CN111971394A - 嵌合抗原受体的肿瘤环境特异性表达 - Google Patents

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Abstract

一种肿瘤微环境(TME)响应性表达载体，其包含编码合成的启动子的核酸序列和编码免疫效应物基因诸如嵌合抗原受体的核酸序列，所述合成的启动子包含一个或更多个启动子响应元件。TME响应性载体被设计成诱导免疫效应物基因在TME内而非正常健康组织中表达，从而聚焦免疫活性、增加安全性并降低靶点非肿瘤效应(ON‑target OFF‑tumor)的风险。

Description

嵌合抗原受体的肿瘤环境特异性表达
发明领域
本公开内容一般涉及嵌合抗原受体(CAR)表达的领域，具体涉及肿瘤组织特异性CAR表达。
背景
近年来，利用免疫系统消除癌症已被证明非常有效。
一个实例是工程化免疫细胞，诸如嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)，其在显示出关于消除没有其他有效疗法的恶性肿瘤的能力方面的杰出结果后被FDA批准用于治疗多种癌症。
然而，尽管表达CAR的免疫细胞可以到达肿瘤以及遍及患者体内的转移瘤，工程化受体的特异性不允许完全区分肿瘤细胞与正常细胞(仅有少数例外)，因为肿瘤通常不具有未被体内的一些正常细胞表达的绝对独特的抗原。因此，若干种CAR治疗引起类似于GVHD的毒性免疫应答，以及甚至在临床试验期间由CAR治疗导致的死亡。
已经进行了在工程化免疫细胞内实现CAR的非组成型表达的尝试。一个实例包括通过利用仅在外源提供的分子(诸如四环素/多西环素)存在下活化的启动子，在CAR表达载体中应用“开启-关闭(ON-OFF)开关”。尽管允许在不良症状明显的情况下关闭CAR表达，但这种方法也关闭了CAR T细胞针对肿瘤细胞的正向活性，并且从而终止有效的CAR治疗。
因此，对降低CAR表达的威胁生命的“副作用”的风险同时允许有效消除肿瘤的受控制的CAR表达仍存在未被满足的需求。
概述
描述了以下实施方案及其方面并结合组合物和方法来说明，这些组合物和方法意为示例性和说明性的，而不限制范围。在多种实施方案中，一种或更多种上述问题被减少或消除，而其他实施方案涉及其他优点或改进。
根据一些实施方案，提供了用于在肿瘤微环境响应性启动子(任选地与tet响应回路联合)的控制下调控效应物基因表达的新平台。
该平台包含肿瘤环境(TME)响应性表达载体，该肿瘤环境(TME)响应性表达载体包含编码合成的启动子的核酸序列，该合成的启动子包含一个或更多个TME依赖性启动子响应元件(response element)；与效应物基因，诸如但不限于编码效应物基因(例如CAR)的核酸序列缀合。
有利地，TME响应性载体被设计成使得TME中存在的一种或更多种因子与启动子响应元件的结合直接或间接诱导通过该启动子的表达。在TME因子结合不存在的情况下，启动子表达在每个工程化细胞内被自动下调。这有利地确保了在不同于肿瘤的组织环境的组织环境中存在效应物机制诸如CAR的最低表达至无表达；而在肿瘤环境中，效应物机制诸如CAR的表达被上调，并在使正常组织不受伤害的同时指导针对肿瘤的活性。
根据一些实施方案，表达载体可以包含多于一种TME依赖性启动子响应元件。这可以用于确保最高表达水平仅在TME因子的特定组合存在的情况下获得。
有利地，我们还可以任选地将合成的启动子替代/改变为定制的启动子，使得被配置为活化启动子的一个或更多个TME依赖性启动子响应元件将适合特定患者或患者组的实际TME特征，从而确保最特异且有效的响应。
根据一些实施方案，提供了肿瘤微环境(TME)响应性表达载体，其包含编码合成的启动子的核酸序列，所述启动子包含一个或更多个TME依赖性启动子响应元件(PRE)；和编码效应物基因的核酸序列；其中所述TME响应性表达载体被设计成使得TME中存在的一种或更多种TME因子与启动子响应元件的结合诱导效应物基因的表达，并且其中在一种或更多种TME因子与启动子响应元件的结合不存在的情况下，低的效应物基因被表达或基本上没有效应物基因被表达。
根据一些实施方案，CAR是嵌合抗原T细胞受体(CAR-T)、嵌合抗原自然杀伤(NK)细胞受体(CAR-NK)、嵌合先天受体(innate receptor)、其他免疫效应物包括但不限于细胞因子、趋化因子、趋化因子受体、蛋白酶、微小RNA或其组合。
根据一些实施方案，启动子响应元件包括选自由以下组成但不限于以下的列表的一个或更多个响应元件：干扰素-γ(IFN-γ)响应元件、核因子κ-B(NF-κB)响应元件、低氧响应元件、IL-6响应元件、热休克蛋白(Heat shock protein)70(HSP-70)响应元件、IL-1响应元件、IL-4响应元件、IL-6响应元件、IL-8响应元件、IL-10响应元件、IL-11响应元件、IL-12响应元件、IL-15响应元件、IL-18响应元件、IL-17响应元件、IL-21响应元件、IL-35响应元件、TGF-β响应元件、GM-CSF响应元件、肝生长因子(Hepatic Growth Factor；HGF)响应元件、芳基氢受体(AhR)响应元件、PGE2响应元件或任何其他合适的TME因子响应元件或其组合。
根据一些实施方案，启动子响应元件包括选自由以下组成但不限于以下的列表的一个或更多个响应元件：干扰素-γ(IFN-γ)响应元件、核因子κ-B(NF-κB)响应元件、低氧响应元件、IL-1响应元件、IL-6响应元件、IL-8响应元件、IL-11响应元件、IL-12响应元件、IL-15响应元件、IL-18响应元件、IL-17响应元件、IL-21响应元件、TGF-β响应元件、GM-CSF响应元件、肝生长因子(HGF)响应元件、芳基氢受体(AhR)响应元件或任何其他合适的TME因子响应元件或其组合。
根据一些实施方案，启动子响应元件包括选自由以下组成但不限于以下的列表的一个或更多个响应元件：干扰素-γ(IFN-γ)响应元件、核因子κ-B(NF-κB)响应元件、低氧响应元件、IL-6响应元件、热休克蛋白70(HSP-70)响应元件或任何其他合适的TME因子响应元件或其组合。
根据一些实施方案，启动子响应元件可以以有义(5'至3')或反义(3'至5')方向插入合成的启动子中。
根据一些实施方案，启动子响应元件包括选自由以下组成的组的核酸：SEQ IDNO.1中列出的TTCCGGGAA、SEQ ID NO.2中列出的GGGAATTTCC、SEQ ID NO.3中列出的GACCTTGAGTACGTGCGTCTCTGCACGTATG、SEQ ID NO.4中列出的GCGCTTCCTGACAGTGACGCGAGCCG、GCGCTTCCTGACAGTGACGCGAGCCG或其任何组合。
根据一些实施方案，启动子响应元件包括选自由以下组成的组的核酸：
Figure BDA0002724598660000041
>在SEQ ID NO:22中列出、
Figure BDA0002724598660000042
>在SEQ ID NO:23中列出、
Figure BDA0002724598660000043
>在SEQ ID NO:24中列出、
Figure BDA0002724598660000044
>在SEQ ID NO:25中列出、
Figure BDA0002724598660000051
>在SEQ ID NO:26中列出、
Figure BDA0002724598660000052
>在SEQ ID NO:27中列出、
Figure BDA0002724598660000053
>在SEQ ID NO:28中列出、
Figure BDA0002724598660000054
>在SEQ ID NO:29中列出、
Figure BDA0002724598660000055
>在SEQ ID NO:30中列出、
Figure BDA0002724598660000061
>在SEQ ID NO:31中列出、
Figure BDA0002724598660000062
>在SEQ ID NO:32中列出、
Figure BDA0002724598660000063
>在SEQ ID NO:33中列出、
Figure BDA0002724598660000064
>在SEQ ID NO:34中列出、
Figure BDA0002724598660000065
>在SEQ ID NO:35中列出、
Figure BDA0002724598660000071
>在SEQ ID NO:36中列出、
Figure BDA0002724598660000072
>在SEQ ID NO:37中列出、
Figure BDA0002724598660000073
>在SEQ ID NO:38中列出、
Figure BDA0002724598660000075
>在SEQ ID NO:39中列出、
Figure BDA0002724598660000074
>在SEQ ID NO:40中列出或其组合。每种可能性是单独的实施方案。
根据一些实施方案，启动子响应元件包含选自SEQ ID No 1-4中列出的核酸序列的核酸或其任何组合。每种可能性是单独的实施方案。
根据一些实施方案，启动子响应元件包含选自SEQ ID No 22-40中列出的核酸序列的核酸或其任何组合。每种可能性是单独的实施方案。
根据一些实施方案，启动子响应元件包含核酸序列：
Figure BDA0002724598660000081
>在SEQ ID NO:41中列出，其中Y＝C或T，S＝C或G，并且R＝A或G。
根据一些实施方案，一种或更多种TME因子包括肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IFN-γ、IL-6、HSP-70或其任何组合。
根据一些实施方案，合成的启动子包含在启动子响应元件侧翼和/或在启动子响应元件之间间隔的另外的核苷酸。
根据一些实施方案，启动子响应元件包括任何以下响应元件中的一个或更多个响应元件：已在一个或更多个位置上进行修饰的IFN-γ响应元件、NF-κB响应元件、低氧蛋白响应元件、HSP-70响应元件、IL-1响应元件、IL-4响应元件、IL-6响应元件、IL-8响应元件、IL-10响应元件、IL-11响应元件、IL-12响应元件、IL-15响应元件、IL-18响应元件、IL-17响应元件、IL-21响应元件、TGF-β响应元件、GM-CSF响应元件、肝生长因子(HGF)响应元件、芳基氢受体(AhR)响应元件、PGE2响应元件(有义或反义)。
根据一些实施方案，修饰产生相对于天然序列具有增加的TME因子结合的序列。
作为非限制性实例，合成的启动子可以包含来源于多种低氧依赖性靶基因(LDHA/EPO/VEGF)的低氧蛋白的响应元件(或其他TME因子响应元件)，诸如LDHA/EPO/VEGF的HBS序列和/或EPO基因的HAS序列的共有部分，以及不存在于靶基因中的约6-9个核苷酸的接头。该序列被称为“基础低氧启动子响应元件(PRE)”，如以下SEQ ID NO.42中列出的。
Figure BDA0002724598660000091
根据一些实施方案，基础TME因子启动子(此处为基础低氧PRE)可以被添加在合成的启动子序列的3'处、5'处或中间。根据一些实施方案，基础TME因子PRE可以以5'-3'取向或翻转(flip)的3'-5'取向插入。根据一些实施方案，合成的启动子可以包含基础TME因子PRE的修饰的形式。修饰的基础低氧PRE的非限制性实例在SEQ ID 43：
>RCGTGSCTGGAGTMACAGTCCTCTTRCGTGSCTGGAGTMACAG TCCTCTT中列出，其中R＝A或G，S＝C或G，并且M＝A或C。
根据一些实施方案，修饰的TME因子PRE是合成的PRE，该合成的PRE诱导较少的渗漏(leakiness)和对低氧刺激的最高响应。
修饰的IFN-γPRE的非限制性实例在SEQ ID 44：
>ACTTCCSGGAARTAGGGTGGGCAAGTACTTCCSGGAART中，其中列出，R＝A或G，并且S＝C或G。
修饰的NF-κB PRE的非限制性实例在SEQ ID 45：
>GGGGGTTTYCGGGGACTTTCCGGRRRTTTT中列出，其中R＝A或G并且Y＝C或T。
根据一些实施方案，启动子响应元件包含两个或更多个启动子响应元件；并且其中TME因子与两个或更多个TME依赖性启动子响应元件的结合比与单一TME依赖性启动子响应元件的结合诱导更高的效应物基因表达水平。
根据一些实施方案，TME响应性表达载体还包含外部诱导型启动子和反式激活因子(trans-activator)。根据一些实施方案，合成的启动子驱动反式激活因子的表达，并且外部诱导型启动子驱动效应物基因的表达。根据一些实施方案，诱导物和TME因子的组合存在诱导效应物基因的表达。根据一些实施方案，在外部诱导物存在且TME因子不存在的情况下，基本上没有检测到效应物基因表达。根据一些实施方案，当TME因子在外部诱导物不存在的情况下结合启动子响应元件时，基本上没有检测到效应物基因表达。
根据一些实施方案，诱导型启动子是Tet响应元件启动子，并且外部诱导物是多西环素和/或四环素。
根据一些实施方案，效应物基因可以是但不限于CAR，所述CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和含有共刺激结构域和/或初级信号传导结构域的胞内结构域，其中所述抗原结合结构域与肿瘤抗原结合。
根据一些实施方案，CAR可以选自由以下组成的组：CAR；趋化因子受体；细胞因子受体；促进免疫效应细胞穿入肿瘤中的蛋白(或功能性RNA)，诸如但不限于蛋白酶MMP8/9；抑制免疫抑制物诸如但不限于PD1和/或CTLA4的miRNA；导致肿瘤内免疫细胞保留的细胞因子，诸如但不限于CXCL9/10和/或CXCR3配体或任何其他合适的在TME中的特异性表达谱是期望的效应物基因。
