为75％的酒精溶液，浸泡2min后，倒掉酒精溶液；再向烧杯中加入无菌水冲洗，并浸泡4～6min，重复浸泡3次后，倒掉无菌水，将花生籽仁放入相应编号的无菌培养皿中；
(3)用黄曲霉菌孢子悬浮液接种健康花生籽仁：向所述无菌培养皿中加入步骤(1)所得的黄曲霉菌孢子悬浮液0.5mL，轻轻转动无菌培养皿，使黄曲霉菌孢子能均匀的附着在花生籽仁表面，调整花生籽仁的间隙，使其均匀分布且互不接触；
(4)将接种后的花生籽仁在培养箱中连续暗培养7天；
(5)花生籽仁感染程度分级鉴定与感染指数的计算：按照花生籽仁表面黄曲霉菌孢子的覆盖率，将花生籽仁受侵染程度进行0～5级分级；
(6)确定花生籽仁对黄曲霉菌的抗性等级：根据花生籽仁对黄曲霉菌感染指数的计算结果，将鉴定的花生籽仁材料分为高抗、抗、中抗、中感、感和高感黄曲霉菌6种类型。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)的培养方法为：在30℃的条件下培养7天后，用经高温灭菌的质量浓度为0.1％的吐温水溶液冲洗，收集分生孢子，并对分生孢子进行重悬，调整孢子浓度为2×106个孢子/mL，得到黄曲霉菌孢子悬浮液。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中酒精溶液的加入量为没过花生籽仁2～3cm；3次的浸泡时间依次为4min、5min、6min，冲洗后花生籽仁的含水量为20％～25％。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)的具体方法为：将已接种黄曲霉菌的花生籽仁连同培养皿一起，置于温度为30℃、相对湿度为90％的恒温恒湿培养箱中，连续暗培养7天。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中0～5级具体标准为：
5级：籽仁表面的黄曲霉菌孢子覆盖率81％～100％，花生籽仁的种皮全部呈绿色，有大面积厚实的孢子层；
4级：籽仁表面的黄曲霉菌孢子覆盖率51％～80％，花生籽仁的种皮一半以上呈绿色，厚实的孢子层连成一片；
3级：籽仁表面的黄曲霉菌孢子覆盖率21％～50％，花生籽仁的种皮少部分呈现绿色，有厚实的孢子层；
2级：籽仁表面的黄曲霉菌孢子覆盖率11％～20％，花生籽仁的种皮很少一部分呈绿色，有部分厚实的孢子层；
1级：籽仁表面的黄曲霉菌孢子覆盖率1～10％，花生籽仁的种皮表面有零星绿色孢子；
0级：籽仁表面的黄曲霉菌孢子覆盖率为0，花生籽仁表面未见绿色孢子。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中计算花生籽仁黄曲霉菌感染指数R的公式：R＝(0级花生籽仁数×0％+1级花生籽仁数×10％+2级花生籽仁数×20％+3级花生籽仁数×50％+4级花生籽仁数×80％+5级花生籽仁数×100％)×100/调查总花生籽仁数。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(6)中花生籽仁对黄曲霉菌的感染指数R为0，鉴定为高抗黄曲霉菌侵染花生种质资源；感染指数为0＜R≤10，鉴定为抗黄曲霉菌侵染花生种质资源；感染指数为10＜R≤25，鉴定为中抗黄曲霉菌侵染花生种质资源；感染指数为25＜R≤50，鉴定为中感黄曲霉菌侵染花生种质资源；感染指数为50＜R≤75，鉴定为感黄曲霉菌侵染花生种质资源；感染指数为75＜R≤100，鉴定为高感黄曲霉菌侵染花生种质资源。
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