根据一些实施方案，载体选自DNA载体、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体或其他用于将合成的构建体引入免疫细胞中的载体。
根据一些实施方案，TME响应性表达载体还包含编码促进免疫效应细胞穿入肿瘤中的蛋白(或功能性RNA)诸如但不限于蛋白酶MMP8/9的效应物基因。
根据一些实施方案，TME响应性表达载体还包含一种或更多种编码抑制肿瘤内的免疫抑制物诸如但不限于PD1和/或CTLA4的miRNA的效应物基因。
根据一些实施方案，TME响应性表达载体还包含一种或更多种编码导致肿瘤内免疫细胞保留的细胞因子诸如但不限于CXCL9/10和/或CXCR3配体的效应物基因，从而产生自分泌环(autocrine loop)。
根据一些实施方案，提供了一种免疫效应细胞，该免疫效应细胞包含载体，该载体包含编码合成的启动子的核酸序列和编码嵌合抗原受体的核酸序列，该合成的启动子包含一个或更多个TME依赖性启动子响应元件，如本文基本上描述的。根据一些实施方案，TME响应性载体被设计成使得TME中存在的一种或更多种因子与启动子响应元件的结合直接或间接诱导效应物基因的表达，并且其中，在TME因子与启动子响应元件的结合不存在的情况下，基本上没有嵌合抗原受体被表达或低的/残留的嵌合抗原受体被表达。
根据一些实施方案，免疫效应细胞适于用作药物。根据一些实施方案，免疫效应细胞适用于治疗有相应需要的患者的肿瘤。根据一些实施方案，肿瘤是实体瘤。根据一些实施方案，实体瘤是肉瘤、癌(carcinomas)或淋巴瘤。根据一些实施方案，实体瘤是肺肿瘤、黑素瘤、结肠癌、乳腺肿瘤或脑肿瘤。
根据一些实施方案，提供了一种用于治疗有相应需要的患者的癌症的方法，该方法包括施用包含如本文基本上描述的表达载体的免疫细胞。
根据一些实施方案，提供了一种用于筛选患者以确定最佳的合成的启动子的方法，该方法包括获得患者肿瘤的活检物，确定活检物中一种或更多种TME因子的表达水平；以及选择TME响应性表达载体，所述TME响应性表达载体具有与确定的活检物中一种或更多种TME因子的表达水平相匹配的TME依赖性启动子响应元件。
根据一些实施方案，提供了一种用于筛选活检物以确定最佳的合成的启动子的方法，该方法包括确定活检物中一种或更多种TME因子的表达水平；以及选择TME响应性表达载体，所述TME响应性表达载体具有与确定的活检物中一种或更多种TME因子的表达水平相匹配的TME依赖性启动子响应元件。
根据一些实施方案，TME可以由肿瘤细胞和/或非肿瘤TME细胞表达。
根据一些实施方案，方法还包括将选择的TME响应性表达载体引入免疫细胞中。
根据一些实施方案，免疫效应细胞或细胞群体可以包括但不限于T细胞和/或自然杀伤(NK)细胞。
根据一些实施方案，免疫效应细胞或细胞群体是患者自体的。
根据一些实施方案，免疫效应细胞/细胞群体是在治疗之前从患者分离的。
根据一些实施方案，方法还包括将免疫效应细胞或细胞群体施用至患者。
本公开内容的某些实施方案可以包括上述一些优点、上述所有优点或不包括上述优点。根据本文包括的附图、说明书和权利要求书，一种或更多种技术优点对本领域技术人员来说可以是明显的。此外，虽然上文已经列举了具体的优点，但是多种实施方案可以包括所有列举的优点、一些列举的优点或不包括列举的优点。
除了上文描述的示例性方面和实施方案以外，通过参考附图和研究以下详细描述，另外的方面和实施方案将变得明显。
附图简述
现在将参考以下说明性附图，结合某些实例和实施方案来描述本发明。
图1示意性说明了包含直接控制报告物基因和/或CAR基因表达的合成的启动子的表达构建体；
图2示意性说明了包含间接控制报告物基因和/或CAR基因表达的合成的启动子的表达构建体；
图3是用于筛选启动子文库的方法的说明性流程图，所述方法针对肿瘤微环境(TME)提供最佳的报告物基因和/或CAR基因表达；
图4A示出了代表性直方图，其描绘了在TME因子和/或多西环素存在和不存在的情况下用图2的表达慢病毒构建体(w.GFP报告物)转导的293T HEK细胞中的GFP强度(上图)和GFP阳性细胞的百分比(下图)，该表达慢病毒构建体包含指示的TME响应元件(G和K)；
图4B示出了用于图3A的代表性重复的代表性FACS图。
图5示出了对在TME因子和/或多西环素存在和不存在的情况下用图2的表达构建体(w.GFP报告物)转染的GFP阳性293T HEK细胞进行门控的代表性FACS图，该表达构建体包含指示的TME响应元件(G和K)；
图6示出了在TME因子和/或多西环素存在和不存在的情况下，对用图2的表达构建体(w.GFP报告物)转染的GFP阳性293T HEK细胞内的报告物强度进行定量的代表性直方图，该表达构建体包含指示的TME响应元件(G和K)；
图7示出了在TME因子和/或多西环素存在和不存在的情况下，对用图2的表达构建体(w.GFP报告物)转染的GFP阳性293T HEK细胞内的报告物强度进行定量的代表性直方图，该表达构建体包含指示的TME响应元件(G、K、J和H)；
图8示出了用于鉴定和分选具有期望的最佳报告物基因表达谱的细胞的示例性FACS分选结果。
详细描述
在以下描述中，将描述本公开内容的多个方面。为了说明的目的，列出具体配置和细节以提供对本公开内容的不同方面的透彻理解。然而，对本领域技术人员还将明显的是，本公开内容可在没有本文呈现的具体细节的情况下实践。此外，熟知的特征可被省略或简化以不使本公开内容晦涩。
定义
除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
术语“一(a)”和“一(an)”是指一个或多于一个(即至少一个)该冠词的语法对象。举例来说，“要素(an element)”意指一个要素或多于一个要素。
当述及可测量的值诸如量、时间长度(temporal duration)及类似值时，术语“约”意指涵盖从指定的值的±20％，或在一些情况下±10％，或在一些情况下±5％，或在一些情况下±1％，或在一些情况下±0.1％的变化，因为这样的变化适于进行所公开的方法。
术语“嵌合抗原受体”或可选地“CAR”是指重组多肽构建体，其至少包含胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞质信号传导结构域(本文中也称为“胞内信号传导结构域”)，该胞质信号传导结构域包含如下定义的来源于刺激分子的功能信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR多肽构建体中的结构域在同一多肽链中，例如，包括嵌合融合蛋白。在一些实施方案中，CAR多肽构建体中的结构域彼此不连续，例如，在不同的多肽链中。根据一些实施方案，CAR可以广义地指由免疫细胞表达并对靶癌细胞具有细胞毒性作用的任何部分，即活化靶上的死亡受体的配体。
术语“肿瘤环境”、“肿瘤微环境”和“TME”可以互换使用，并且指肿瘤存在的细胞环境，包括周围血管、免疫细胞、成纤维细胞、骨髓来源的炎症细胞、淋巴细胞、信号传导分子和胞外基质(ECM)。
术语“抗原”是指引发免疫应答的分子。这种免疫应答可涉及抗体产生，或特异性免疫活性细胞(immunologically-competent cell)的活化，或两者。技术人员将理解，任何大分子，包括几乎所有的蛋白或肽，都可以用作抗原。此外，本领域技术人员将理解，抗原不必仅由基因的全长核苷酸序列编码。明显的是，本发明包括但不限于多于一个基因的部分核苷酸序列的使用，并且这些核苷酸序列以多种组合布置，以编码引发所期望的免疫应答的多肽。明显的是，抗原可以合成产生或来源于生物样品，或者可以是除多肽之外的大分子。这样的生物样品可以包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或具有其他生物组分的流体。
术语“抗肿瘤效应”是指可以通过包括但不限于以下的多种方式体现的生物学效应：例如肿瘤体积的减少、肿瘤细胞数目的减少、转移数目的减少、预期寿命的增加、肿瘤细胞增殖的减少、肿瘤细胞存活率的减少或与癌性状况相关的多种生理症状的改善。
术语“自体的”是指来源于同一个体的随后将被重新引入该个体的任何材料。术语“同种异体的”是指来源于与材料被引入的个体不同的个体的任何材料。
术语“保守序列修饰”是指不会显著影响或改变因子与其结合特性的氨基酸修饰。这样的保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。
如本文使用的，术语“免疫效应细胞”是指参与免疫应答的细胞。实例包括多种类型和亚型的T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、先天淋巴细胞(ILC)、自然杀伤T(NKT)细胞、肥大细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。
术语“表达”是指由启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。表达载体包括本领域已知的所有表达载体，包括掺入有重组核苷酸序列的黏粒、质粒、附加体、转座子和病毒(例如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
如本文使用的，术语“TME响应性表达载体”是指被配置为在构成、定义或以其他方式与肿瘤环境相关的因子存在下表达基因产物的表达载体。
如本文使用的，术语“启动子”是指由细胞的合成机制(synthetic machinery)或引入的合成机制识别的、启动多核苷酸序列特异性转录所需的DNA序列。
如本文使用的，术语“启动子/调控序列”和“启动子响应元件(PRE)”可以互换使用，并且指表达与启动子/调控序列可操作地连接的基因产物所需的核酸序列。如本文使用的，术语“TME因子”是指在TME中存在并具有活性的因子，诸如但不限于细胞因子、转录因子等。如本文使用的，术语“与TME相关因子关联的PRE”是指在TME相关因子的分泌作用(excreted effect)后被活化的PRE。例如，“低氧PRE”是指在TME中低氧后活化的PRE。“IFN-γPRE”是指在TME中IFN-γ存在后被活化的PRE。在一些情况下，该序列可以是核心启动子序列，并且在其他情况下，该序列也可以包含基因产物表达所需的增强子序列和其他调控元件。启动子/调控序列可以是例如以组织特异性方式表达基因产物的序列。
如本文使用的，术语“组成型”启动子是指当与编码基因产物的多核苷酸可操作地连接时，在细胞的大部分或所有生理条件下引起细胞中产生基因产物的核苷酸序列。
如本文使用的，术语“诱导型”启动子是指当与编码基因产物的多核苷酸可操作地连接时，仅当存在诱导物时才引起基因产物实质上增加的核苷酸序列。“诱导”可以包括表达从关闭(OFF)状态到开启(ON)状态的启动，以及表达从相对低到相对高的增强两者。
如本文使用的，术语“TME特异性启动子”、“TME诱导型启动子”和“TME响应性启动子”可以互换使用，并且指在TME内引起基因产物诱导的核苷酸序列。
如本文使用的，术语“合成的启动子”是指与天然存在的启动子的克隆相对的人工合成的DNA序列。
术语“癌症相关抗原”和“肿瘤抗原”可以互换使用，并且在癌细胞表面表达的完整或作为片段的分子(通常是蛋白、糖类或脂质)，并且其可用于将药剂优先靶向癌细胞。在一些实施方案中，肿瘤抗原是正常细胞和癌细胞两者都表达的标志物。在一些实施方案中，肿瘤抗原是与正常细胞相比在癌细胞中过表达的细胞表面分子，例如，与正常细胞相比1倍过表达、2倍过表达、3倍过表达或更多过表达。在一些实施方案中，肿瘤抗原是癌细胞中不适当合成的细胞表面分子，例如，与在正常细胞上表达的分子相比，含有缺失、添加或突变的分子。
如本文使用的，术语“治疗”是指减少或改善增殖性紊乱的进展、严重程度和/或持续时间，或改善由治疗导致的增殖性紊乱的一种或更多种症状(优选地一种或更多种可辨别的症状)。在其他实施方案中，该术语是指抑制增殖性紊乱的进展。在其他实施方案中，该术语是指肿瘤尺寸或癌细胞计数的减少或稳定。术语“转染的”是指外源核酸藉以转移或引入到宿主细胞中的过程。细胞包括原代受试细胞及其后代。
术语“特异性结合”和“结合”是指识别和结合关联(cognate)核酸序列的因子，诸如转录因子。
如本文使用，关于在非肿瘤环境中(即在健康组织中)不存在基因表达的术语“实质上”和“基本上”，可以包括无表达水平或仅残留表达水平。根据一些实施方案，基本上无表达(诸如在健康组织中基本上无表达)可以指针对正常健康组织生物学/功能无效的水平的表达水平，而在TME内诱导有效水平。
范围：贯穿本公开内容，本发明的多个方面可以以范围格式呈现。应当理解，以范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应当被解释为对本发明的范围的僵化限制。因此，范围的描述应当被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及在该范围内的单个数值。例如，诸如从1至6的范围的描述应当被认为已经具体地公开了诸如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等的子范围，以及该范围内的单个数值例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。作为另一个实例，诸如95-99％同一性的范围包括具有95％、96％、97％、98％或99％同一性的事物，并且包括诸如96-99％、96-98％、96-97％、97-99％、97-98％和98-99％同一性的子范围。无论范围的宽度如何，这都适用。
描述
根据一些实施方案，提供了一种肿瘤环境(TME)响应性表达载体，其包含编码合成的启动子的核酸序列和编码嵌合抗原受体的核酸序列，所述合成的启动子包含一个或更多个TME依赖性启动子响应元件。TME响应性载体被设计成使得TME中存在的一种或更多种因子与启动子响应元件的结合直接或间接诱导效应物基因诸如CAR的表达。
应当理解，可以在包含更少的响应元件使得可以利用相同的TME响应性表达构建体靶向广谱的癌症和包含更全面的响应元件的组合以相对于正常组织增加表达构建体对肿瘤组织的特异性之间进行权衡(trade-off)。
根据一些实施方案，CAR是嵌合抗原T细胞受体(CAR-T)或嵌合抗原自然杀伤(NK)细胞受体(CAR-NK)。
根据一些实施方案，启动子响应元件包括/涵盖一个或更多个干扰素-γ(IFN-γ,G)-响应元件/结合位点、一个或更多个核因子κB(NF-κB,K)-响应元件/结合位点、一个或更多个热休克蛋白70(HSP-70)响应元件/结合位点、一个或更多个低氧(H)响应元件/结合位点、一个或更多个白细胞介素6(IL-6,J)响应元件/结合位点或其任何组合。每种可能性是单独的实施方案。
根据一些实施方案，一种或更多种TME因子可以包括肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IFN-γ、IL-6、HSP-70和/或能够诱导相似活化途径的等同物，或其任何组合。
根据一些实施方案，启动子响应元件包括两个或更多个启动子响应元件/结合位点。根据一些实施方案，两个或更多个启动子响应元件/结合位点可以相同或不同。作为非限制性实例，两个或更多个启动子响应元件/结合位点可以包括两个或更多个NF-κB响应元件/结合位点。作为另一种非限制性实例，两个或更多个启动子响应元件/结合位点可以包括NF-κB响应元件/结合位点和IFN-γ响应元件/结合位点。根据一些实施方案，TME因子与两个或更多个TME依赖性启动子响应元件的结合比与单一TME依赖性启动子响应元件的结合诱导更高的CAR表达水平。作为非限制性实例，根据一些实施方案，NF-κB与启动子的NF-κB响应元件/结合位点的结合和TNF-α与启动子的IFN-γ响应元件/结合位点的结合可以比单独的NF-κB或TNF-α的结合诱导更高的CAR表达。
根据一些实施方案，启动子响应元件包含选自由以下组成的组的核酸：SEQ IDNO.1中列出的TTCCGGGAA(本文缩写为G)、SEQ ID NO.2中列出的GGGAATTTCC(本文缩写为K)、SEQ ID NO.3中列出的GACCTTGAGTACGTGCGTCTCTGCACGTATG(本文缩写为H)、SEQ IDNO.4中列出的GCGCTTCCTGACAGTGACGCGAGCCG(本文缩写为J)或其任何组合。每种可能性是单独的实施方案。作为非限制性实例，启动子响应元件包含两个SEQ ID NO.1中列出的核酸序列TTCCGGGAA(缩写为G2)。作为另一种非限制性实例，启动子响应元件包含SEQ ID NO.1中列出的核酸序列TTCCGGGAA和SEQ ID NO.2中列出的核酸序列GGGAATTTCC两者(缩写为G1K1)。根据一些实施方案，核酸可以是共延伸的(coextensive)。作为非限制性实例，SEQID NO.3中列出的核酸序列GACCTTGAGTACGTGCGTCTCTGCACGTATG之后紧接着的可以是SEQID NO.4中列出的核酸序列GCGCTTCCTGACAGTGACGCGAGCCG(缩写为H1J1)。根据一些实施方案，核酸可以被间隔区序列分开。作为非限制性实例，SEQ ID NO.1中列出的核酸序列TTCCGGGAA和SEQ ID NO.2中列出的核酸序列GGGAATTTCC可以在同一合成的启动子内被间隔区元件间隔开。
根据一些实施方案，TME响应性表达载体还包含编码外部诱导型启动子的核酸序列和编码反式激活因子例如rtTA3的核酸序列。根据一些实施方案，合成的启动子驱动反式激活因子的表达，并且诱导型启动子驱动CAR的表达。根据一些实施方案，仅外部诱导物和TME因子的组合存在导致CAR表达。根据一些实施方案，在TME因子不存在的情况下，外部诱导物的存在实质上不引起CAR表达的诱导。根据一些实施方案，在TME因子不存在的情况下，外部诱导物的存在引起CAR表达的最低诱导。根据一些实施方案，当TME因子在外部诱导物不存在的情况下结合启动子响应元件时，基本上不诱导CAR表达。根据一些实施方案，在非诱导状态下也存在较小水平的CAR表达。这样的最低表达可以用来确保记忆CAR-T被维持。
根据一些实施方案，诱导型启动子可以是Tet响应元件启动子，并且外部诱导物可以是多西环素和/或四环素。根据一些实施方案，可以通过反式激活因子和多西环素和/或四环素的组合存在来活化Tet响应元件。四环素(Tet)-开启系统是用于哺乳动物细胞的诱导型基因表达系统，其中包括多西环素结合Tet-阻遏物突变蛋白和来自单纯疱疹病毒VP16蛋白的C-末端活化结构域的反向Tet反式激活因子(rtTA)融合蛋白被工程化为通过提供多西环素(Dox)来控制基因表达。在Dox存在的情况下，rtTA活化最小启动子，该启动子融合在一系列(例如7个)重复的Tet-操纵基因序列的下游。直到最近，所有的Tet-开启系统都需要两个独立的载体，一个用来引入rtTA，且另一个通过诱导型启动子来控制感兴趣的基因。然而，最近已经开发出一种单载体系统(one-vector system)，其能够将感兴趣的基因转导到原代免疫细胞中。通过利用这种单载体系统，可以使用Tet-开启诱导型系统来控制靶表达和功能。
根据一些实施方案，由CAR序列编码的CAR分子包含抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内结构域，任选地包含共刺激结构域和/或初级信号传导结构域。根据一些实施方案，抗原结合结构域与肿瘤抗原结合。肿瘤抗原的非限制性实例包括：促甲状腺激素受体(TSHR)；CD171；CS-1(CD2亚组1、CRACC、SLAMF7、CD319和19A24)；C型凝集素样分子-1(CLL-1)；神经节苷脂GD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；Tn抗原(TnAg)；Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)；CD38；CD44v6；B7H3(CD276)；KIT(CD117)；白细胞介素-13受体亚基α-2(IL-13Rα2)；白细胞介素11受体α(IL-11Rα)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；丝氨酸蛋白酶21(PRSS21)；血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)；Lewis(Y)抗原；CD24；血小板源性生长因子受体β(PDGFR-β)；阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)；细胞表面相关黏蛋白1(MUC1)；表皮生长因子受体(EGFR)；神经细胞黏附分子(NCAM)；碳酸酐酶IX(CAIX)；蛋白酶体(Prosome,Macropain)亚基β型9(LMP2)；A型肝配蛋白(ephrin)受体2(EphA2)；岩藻糖基-GM1；唾液酸化的Lewis黏附分子(sLe)；神经节苷脂GM3(aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(1-1)Cer；TGS5；高分子量黑素瘤相关抗原(HMWMAA)；o-乙酰基-GD2神经节苷脂(OAcGD2)；叶酸受体β；肿瘤内皮标志物1(TEM1/CD248)；肿瘤内皮标志物7相关物(TEM7R)；密封蛋白6(claudin 6,CLDN6)；G蛋白偶联受体C类第5组，成员D(GPRC5D)；X染色体开放阅读框61(CXORF61)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盘特异性1(PLAC1)；globoH糖神经酰胺的己糖部分(hexasaccharide portion of globoH glycoceramide)(GloBoh)；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；uroplakin 2(UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)；肾上腺素受体β3(ADRB3)；泛连接蛋白(pannexin 3,PANX3)；G蛋白偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合体基因座K 9(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51E2)；TCRγ可变阅读框蛋白(TARP)；肾母细胞瘤蛋白(WT1)；位于染色体12p上的ETS易位变体基因6(ETV6-AML)；精子蛋白17(SPA17)；X抗原家族，成员1A(XAGE1)；血管生成素结合细胞表面受体2(Tie 2)；黑素瘤癌睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑素瘤癌睾丸抗原-2(MAD-CT-2)；Fos相关抗原1；p53突变体；人类端粒酶逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位断点；黑素瘤凋亡抑制物(ML-IAP)；ERG(跨膜蛋白酶、丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)；N-乙酰氨基葡萄糖转移酶V(NA17)；成对盒蛋白Pax-3(PAX3)；雄激素受体；细胞周期蛋白B1；v-myc禽类骨髓细胞瘤病毒癌基因神经母细胞瘤源性同源物(MYCN)；Ras同源家族成员C(RhoC)；细胞色素P450 1B 1(CYP1B 1)；CCCTC结合因子(锌指蛋白)样(BORIS)；由T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(SART3)；成对盒蛋白Pax-5(PAX5)；前顶体蛋白(proacrosin)结合蛋白sp32(OY-TES 1)；淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)；激酶锚蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤X断点2(SSX2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)；IgA的Fc片段受体(FCAR)；白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2)；CD300分子样家族成员f(CD300LF)；C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2(BST2)；含EGF样模块的黏蛋白样激素受体样2(EMR2)；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)；Fc受体样5(FCRL5)；和免疫球蛋白λ样多肽1(IGL1)及其任何组合。每种可能性是单独的实施方案。
根据一些实施方案，TME响应性表达载体还包含编码促进免疫效应细胞穿入肿瘤中的蛋白(或功能性RNA)诸如但不限于蛋白酶MMP8/9的效应物基因。
根据一些实施方案，TME响应性表达载体还包含一种或更多种编码抑制肿瘤内的免疫抑制物诸如但不限于PD1和/或CTLA4的miRNA的效应物基因。
根据一些实施方案，TME响应性表达载体还包含一种或更多种编码导致肿瘤内免疫细胞保留的细胞因子诸如但不限于CXCL9/10和/或CXCR3配体的效应物基因，从而产生自分泌环。
根据一些实施方案，载体可以是允许在哺乳动物细胞诸如人类细胞中表达的任何合适的载体。根据一些实施方案，载体可以选自DNA载体、RNA载体、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。每种可能性是单独的实施方案。
根据一些实施方案，可以创建TME载体文库，该文库包含TME载体，每种TME载体具有独特的TME响应性表达元件谱。
根据一些实施方案，提供了一种免疫效应细胞或细胞群体，该免疫效应细胞或细胞群体包含本文公开的肿瘤环境(TME)响应性表达载体。根据一些实施方案，免疫效应细胞或细胞群体是NK细胞或T细胞。
根据一些实施方案，提供了一种用于治疗有相应需要的患者的癌症的方法，该方法包括施用有效量的免疫效应细胞，该免疫效应细胞包含本文公开的肿瘤环境(TME)响应性表达载体。
根据一些实施方案，方法还包括向患者施用外部诱导物，诸如但不限于四环素和/或多西环素。根据一些实施方案，外部诱导物可以在施用具有本文公开的肿瘤环境(TME)响应性表达载体的免疫效应细胞之前、与其并行或在其之后提供。
根据一些实施方案，方法可以包括评估CAR表达水平和/或检查患者以确定副作用的步骤。根据一些实施方案，可以在施用外部诱导物之前评估CAR表达水平。根据一些实施方案，可以在施用外部诱导物期间和/或之后评估CAR表达水平。作为非限制性实例，可以首先给予第一次外部诱导物推注(bolus)，随后评估CAR表达。然后，可以基于检测到的CAR表达水平和患者对治疗的响应来施用第二次推注。根据一些实施方案，可以重复(例如每10小时、每天、每两天或任何其他合适的时间间隔)提供外部诱导物。根据一些实施方案，如果检测到副作用，可以终止外部诱导物的施用。根据一些实施方案，可以基于评估的CAR表达水平和/或基于患者对治疗的响应来增加/减少施用的外部诱导物的量。
根据一些实施方案，提供了一种用于筛选患者以确定用于CAR表达的最佳的合成的启动子的方法。该方法包括获得患者肿瘤的活检物，确定活检物中一种或更多种TME因子的表达谱；以及选择和/或工程化具有与活检物中一种或更多种TME因子的表达谱相匹配的TME依赖性启动子响应元件的TME响应性表达载体。根据一些实施方案，TME可以由肿瘤细胞和/或非肿瘤TME细胞表达。根据一些实施方案，非肿瘤TME细胞可以是免疫效应细胞。
根据一些实施方案，可以使从患者肿瘤和任选地同样从健康组织获得的组织样品在体外生长，并且TME响应性载体的文库可以被用于筛选证明对治疗最有效且最有选择性的载体，即具有与肿瘤的TME响应谱匹配的TME响应谱的载体。这是为了在肿瘤组织中获得最大同时也是对肿瘤独特的表达，从而在健康组织中不获得表达或获得最低表达。
根据一些实施方案，方法还包括将选择的TME响应性表达载体引入免疫效应细胞或细胞群体中。根据一些实施方案，免疫效应细胞或细胞群体是NK细胞或T细胞。根据一些实施方案，免疫效应细胞或细胞群体是患者自体的。根据一些实施方案，免疫效应细胞或细胞群体是在治疗之前从患者分离的。
根据一些实施方案，方法还包括将免疫效应细胞或细胞群体施用至患者。
现在参考图1，其示意性地说明了根据一些实施方案的表达构建体100，其包含直接控制CAR(或报告物基因)表达的合成的启动子。表达构建体100当被引入宿主免疫效应细胞时，被配置为在组织环境中直接诱导CAR(或GFP标志物)的转录，在该组织环境中，与表达构建体100的TME响应元件相匹配的TME因子是普遍的。
表达构建体100包含以下元件：
Synth.Pro.：合成的启动子，包含(i)具有TATAA盒的最小转录启动子，该TATAA盒可以通过足够的近端元件启动表达；和(ii)启动子响应元件的独特组合，此处为IFN-γ响应元件(缩写为“G”)、NF-κB响应元件(缩写为“K”)、低氧响应元件(缩写为“H”)和/或IL-6响应元件(缩写为“J”)。
TME：标记启动子区域，启动子响应元件序列位于该区域中，并且TME中存在的诱导型因子可与之结合，从而活化合成的启动子(例如IFN-γ、TNF-α、低氧和IL-6)。
Puro：同样由合成的启动子转录的抗性基因。抗性基因可以如此处示出的嘌呤霉素抗性基因；但是其他抗性基因也是适用的，并且在本公开内容的范围内。引入抗性基因以使得用载体转导的细胞能够在体外进行阳性选择。
IRES：内部核糖体进入位点使得抗性基因和靶基因(例如CAR或GFP标志物)两者能够从同一mRNA翻译。
现在参考图2，其示意性地说明了根据一些实施方案的表达构建体200，其包含间接控制CAR(或报告物基因)表达的合成的启动子。表达构建体200当被引入宿主免疫效应细胞时，被配置为在组织环境中诱导反式激活因子的转录，在该组织环境中，与表达构建体200的TME响应元件相匹配的TME因子是普遍的。然后，如果提供外源施用的诱导物(此处为多西环素)，则反式激活因子会诱导CAR的表达。这样的CAR表达的间接诱导提供了一种开启-关闭安全机制，在检测到非特异性表达或观察到副作用的情况下，能够停止CAR表达。
表达构建体200包含以下元件：
Synth.Pro.：合成的启动子，包含(i)具有TATAA盒的最小转录启动子，该TATAA盒可以通过足够的近端元件启动表达；和(ii)启动子响应元件的独特组合，此处为IFN-γ响应元件(缩写为“G”)、NF-κB响应元件(缩写为“K”)、低氧响应元件(缩写为“H”)和/或IL-6响应元件(缩写为“J”)。
TME：标记启动子区域，启动子响应元件序列位于该区域中，并且TME中存在的诱导型因子可与之结合，从而活化合成的启动子(例如IFN-γ、TNF-α、低氧和IL-6)。
Puro：同样由合成的启动子转录的抗性基因。抗性基因可以如此处示出的嘌呤霉素抗性基因；但是其他抗性基因也是适用的，并且在本公开内容的范围内。引入抗性基因以使得用载体转导的细胞能够在体外进行阳性选择。
rtTA3：反式激活因子基因，其转录物的转录由合成的启动子介导。
IRES：IRES元件使得抗性基因和反式激活因子基因(此处为rtTA3)两者能够从同一合成的启动子转录。
Dox：多西环素，四环素的有效类似物，用作反式激活因子的辅活化物。
TRE3G：Tet响应元件启动子，由rtTA3和外源多西环素的组合存在活化，并介导CAR(或报告物基因或其他靶基因)的转录。这是增强-安全性载体的基础，一方面，通过在rtTA3反式激活因子前方构建上述合成的启动子并且在Tet响应元件启动子控制下构建报告物基因/CAR，允许扩增的TME特异性CAR表达与另外的安全性层结合。rtTA-tet响应的包括提供了转录的扩增，因为它招募了VP16转录活化物。此外，四环素/多西环素诱导型元件增加了另一层安全性，因为它仅在四环素(或Dox)存在时才起作用，因此允许它容易地关闭系统。
miRE：微小RNA元件(miRE)提供了TRE3G启动子转录的ORF的转录终止，并且同时提供了用于沉默其他感兴趣基因(例如沉默内源T细胞受体或免疫检查点受体如PD-1)的miR的表达。
根据一些实施方案，提供了一种用于筛选具有最佳肿瘤微环境(TME)表达模式的启动子文库(即在TME中诱导强表达，但在非TME中具有很少(如果存在)表达的启动子)的方法。
根据一些实施方案，启动子文库包括具有候选的合成的启动子的表达构建体，该候选的合成的启动子被构建并任选地在体外进行功能测试。
根据一些实施方案，文库中的启动子具有这样的核酸序列，该核酸序列具有在TME内活化的转录因子的预期结合位点。
根据一些实施方案，启动子包含多于一个候选核酸序列，候选核酸序列被核苷酸序列(本文中也称为“间隔区”)间隔开。
根据一些实施方案，启动子还包含最小启动子序列，后接报告物基因，诸如荧光蛋白。
根据一些实施方案，构建体包含两种荧光报告物：第一报告物具有隐蔽性框外(off-frame)ATG起始密码子，并且第二报告物位于内部核糖体进入位点(IRES)之后，使其能够独立翻译。根据一些实施方案，第一荧光报告物将较差地翻译，仅在高度转录时产生信号，而第二荧光报告物独立翻译，在低水平转录时也是如此。
根据一些实施方案，候选启动子文库包含具有恒定“核心”部分和基于感兴趣转录因子的结合位点的可变核苷酸的启动子。间隔区序列、结合位点的串联重复序列以及多个因子的多个结合位点的组成部分也使得文库的产生成为可能。根据一些实施方案，基于对感兴趣的转录因子的多个结合位点的分析，通过将可变核苷酸集中在战略性位置，可以限制复杂性。根据一些实施方案，复杂性可以通过添加可变核苷酸和/或结合位点的重复序列和/或它们之间的间隔区而增加。
作为非限制性实例，具有特定可变核苷酸的核心位点可以包括但不限于：用于STAT1结合的AYTTCCSGGAART，以及用于NF-kB的GGRRRTTYYC，其中，A＝腺嘌呤，T＝胸苷，C＝胞苷，G＝鸟嘌呤，Y＝C/T，S＝C/G，R＝A/G。合适的间隔区的非限制性实例包括：AGGGTGGGCAAGT、tctaga、GGGGACTTTCC。
根据一些实施方案，启动子被克隆到表达载体中，诸如但不限于具有上述第一荧光报告物和第二荧光报告物以及质粒繁殖和慢病毒颗粒产生所需的另外序列的pHage2慢病毒载体。
根据一些实施方案，可以使用任何克隆技术将合成的启动子序列克隆到表达载体中。合适的克隆技术的非限制性实例包括使用限制性酶的“经典”克隆和无缝克隆(in-fusion cloning)。
任选地，启动子文库使用非校对聚合酶(non-proof-reader)的PCR扩增可以被用于引入随机突变，这可以进一步增加文库的可变性和复杂性。
根据一些实施方案，慢病毒可以通过常规技术，诸如通过将表达载体与包装质粒一起瞬时共转染到293T-HEK细胞中来产生。然后感兴趣的细胞系(例如293细胞)可以用病毒转导(优选地以MOI<0.3)，以获得每个细胞单个拷贝，并且随后可以根据需要进行扩增。
根据一些实施方案，方法还包括鉴定具有最佳启动子的细胞，所述最佳启动子即在TME中诱导强表达，但在非TME中具有很少(如果存在)表达的启动子。根据一些实施方案，可以通过使转导的细胞在具有和没有刺激的情况下以及在相关TME因子存在/不存在的情况下生长来鉴定细胞，所述相关TME因子诸如但不限于：TNF-α、IFN-γ、低氧、IL-6和TGF-β。然后根据细胞的报告物基因的表达对细胞进行分选(例如使用FACS)。根据一些实施方案，可以将获得第一荧光报告物和第二荧光报告物两者的双色的具有非常高表达的细胞与仅具有中等高表达的第二报告物的细胞分离。
应当理解，可以使用其他技术。例如，第一报告物和第二报告物可以是抗生素抗性基因，在这种情况下，可以进行鉴定抗生素抗性细胞的分选。
根据一些实施方案，分选的细胞在没有刺激性细胞因子的情况下进一步扩增，并且然后针对第一报告物的阴性/低表达进行分选，以避免组成型活性启动子。然后在刺激不存在的情况下显示阴性/低第一报告物表达的细胞被进一步扩增。
根据一些实施方案，方法还可以包括另外的刺激分选步骤，其通过基本上重复以上描述的阳性和阴性选择进行。
根据一些实施方案，在获得期望的表型后，方法可以还包括使用常规分子生物学从细胞中提取基因组DNA(任选地在细胞另外扩增之后)。使用PCR提取载体的启动子；例如，使用对整合文库的上游和下游序列特异性的引物提取载体的启动子。根据一些实施方案，引物包括另外的延伸部分，允许使用商业服务直接测序。
根据一些实施方案，方法还包括将富集的启动子的序列与文库的序列进行比较，并且任选地还与已知启动子进行比较，以鉴定新的最佳启动子序列。
根据一些实施方案，方法还包括在筛选的细胞系和/或其他细胞系和/或感兴趣的原代免疫细胞中验证所鉴定的最佳启动子的活性。
现在参考图3，其是用于筛选启动子文库以提供最佳肿瘤微环境(TME)CAR表达模式的方法的说明性流程图300。
在方法的步骤310中，构建了包含候选启动子的文库(例如慢病毒(LV)文库)，如本文基本上描述的。
在步骤320中，用文库的慢病毒感染细胞系(例如293细胞)。在产生表达启动子构建体的细胞系后，在步骤330中，使细胞在刺激物(rtTA3和多西环素)存在或不存在以及刺激性细胞因子存在或不存在的情况下生长，并且然后根据它们的报告物基因表达谱进行分选(例如通过FACS)，其通过将获得第一荧光报告物和第二荧光报告物两者的双色的具有非常高表达的细胞与仅具有中等高表达的TME依赖性报告物的细胞分离来进行。如本文解释的，可以重复该步骤以进一步增强启动子的敏感性和/或特异性。
在步骤340中，鉴定具有期望的表达谱(在刺激物和细胞因子存在的情况下两个启动子均高表达，而在细胞因子不存在的情况下第二启动子(TME依赖性报告物)具有很少表达或不表达)的细胞，并对它们的启动子进行测序(步骤350)。
提供以下实施例以更充分地说明本发明的一些实施方案。然而，其绝不应以任何方式被解释为限制本发明的宽范围。本领域技术人员可以容易地设想本文公开的原理的许多变化和修改而不偏离本发明的范围。
实施例
实施例1-定义响应元件
包含以下响应元件序列的启动子在下表1中列出。响应元件被构建在紧邻具有TATAA盒的最小转录启动子之前，该TATAA盒可以通过足够的近端元件启动表达。
表1.启动子响应元件序列
Figure BDA0002724598660000281
Figure BDA0002724598660000291
Figure BDA0002724598660000301
Figure BDA0002724598660000311
Figure BDA0002724598660000321
Figure BDA0002724598660000331
与表1中所列的响应元件结合的因子或因子的组合(例如TNF-α、NF-κB和IL-6)是许多TME特征性的，并且这些因子的某些组合可特异性代表TME特征/谱。
然而，值得注意的是，前述因子可能并不存在于所有的TME中。类似地，在某些TME中也可存在另外的因子。因此，可以包含其他响应元件或者可以取代前述响应元件，并且这样的添加和/或取代在本公开内容的范围内。
此外，如本文解释的，应当理解，可以在包含更少或更多响应元件之间进行权衡。例如，利用相同的TME响应性表达构建体，包含更少类型的响应元件可以使表达靶向广谱的癌症。作为另一个实例，包含响应元件的更全面/详尽的组合可以相对于正常/健康组织增加表达构建体对肿瘤组织的特异性。
实施例2-控制启动子渗漏：
本发明的一个主要方面是获得在TME内的免疫效应物基因的内源诱导。本文公开的合成的启动子被配置成在TME内诱导表达，而在健康组织中实质上限制表达。因此，评估了合成的启动子的渗漏。
设想了两种类型的渗漏。
第一种类型的渗漏表现为在TME因子不存在的情况下来自TME刺激的启动子的转录，无论是CAR/GFP报告物(如图1的表达构建体100的情况)，还是反式激活因子(如图2的表达构建体200的情况)。这种类型的渗漏可能是由于在没有外源提供的TME相关刺激的情况下最小启动子的诱导，这是因为被测试的细胞内源表达该因子，或者是由于启动子本身的渗漏。
第二种类型的渗漏水平，与包含Tet响应元件启动子的表达构建体诸如图2的表达构建体200相关，其涉及在多西环素/四环素不存在的情况下，CAR/GFP报告物的表达。这种类型的渗漏可能是由于(i)在所用的培养基或血清中残留tet/dox的存在，并且因此是体外环境的人为现象；或者(ii)启动子本身的渗漏。
用图2中公开的表达载体和以下响应元件转导HEK293T细胞：
1.G2(2xIFN-γ)，
2.G1K0.6(1xIFN-γ和60％的NF-κB序列元件的组合)，或
3.G3K3(3xIFN-γ和3xNF-κB的组合)。
用嘌呤霉素对细胞进行选择，以确保仅载体转导的细胞存活。
测试GFP强度以及GFP阳性细胞的百分比。
如从图4A的直方图以及图4B的代表性FACS图中可以观察到的，在所有三种情况下，向细胞培养基中添加多西环素本身并不诱导GFP的表达(即没有观察到GFP强度或GFP阳性细胞百分比的增加)。然而，在多西环素与TNF-α和/或IFN-γ的组合存在下，GFP强度以及GFP阳性细胞的百分比显著增加。
这些结果清楚地证明了本文公开的表达构建体能够实现TME特异性表达。
实施例3-响应元件协同作用
认为包含TME响应元件的组合将提供协同表达。
与单个IFN-γ元件相比，包含数个IFN-γ元件(2个、4个和6个)的效果在包含两个IFN-γ元件后，在GFP阳性细胞的频率和GFP强度两方面都已达到了平台期(数据未显示)。
然而，如从图5可以观察到的，当将NF-κB响应元件添加至IFN-γ元件时，有利地观察到协同作用，因为包含三个IFN-γ元件响应元件和三个NF-κB响应元件的启动子比包含仅IFN-γ响应元件的启动子提供显著更高的GFP阳性细胞百分比。
实施例4–TME谱分析
还测试了在用炎性细胞因子的组合刺激与用单一细胞因子刺激后GFP表达的强度和频率。简言之，用含有以下合成的启动子之一的载体转导HEK293T细胞：
1.G1K0.6：1xIFN-γ和60％的NF-κB，
2.G3K3：3xIFN-γ和3xNF-κB的组合。
这一次没有先进行嘌呤霉素选择而收获了细胞，并且因此结果代表了整个细胞群体，转导的以及未转导的细胞。
图6示出了代表性FACS图(上图)，门控GFP阳性细胞(GFP+)，以及示出了每个测试条件下GFP强度的定量(中值)的直方图(下图)。
值得注意的是，用具有G3K3响应元件的表达构建体转导的细胞，每种添加的细胞因子都显示出累积表达。在用具有G1K0.6响应元件的表达构建体转导的细胞中，单独添加IFN-γ和TNF-α的每一个仅引起低水平的表达，而用IFN-γ和TNF-α两者的组合处理诱导了实质上更高的表达水平。
这些结果清楚地表明，使用本文公开的表达构建体可以实现受控的表达水平。优选地，所使用的构建体应当适应于所处理/靶向的细胞的TME谱，以便基于需要优化表达水平。
实施例5-3因子响应元件
在对两种响应元件IFN-γ和NF-κB的组合(G和K)进行研究后，还对包含另外的因子结合位点的响应元件即IL-6和低氧(J和H)进行了评估，其主要如以上描述。
用含有以下合成的启动子之一的载体转导HEK293T细胞：
1.G1K0.6J1：1xIFN-γ、60％的NF-κB、1xIL-6响应元件序列。
2.G1K0.6H1：1xIFN-γ、60％的NF-κB、1x低氧响应元件序列。
在用指示的因子刺激之前和之后，通过FACS评估了GFP表达的强度和频率。不经选择而收获细胞。
图7示出了每种启动子和每种条件下的GFP阳性细胞(GFP+)的FACS图(上图)和描绘每种条件下的GFP阳性细胞表达强度的定量(为中值)的直方图(下图)。
如从图7可以观察到的，在G1K0.6元件下游插入第三个响应元件没有进一步促进其协同效应。值得注意的是，这可能不必然是一般性的观察，而可能是代表了所测试的特定细胞系。
实施例6-筛选最佳启动子序列
为了鉴定提供最佳CAR表达谱的启动子，构建了候选启动子的慢病毒文库。该文库包含的构建体所具有的启动子具有恒定“核心”部分和基于感兴趣的转录因子的结合位点的可变核苷酸。还包含间隔区序列、结合位点的串联重复序列以及多个因子的多个结合位点的组成部分。启动子的可变性是通过改变启动子的战略性位置和/或随机位置处的核苷酸、在启动子的战略性位置和/或随机位置处添加核苷酸和/或使启动子的战略性位置和/或随机位置处的核苷酸缺失而产生的。通过改变结合位点重复序列的数目和/或它们之间的间隔区进一步增加复杂性。筛选中包括总计65,536种启动子序列。
该文库的构建体包含荧光报告物(GFP)，其具有隐蔽性框外ATG起始密码子，确保报告物基因仅在高水平转录物即高水平转录因子(此处为TME转录因子)存在下翻译。构建体还包含位于内部核糖体进入位点(IRES)之后的第二报告物(DsRed)，使得第二报告物(DsRed)能够独立翻译，在低水平转录物时也是如此。
然后将构建体克隆到慢病毒载体中，并且通过将慢病毒载体与包装质粒一起瞬时共转染到293T-HEK细胞中来产生病毒。
然后用慢病毒感染(转导)293细胞，以获得其基因组中掺入有文库的启动子构建体的细胞系。
随后，使转导的细胞在250U/mL TNF、IFN或TNF和IFN存在或不存在的情况下生长48h，并且随后进行FACS分选。最初，对在TNF、IFN或TNF和IFN存在的情况下显示出高GFP表达或高GFP和DsRed表达的细胞进行门控(“阳性”分选)。如从图8的上图可以观察到的，在细胞因子不存在的情况下，仅0.09％的细胞显示出高GFP表达，而在TNF、IFN或TNF和IFN存在的情况下，0.2％的细胞具有高GFP表达。
然后在细胞因子不存在的情况下生长后，对经门控的细胞进行一轮“阴性”分选(图8第二组图)。在该分选步骤期间，获得了在细胞因子不存在的情况下没有GFP表达或GFP表达很低的细胞，而具有引起组成型表达的启动子的细胞被弃去(或被单独分选)。
阳性和阴性分选轮被重复两次(图8第3和第4组图)，直到获得占初始群体的1.94％的最终群体，该群体的特征在于具有高GFP表达，即具有对TNF和/或IFN存在/不存在高度敏感的表达模式。
将获得的细胞进行繁殖，并使用启动子特异性引物对其启动子进行测序。该筛选从包含在筛选中的65,536种序列中鉴定出19种序列。18种序列基本上相似，但在16个核苷酸中存在差异(粗体和加下划线的)，以及在一些情况下存在一些另外的更为随机的改变。还获得与其他18种序列稍有不同的另外的序列(SEQ ID NO：41)。
下表2提供了从筛选中获得的提供最佳CAR表达谱的启动子序列。
表2-启动子序列
Figure BDA0002724598660000381
Figure BDA0002724598660000391
Figure BDA0002724598660000401
Figure BDA0002724598660000411
实施例7-设计新的基于PRE的文库，并将基础序列或文库优化序列与其他PRE组合 到同一合成的启动子中
为了产生单独的或与其他PRE组合的特异性PRE的文库，我们采用了以下的一般性方法，此处使用低氧PRE元件为例进行了详细描述。
收集在不同基因的低氧依赖性启动子中使用的PRE序列。
基于这些序列，一种基础、非天然存在的低氧PRE元件通过从被认为在不同基因中起低氧PRE作用的天然存在的序列中提取部分而产生。所述部分包括：
例如存在于低氧依赖性LDHA/EPO/VEGF基因中的HBS序列(ACGTG)。
接头1(GCTGGAGT)，一种8核苷酸接头，不存在于天然靶基因的启动子中(不是LDHA/EPO/VEGF基因的一部分)。
存在于例如低氧依赖性EPO基因中的HAS(CACAG)。
接头2(TCCTCTT)，一种7核苷酸接头，不存在于天然靶基因的启动子中(不是LDHA/EPO/VEGF基因的一部分)。
这些序列被线性组合成一个序列，并且然后串联加倍，以获得SEQ ID.NO.42中列出的序列
Figure BDA0002724598660000421
代表性“基础低氧PRE”。应当理解，基础低氧PRE仅是示例性的，并且也可以设想其他组合、接头、PRE的数目以及它们的取向。
然后可以将“基础低氧序列”添加到(相同或不同的TME的)另外的PRE序列中，以产生修饰的/替代的合成的启动子。基于基础TME因子(此处为低氧)PRE的任选的修饰的/替代的合成的启动子的非限制性实例包括：
(i)单个或组合的PRE，
作为非限制性实例，基础低氧PRE可以与G1K1序列(SEQ ID NO.9中列出)组合，从而产生SEQ ID NO.46中列出的序列(也称为H1G1K1)。
Figure BDA0002724598660000422
(ii)可选定位：基础TME因子PRE可以被添加在合成的启动子的5’和/或3’和/或中间。
(ii)可选取向：基础TME因子PRE可以翻转并且如以上(i)和(ii)中的添加。
作为非限制性实例，基础低氧PRE可以以翻转构型与G1K1序列(SEQ ID NO.9中列出)组合，从而产生SEQ ID NO.47中列出的序列(也称为H1flipG1K1)。
Figure BDA0002724598660000431
(iv)可选序列。基础TME因子PRE序列的核苷酸可以被取代。例如，如SEQ ID NO.43中列出的。
Figure BDA0002724598660000432
产生文库后，筛选文库以获得最佳序列；即如实施例6中基本上描述的，引起较少渗漏且对低氧刺激的响应最高的序列。
应当理解，所描述的用于设计“基础响应元件”并且然后基于“基础响应元件”产生修饰的/替代的PRE文库的方法可以被修改以用于本文描述的所有TME因子PRE。
虽然已经说明和描述了本发明的某些实施方案，但是很明显，本发明不限于本文描述的实施方案。不偏离如所附权利要求书所描述的本发明的精神和范围的许多修改、改变、变化、替代和等同物对于本领域技术人员将是明显的。
序列表
<110> 内盖夫生物技术国家研究所有限公司
<120> 嵌合抗原的肿瘤环境特异性表达
<130> NIBN/001 PCT
<160> 47
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 9
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
ttccgggaa 9
<210> 2
<211> 10
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
gggaatttcc 10
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 3
gaccttgagt acgtgcgtct ctgcacgtat g 31
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 4
gcgcttcctg acagtgacgc gagccg 26
<210> 5
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)
<220>
<223> 合成的启动子
<400> 5
gggaatttcc ggggactttc cgggaatttc cggggacttt ccgggaattt ccagagcata 60
ttaaggtgac gcgtgtggcc tcgaacaccg agcgaccctg cagcgacccg cttaaaagcg 120
gccgcc 126
<210> 6
<211> 163
<212> DNA
<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)
<220>
<223> 合成的启动子
<400> 6
ttccgggaaa gggtgggcaa gtttccggga aagcagtagg tacagccttc cgggaaaggg 60
tgggcaagtt tccgggaaag cagtaggttt ttcgcatatt aaggtgacgc gtgtggcctc 120
gaacaccgag cgaccctgca gcgacccgct taaaaggcgc gcc 163
<210> 7
<211> 257
<212> DNA
<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)
<220>
<223> 合成的启动子
<400> 7
ttccgggaaa gggtgggcaa gtttccggga aagcagtagg tacagccttc cgggaaaggg 60
tgggcaagtt tccgggaaag cagtaggtac agccttccgg gaaagggtgg gcaagtttcc 120
gggaaagcag taggtacagc cttccgggaa agggtgggca agtttccggg aaagcagtag 180
gtttttcgca tattaaggtg acgcgtgtgg cctcgaacac cgagcgaccc tgcagcgacc 240
cgcttaaaag gcgcgcc 257
<210> 8
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)
<220>
<223> 合成的启动子
<400> 8
ttccgggaaa gggtgggcaa gtttccggga aagcagtagg tacagccttc cgggaaaggg 60
tgggcaagtt tccgggaaag cagtaggtac agccttccgg gaaagggtgg gcaagtttcc 120
gggaaagcag taggtacagc cttccgggaa agggtgggca agtttccggg aaagcagtag 180
gtacagcctt ccgggaaagg gtgggcaagt ttccgggaaa gcagtaggta cagccttccg 240
ggaaagggtg ggcaagtttc cgggaaagca gtaggttttt cgcatattaa ggtgacgcgt 300
gtggcctcga acaccgagcg accctgcagc gacccgctta aaaggcgcgc c 351
<210> 9
<211> 160
<212> DNA
<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)
<220>
<223> 合成的启动子
<400> 9
ttccgggaaa gggtgggcaa gtttccggga acccgggaat ttccggggac tttccgggaa 60
tttccgggga ctttccggga atttccagag catattaagg tgacgcgtgt ggcctcgaac 120
accgagcgac cctgcagcga cccgcttaaa agcggccgcc 160
<210> 10
<211> 139
<212> DNA
<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)
<220>
<223> 合成的启动子
<400> 10
ttccgggaaa gggtgggcaa gtttccggga acccgggaat ttccggggac tttccgggaa 60
tttccagagc atattaaggt gacgcgtgtg gcctcgaaca ccgagcgacc ctgcagcgac 120
ccgcttaaaa gcggccgcc 139
<210> 11
<211> 267
<212> DNA
<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)
<220>
<223> 合成的启动子
<400> 11
ttccgggaaa gggtgggcaa gtttccggga aagcagtagg tacagccttc cgggaaaggg 60
tgggcaagtt tccgggaaag agcagggaat ttccggggac tttccgggaa tttccgggga 120
ctttccggga atttccagag cagggaattt ccggggactt tccgggaatt tccggggact 180
ttccgggaat ttccagagca tattaaggtg acgcgtgtgg cctcgaacac cgagcgaccc 240
tgcagcgacc cgcttaaaag gcgcgcc 267
<210> 12
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)
<220>
<223> 合成的启动子
<400> 12
ttccgggaaa gggtgggcaa gtttccggga aagcagtagg tacagccttc cgggaaaggg 60
tgggcaagtt tccgggaaag cagtaggtac agccttccgg gaaagggtgg gcaagtttcc 120
gggaaagagc agggaatttc cggggacttt ccgggaattt ccggggactt tccgggaatt 180
tccagagcag ggaatttccg gggactttcc gggaatttcc ggggactttc cgggaatttc 240
cagagcaggg aatttccggg gactttccgg gaatttccgg ggactttccg ggaatttcca 300
gagcatatta aggtgacgcg tgtggcctcg aacaccgagc gaccctgcag cgacccgctt 360
aaaaggcgcg cc 372
<210> 13
<211> 456
<212> DNA
<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)
<220>
<223> 合成的启动子
<400> 13
ttccgggaaa gggtgggcaa gtttccggga aagcagtagg tacagccttc cgggaaaggg 60
tgggcaagtt tccgggaaag cagtaggtac agccttccgg gaaagggtgg gcaagtttcc 120
gggaaagcag taggtacagc cgaccttgag tacgtgcgtc tctgcacgta tgagagcaga 180
ccttgagtac gtgcgtctct gcacgtatga gagcagggaa tttccgggga ctttccggga 240
atttccgggg actttccggg aatttccaga gcagggaatt tccggggact ttccgggaat 300
ttccggggac tttccgggaa tttccagagc agggaatttc cggggacttt ccgggaattt 360
ccggggactt tccgggaatt tccagagcat attaaggtga cgcgtgtggc ctcgaacacc 420
gagcgaccct gcagcgaccc gcttaaaagg cgcgcc 456
<210> 14
<211> 446
<212> DNA
<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)
<220>
<223> 合成的启动子
<400> 14
ttccgggaaa gggtgggcaa gtttccggga aagcagtagg tacagccttc cgggaaaggg 60
tgggcaagtt tccgggaaag cagtaggtac agccttccgg gaaagggtgg gcaagtttcc 120
gggaaagagc agggaatttc cggggacttt ccgggaattt ccggggactt tccgggaatt 180
tccagagcag ggaatttccg gggactttcc gggaatttcc ggggactttc cgggaatttc 240
cagagcaggg aatttccggg gactttccgg gaatttccgg ggactttccg ggaatttcca 300
gagcagacct tgagtacgtg cgtctctgca cgtatgagag cagaccttga gtacgtgcgt 360
ctctgcacgt atgagagcat attaaggtga cgcgtgtggc ctcgaacacc gagcgaccct 420
gcagcgaccc gcttaaaagg cgcgcc 446
<210> 15
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)
<220>
<223> 合成的启动子
<400> 15
ttccgggaaa gggtgggcaa gtttccggga aagcagtagg tacagccttc cgggaaaggg 60
tgggcaagtt tccgggaaag cagtaggtac agccgacctt gagtacgtgc gtctctgcac 120
gtatgagagc agaccttgag tacgtgcgtc tctgcacgta tgagagcagg gaatttccgg 180
ggactttccg ggaatttccg gggactttcc gggaatttcc agagcaggga atttccgggg 240
actttccggg aatttccggg gactttccgg gaatttccag agcatattaa ggtgacgcgt 300
gtggcctcga acaccgagcg accctgcagc gacccgctta aaaggcgcgc c 351
<210> 16
<211> 341
<212> DNA
<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)
<220>
<223> 合成的启动子
<400> 16
ttccgggaaa gggtgggcaa gtttccggga aagcagtagg tacagccttc cgggaaaggg 60
tgggcaagtt tccgggaaag agcagggaat ttccggggac tttccgggaa tttccgggga 120
ctttccggga atttccagag cagggaattt ccggggactt tccgggaatt tccggggact 180
ttccgggaat ttccagagca gaccttgagt acgtgcgtct ctgcacgtat gagagcagac 240
cttgagtacg tgcgtctctg cacgtatgag agcatattaa ggtgacgcgt gtggcctcga 300
acaccgagcg accctgcagc gacccgctta aaaggcgcgc c 341
<210> 17
<211> 341
<212> DNA
<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)
<220>
<223> 合成的启动子
<400> 17
gaccttgagt acgtgcgtct ctgcacgtat gagagcagac cttgagtacg tgcgtctctg 60
cacgtatgag agcattccgg gaaagggtgg gcaagtttcc gggaaagcag taggtacagc 120
cttccgggaa agggtgggca agtttccggg aaagagcagg gaatttccgg ggactttccg 180
ggaatttccg gggactttcc gggaatttcc agagcaggga atttccgggg actttccggg 240
aatttccggg gactttccgg gaatttccag agcatattaa ggtgacgcgt gtggcctcga 300
acaccgagcg accctgcagc gacccgctta aaaggcgcgc c 341
<210> 18
<211> 246
<212> DNA
<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)
<220>
<223> 合成的启动子
<400> 18
ttccgggaaa gggtgggcaa gtttccggga aagcagtagg tacagccgac cttgagtacg 60
tgcgtctctg cacgtatgag agcagacctt gagtacgtgc gtctctgcac gtatgagagc 120
agggaatttc cggggacttt ccgggaattt ccggggactt tccgggaatt tccagagcat 180
attaaggtga cgcgtgtggc ctcgaacacc gagcgaccct gcagcgaccc gcttaaaagg 240
cgcgcc 246
<210> 19
<211> 169
<212> DNA
<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)
<220>
<223> 合成的启动子
<400> 19
ttccgggaaa gggtgggcaa gtttccggga acccgacctt gagtacgtgc gtctctgcac 60
gtatgtacag cgcttcctga cagtgacgcg agccgagagc atattaaggt gacgcgtgtg 120
gcctcgaaca ccgagcgacc ctgcagcgac ccgcttaaaa gcggccgcc 169
<210> 20
<211> 169
<212> DNA
<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)
<220>
<223> 合成的启动子
<400> 20
ttccgggaaa gggtgggcaa gtttccggga acccgggaat ttccggggac tttccgggaa 60
tttcctacag cgcttcctga cagtgacgcg agccgagagc atattaaggt gacgcgtgtg 120
gcctcgaaca ccgagcgacc ctgcagcgac ccgcttaaaa gcggccgcc 169
<210> 21
<211> 174
<212> DNA
<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)
<220>
<223> 合成的启动子
<400> 21
ttccgggaaa gggtgggcaa gtttccggga acccgggaat ttccggggac tttccgggaa 60
tttcctacag accttgagta cgtgcgtctc tgcacgtatg agagcatatt aaggtgacgc 120
gtgtggcctc gaacaccgag cgaccctgca gcgacccgct taaaagcggc cgcc 174
<210> 22
<211> 250
<212> DNA
<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)
<220>
<223> 合成的启动子
<400> 22
tacagggaca gcagagatcc agtttggact agcccggtcg cactagttct agaacttccc 60
ggaaataggg tgggcaagta tttccgggaa attctagagg gagttcccgg ggactttccg 120
gggattttct ctagatatta aggtgacgcg tgtggcctcg aacaccgagc gaccctgcag 180
cgacccgctt aaaagcggcc gccatgggcc gccatggcct cctccgagga cgtcatcaag 240
gagttcatgc 250
<210> 23
<211> 250
<212> DNA
<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)
<220>
<223> 合成的启动子
<400> 23
tacagggaca gcagagatcc agtttggact agcccggtcg cactagttct agaacttccc 60
ggaagtaggg tgggcaagta cttcccggaa gttctagagg aaattttcgg ggactttccg 120
ggggttctct ctagatatta aggtgacgcg tgtggcctcg aacaccgagc gaccctgcag 180
cgacccgctt aaaagcggcc gccatgggcc gccatggcct cctccgagga cgtcatcaag 240
gagttcatgc 250
<210> 24
<211> 250
<212> DNA
<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)
<220>
<223> 合成的启动子
<400> 24
tacagggaca gcagagatcc agtttggact agcccggtcg cactagttct agaacttccc 60
ggaagtaggg tgggcaagta cttccgggaa attctagagg gagttctcgg ggactttccg 120
ggaattttct ctagatatta aggtgacgcg tgtggcctcg aacaccgagc gaccctgcag 180
cgacccgctt aaaagcggcc gccatgggcc gccatggcct cctccgagga cgtcatcaag 240
gagttcatgc 250
<210> 25
<211> 250
<212> DNA
<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)
<220>
<223> 合成的启动子
<400> 25
tacagggaca gcagagatcc agtttggact agcccggtcg cactagttct agaacttccc 60
ggaagtaggg tgggcaagta tttcccggaa gttctagagg aagttctcgg ggactttccg 120
gagattctct ctagatatta aggtgacgcg tgtggcctcg aacaccgagc gaccctgcag 180
cgacccgctt aaaagcggcc gccatgggcc gccatggcct cctccgagga cgtcatcaag 240
gagttcatgc 250
<210> 26
<211> 250
<212> DNA
<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)
<220>
<223> 合成的启动子
<400> 26
tacagggaca gcagagatcc agtttggact agcccggtcg cactagttct agaacttccg 60
ggaaataggg tgggcaagta cttccgggaa attctagagg ggatttccgg ggactttccg 120
gaggttctct ctagatatta aggtgacgcg tgtggcctcg aacaccgagc gaccctgcag 180
cgacccgctt aaaagcggcc gccatgggcc gccatggcct cctccgagga cgtcatcaag 240
gagttcatgc 250
<210> 27
<211> 250
<212> DNA
<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)
<220>
<223> 合成的启动子
<400> 27
tacagggaca gcagagatcc agtttggact agcccggtcg cactagttct agaacttccg 60
ggaaataggg tgggcaagta cttccgggaa gttctagagg aggttttcgg ggactttccg 120
gaggtttcct ctagatatta aggtgacgcg tgtggcctcg aacaccgagc gaccctgcag 180
cgacccgctt aaaagcggcc gccatgggcc gccatggcct cctccgagga cgtcatcaag 240
gagttcatgc 250
<210> 28
<211> 250
<212> DNA
<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)
<220>
<223> 合成的启动子
<400> 28
tacagggaca gcagagatcc agtttggact agcccggtcg cactagttct agaacttccg 60
ggaagtaggg tgggcaagta tttcccggaa gttctagagg gggttttcgg ggactttccg 120
gaggtttcct ctagatatta aggtgacgcg tgtggcctcg aacaccgagc gaccctgcag 180
cgacccgctt aaaagcggcc gccatgggcc gccatggcct cctccgagga cgtcatcaag 240
gagttcatgc 250
<210> 29
<211> 250
<212> DNA
<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)
<220>
<223> 合成的启动子
<400> 29
tacagggaca gcagagatcc agtttggact agcccggtcg cactagttct agaacttccg 60
ggaagtaggg tgggcaagta tttccgggaa attctagagg gagttctcgg ggactttccg 120
gggattttct ctagatatta aggtgacgcg tgtggcctcg aacaccgagc gaccctgcag 180
cgacccgctt aaaagcggcc gccatgggcc gccatggcct cctccgagga cgtcatcaag 240
gagttcatgc 250
<210> 30
<211> 250
<212> DNA
<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)
<220>
<223> 合成的启动子
<400> 30
tacagggaca gcagagatcc agtttggact agcccggtcg cactagttct agaatttccc 60
ggaaataggg tgggcaagta cttccgggaa attctagagg gggtttccgg ggactttccg 120
ggggttttct ctagatatta aggtgacgcg tgtggcctcg aacaccgagc gaccctgcag 180
cgacccgctt aaaagcggcc gccatgggcc gccatggcct cctccgagga cgtcatcaag 240
gagttcatgc 250
<210> 31
<211> 250
<212> DNA
<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)
<220>
<223> 合成的启动子
<400> 31
tacagggaca gcagagatcc agtttggact agcccggtcg cactagttct agaatttccc 60
ggaaataggg tgggcaagta tttcccggaa attctagagg gggttttcgg ggactttccg 120
ggaattttct ctagatatta aggtgacgcg tgtggcctcg aacaccgagc gaccctgcag 180
cgacccgctt aaaagcggcc gccatgggcc gccatggcct cctccgagga cgtcatcaag 240
gagttcatgc 250
<210> 32
<211> 250
<212> DNA
<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)
<220>
<223> 合成的启动子
<400> 32
tacagggaca gcagagatcc agtttggact agcccggtcg cactagttct agaatttccc 60
ggaaataggg tgggcaagta tttccgggaa attctagagg aggttctcgg ggactttccg 120
ggagttttct ctagatatta aggtgacgcg tgtggcctcg aacaccgagc gaccctgcag 180
cgacccgctt aaaagcggcc gccatgggcc gccatggcct cctccgagga cgtcatcaag 240
gagttcatgc 250
<210> 33
<211> 250
<212> DNA
<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)
<220>
<223> 合成的启动子
<400> 33
tacagggaca gcagagatcc agtttggact agcccggtcg cactagttct agaatttccc 60
ggaaataggg tgggcaagta tttccgggaa attctagagg aggttttcgg ggactttccg 120
ggagtttcct ctagatatta aggtgacgcg tgtggcctcg aacaccgagc gaccctgcag 180
cgacccgctt aaaagcggcc gccatgggcc gccatggcct cctccgagga cgtcatcaag 240
gagttcatgc 250
<210> 34
<211> 250
<212> DNA
<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)
<220>
<223> 合成的启动子
<400> 34
tacagggaca gcagagatcc agtttggact agcccggtcg cactagttct agaatttccc 60
ggaaataggg tgggcaagta tttccgggaa gttctagagg aagttttcgg ggactttccg 120
ggaattttct ctagatatta aggtgacgcg tgtggcctcg aacaccgagc gaccctgcag 180
cgacccgctt aaaagcggcc gccatgggcc gccatggcct cctccgagga cgtcatcaag 240
gagttcatgc 250
<210> 35
<211> 250
<212> DNA
<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)
<220>
<223> 合成的启动子
<400> 35
tacagggaca gcagagatcc agtttggact agcccggtcg cactagttct agaatttccg 60
ggaaataggg tgggcaagta tttcccggaa gttctagagg agattctcgg ggactttccg 120
ggggttctct ctagatatta aggtgacgcg tgtggcctcg aacaccgagc gaccctgcag 180
cgacccgctt aaaagcggcc gccatgggcc gccatggcct cctccgagga cgtcatcaag 240
gagttcatgc 250
<210> 36
<211> 250
<212> DNA
<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)
<220>
<223> 合成的启动子
<400> 36
tacagggaca gcagagatcc agtttggact agcccggtcg cactagttct agaatttccg 60
ggaagtaggg tgggcaagta cttccgggaa attctagagg gggtttccgg ggactttccg 120
gagattctct ctagatatta aggtgacgcg tgtggcctcg aacaccgagc gaccctgcag 180
cgacccgctt aaaagcggcc gccatgggcc gccatggcct cctccgagga cgtcatcaag 240
gagttcatgc 250
<210> 37
<211> 249
<212> DNA
<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)
<220>
<223> 合成的启动子
<400> 37
tacagggaca gcagagatcc agtttggact agcccggtcg cactagttct agaatttccg 60
ggaaataggg tgggcaagta tttcccggaa gttctagagg gggttttcgg ggactttccg 120
gaaattttct ctagatatta aggtgacgcg tgtggcctcg aacaccgagc gaccctgcag 180
cgacccgctt aaaagcggcc gccatgggcc ccatggcctc ctccgaggac gtcatcaagg 240
agttcatgc 249
<210> 38
<211> 249
<212> DNA
<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)
<220>
<223> 合成的启动子
<400> 38
tacagggaca gcagagatcc agtttggact agcccggtcg cactagttct agaacttccc 60
ggaaataggg tgggcaagta tttcccggaa gttctagagg aggttttcgg ggactttccg 120
ggattccctc tagatattaa ggtgacgcgt gtggcctcga acaccgagcg accctgcagc 180
gacccgctta aaagcggccg ccatgggccg ccatggcctc ctccgaggac gtcatcaagg 240
agttcatgc 249
<210> 39
<211> 243
<212> DNA
<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)
<220>
<223> 合成的启动子
<400> 39
tacagggaca gcagagatcc agtttggact agcccggtcg cactagttct agttccggga 60
agtgggtggg caatatttcc cggaagttta gaggaagttt tcggggactt ccggaaattc 120
cctctagata ttaaggtgac gcgtgtggcc tcgaacaccg agcgaccctg cagcgacccg 180
cttaaaagcg gccgccatgg gccgccatgg cctcctccga ggacgtcatc aaggagttca 240
tgc 243
<210> 40
<211> 200
<212> DNA
<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)
<220>
<223> 合成的启动子
<400> 40
tacagggaca gcagagatcc agtttggact agcccggtcg cactagttct agaacttctc 60
ggaaataggg tgggcaagta ctgtggcctc gaacaccgag cgaccctgca gcgacccgct 120
taaaagcggc cgccatgggc cgccatggcc tcctccgagg acgtcatcaa ggagttcatg 180
cagaccaagt ctctgctacc 200
<210> 41
<211> 250
<212> DNA
<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)
<220>
<223> 合成的启动子
<400> 41
tacagggaca gcagagatcc agtttggact agcccggtcg cactagttct agaayttccs 60
ggaartaggg tgggcaagta yttccsggaa rttctagagg rrrttyycgg ggactttccg 120
grrrttyyct ctagatatta aggtgacgcg tgtggcctcg aacaccgagc gaccctgcag 180
cgacccgctt aaaagcggcc gccatgggcc gccatggcct cctccgagga cgtcatcaag 240
gagttcatgc 250
<210> 42
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(ARTIFICAL SEQUENCE)
<400> 42
acgtggctgg agtcacagtc ctcttacgtg gctggagtca cagtcctctt 50
<210> 43
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(ARTIFICAL SEQUENCE)
<400> 43
rcgtgsctgg agtmacagtc ctcttrcgtg sctggagtma cagtcctctt 50
<210> 44
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(ARTIFICAL SEQUENCE)
<400> 44
acttccsgga artagggtgg gcaagtactt ccsggaart 39
<210> 45
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(ARTIFICAL SEQUENCE)
<400> 45
gggggtttyc ggggactttc cggrrrtttt 30
<210> 46
<211> 255
<212> DNA
<213> 人工序列(ARTIFICAL SEQUENCE)
<400> 46
acgtggctgg agtcacagtc ctcttacgtg gctggagtca cagtcctctt actagttcta 60
gaacttcccg gaagtagggt gggcaagtac ttcccggaag ttctagagga aattttcggg 120
gactttccgg gggttctctc tagatattaa ggtgacgcgt gtggcctcga acaccgagcg 180
accctgcagc gacccgctta aaagcggccg ccatgggccg ccatggcctc ctccgaggac 240
gtcatcaagg agttc 255
<210> 47
<211> 255
<212> DNA
<213> 人工序列(ARTIFICAL SEQUENCE)
<400> 47
aagaggactg tgactccagc cacgtaagag gactgtgact ccagccacgt actagttcta 60
gaacttcccg gaagtagggt gggcaagtac ttcccggaag ttctagagga aattttcggg 120
gactttccgg gggttctctc tagatattaa ggtgacgcgt gtggcctcga acaccgagcg 180
accctgcagc gacccgctta aaagcggccg ccatgggccg ccatggcctc ctccgaggac 240
gtcatcaagg agttc 255

Claims (29)

1.一种肿瘤微环境(TME)响应性表达载体，所述肿瘤微环境(TME)响应性表达载体包含：
编码合成的启动子的核酸序列，所述启动子包含一个或更多个TME依赖性启动子响应元件(PRE)；和编码效应物基因的核酸序列；其中所述TME响应性表达载体被设计成使得TME中存在的一种或更多种TME因子与所述启动子响应元件的结合诱导所述效应物基因的表达，并且其中在所述一种或更多种TME因子与所述启动子响应元件的结合不存在的情况下，低的效应物基因被表达或基本上没有效应物基因被表达。
2.根据权利要求1所述的TME响应性表达载体，其中所述TME依赖性PRE包括选自由以下组成的列表的一个或更多个序列元件：在炎性TME中活化的干扰素-γ(IFN-γ)PRE、TNF-αPRE、核因子κ-B(NF-κB)PRE、低氧PRE、热休克蛋白70(HSP-70)PRE、IL-6PRE、TGF-βPRE、IL-1PRE、IL-8PRE、IL-11PRE、IL-12PRE、IL-15PRE、IL-18PRE、IL-17PRE、IL-21PRE、IL-35PRE、GM-CSF PRE、肝生长因子(HGF)PRE、芳基氢受体(AhR)PRE或其任何组合。
3.根据权利要求1或2所述的TME响应性表达载体，其中所述效应物基因是嵌合抗原受体(CAR)。
4.根据前述权利要求中任一项所述的TME响应性表达载体，其中所述启动子响应元件包含与选自SEQ ID No 1-40中列出的核酸序列的核酸具有至少80％序列同源性的核酸序列或其任何组合。
5.根据前述权利要求中任一项所述的TME响应性表达载体，其中所述启动子响应元件包含与选自SEQ ID No 1-4中列出的核酸序列的核酸序列具有至少80％序列同源性的核酸序列。
6.根据前述权利要求中任一项所述的TME响应性表达载体，其中所述启动子响应元件包含与选自SEQ ID No 22-40中列出的核酸序列的核酸序列具有至少80％序列同源性的核酸序列或其任何组合。
7.根据权利要求1所述的TME响应性表达载体，其中所述启动子响应元件包含与SEQ IDNO:41中列出的核酸具有至少80％序列同源性的核酸序列。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的TME响应性表达载体，其中所述启动子响应元件包含两个或更多个启动子响应元件；并且其中所述一种或更多种TME因子与所述两个或更多个TME依赖性启动子响应元件的结合比当与单一TME依赖性启动子响应元件结合时诱导更高的CAR表达水平。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的TME响应性表达载体，所述TME响应性表达载体还包含外部诱导型启动子和反式激活因子；其中所述合成的启动子驱动所述反式激活因子的表达，并且其中所述外部诱导型启动子驱动所述CAR的表达；并且其中诱导物和所述TME因子的组合存在诱导CAR的表达。
10.根据权利要求9所述的TME响应性表达载体，其中，在外部诱导物存在且所述TME因子不存在的情况下，基本上没有检测到CAR表达。
11.根据权利要求9或10所述的TME响应性表达载体，其中，当所述TME因子在外部诱导物不存在的情况下结合所述启动子响应元件时，基本上没有检测到CAR表达。
12.根据权利要求9-11中任一项所述的TME响应性表达载体，其中所述外部诱导型启动子是Tet响应元件启动子，并且外部诱导物是多西环素和/或四环素，并且其中所述Tet响应元件通过所述反式激活因子和多西环素和/或四环素的组合存在而被活化。
13.根据权利要求12所述的TME响应性表达载体，其中所述反式激活因子是rtTA3。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的TME响应性表达载体，其中由CAR序列编码的CAR分子包含抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内结构域，所述胞内结构域包含共刺激结构域和/或初级信号传导结构域，其中所述抗原结合结构域与疾病相关肿瘤抗原结合。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的TME响应性表达载体，其中所述载体选自DNA载体、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。
16.一种免疫效应细胞，所述免疫效应细胞包含根据权利要求1-15中任一项所述的TME响应性表达载体。
17.根据权利要求16所述的免疫效应细胞，所述免疫效应细胞用于作为药物。
18.根据权利要求16所述的免疫效应细胞，所述免疫效应细胞用于治疗有相应需要的患者的肿瘤。
19.根据权利要求18所述的免疫效应细胞，其中所述肿瘤是实体瘤。
20.根据权利要求19所述的免疫效应细胞，其中所述实体瘤是肉瘤、癌或淋巴瘤。
21.根据权利要求20所述的免疫效应细胞，其中所述实体瘤是肺肿瘤、黑素瘤、结肠癌、乳腺肿瘤或脑肿瘤。
22.一种用于筛选肿瘤活检物以确定最佳的合成的启动子的方法，所述方法包括确定所述活检物中一种或更多种TME因子的表达水平；以及选择具有与患者的TME相匹配的TME依赖性启动子响应元件的TME响应型表达载体。
23.根据权利要求22所述的方法，所述方法还包括将所选择的TME响应性表达载体引入免疫效应细胞或细胞群体中。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述免疫效应细胞或细胞群体是NK细胞或T细胞。
25.根据权利要求23所述的方法，其中所述免疫效应细胞或细胞群体是所述患者自体的。
26.根据权利要求23所述的方法，其中所述免疫效应细胞或细胞群体是在治疗前从患者分离的免疫效应细胞或细胞群体。
27.根据权利要求23所述的方法，其中所述一种或更多种TME因子由肿瘤和/或非肿瘤TME细胞表达。
28.根据权利要求23所述的方法，其中选择具有与所述患者的TME相匹配的TME依赖性启动子响应元件的TME响应性表达载体包括合成所述TME依赖性启动子响应元件。
29.根据权利要求23所述的方法，其中选择具有与所述患者的TME相匹配的TME依赖性启动子响应元件的TME响应性表达载体包括从与所述患者的TME最佳匹配的TME依赖性启动子响应元件的文库中选择TME依赖性启动子响应元件。
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