CN1119654C - 生化制备液相色谱仪 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生化制备液相色谱仪,包括流动相贮罐、注入流动相的泵、阀、色谱柱、检测器、收集器以及控制数据采集和处理的色谱工作站,其中,所述泵为常压色谱蠕动泵和中压色谱钛泵,所述色谱柱为钛合金色谱柱,所述收集器为自动馏分收集器,并配备十通道阀按峰收集器,所述色谱工作站实现对泵、阀的控制。此设备能够很好用于生物工程产品的纯化,集常压和中压色谱分离于一身,体积较小、制备成本较低。
Description
本发明涉及一种生物工程产品纯化中的分离设备,具体涉及一种制备用的液相色谱仪。
生物制备色谱作为分离科学的一个重要分支受到了人们的高度重视并得到了广泛应用。在生物制药和生物工程领域里,用于制备规模纯化生物工程产品,它已成为分离提取蛋白、酶、抗体和核酸制剂或其他生化成分所必备的分离纯化手段。在生物工程产品纯化过程中,发酵液经离心、超滤浓缩后往往需要在常压色谱中进行组分的粗分离,分出需要的级分后再进行中压色谱精分离,以求制得合格产品。
目前,国内生产的液相色谱仪均为分析型的,生化制备色谱主要依赖进口。但,这些进口设备主要是一些通用设备,在专用于生化制备上不很理想,如自动化程度不高,特别是数据采集、分析、处理、报告和打印等工作,进口设备控制时间一般只有30-40分钟,而在基因工程产品生产工艺中,纯化过程往往持续几十小时甚至几天;同时,受制备色谱的分离时间长的限制,进口设备还不能用微机进行实时控制和处理,也不能用微机进行梯度洗脱控制、单泵流量控制及色谱流出组分的收集控制;另外,进口设备常压与中压分离需要两套设备,不仅在使用中带来不便,更会增加工程成本,目前尚未有常压、中压联用的制备液相色谱仪;还有,进口设备体积庞大,并采用箱式结构,虽然外观上较为美观,但操作和维护麻烦。
本发明的目的,在于提供一种能够很好用于生物工程产品的纯化,集常压和中压色谱分离于一身,具有适合的色谱工作站控制的,体积较小、制备成本较低的生化制备液相色谱仪。
为达到上述目的,采用下面技术方案:
本发明公开了一种生化制备液相色谱仪,包括流动相贮罐、注入流动相的泵、阀、色谱柱、检测器、收集器以及控制数据采集和处理的色谱工作站,其特征在于,所述泵为常压色谱蠕动泵和中压色谱钛泵,所述色谱柱为钛合金色谱柱,所述收集器为自动馏分收集器,或十通道阀按峰收集器,所述色谱工作站实现对泵、阀的控制。
上述生化制备液相色谱仪,所述色谱工作站为TL-2000智能化色谱工作站;所述流动相贮罐、注入流动相的泵、阀、色谱柱、检测器、收集器以及控制数据采集和处理的色谱工作站等结构上采用积木式;所述检测器单波长检测,波长为280nm,更换滤光片也可以改变波长。
采用上述设计和结构,具有下述优点:
1、由于实现蠕动泵和钛泵切换使用,使一台仪器可以先后作为常压色谱和中压色谱使用,经济实用,从而可降低生化制备的成本;
2、采用钛合金泵和钛合金色谱柱,具有良好的生物兼容性,使设备可专用于生物工程,适用于分离有活性的生化成分;
3、选用适合的并成功运行可进行外控泵、梯度和收集器的色谱工作站,工作流程全自动化;
4、采用十通道收集阀作为组分收集器,避免了待收集组分体积限制并使整机更协调,体积更小;
5、一次进样能够制备几百毫克至几十克样品,可选择性大,满足生物工程的需要。
以下结合附图详述本发明:
图1为本发明结构示意图;
图2为本发明系统结构图;
图3为本发明仪器中使用无极放电灯作为光源MP-D型紫外检测器长期稳定性测试曲线图;
图4为本发明仪器中用空心阴极灯作为光源的8823A型紫外检测器长期稳定性测试曲线图;
图5为本发明色谱工作站系统连接图;
图6为本发明仪器应用于分离中华眼镜蛇蛇毒色谱图;
图7为本发明仪器应用于分离血浆中有效成分色谱图;
图8为本发明仪器应用于分离血管内皮抑素色谱图;
图9为本发明仪器分离中华眼镜蛇蛇毒的重现性色谱图。
参见图1和图2,本发明的色谱仪包括流动相贮缶1、注入流动相的泵2、阀3、色谱柱5、检测器6、收集器7和色谱工作站8等部件,色谱工作站8完成数据采集、处理以及对泵、阀的控制。
本发明中所述泵2,常压色谱分离时采用蠕动泵,用于驱动液体通过色谱柱及其它液路。该蠕动泵特点是:
(1)蠕动泵是由一个中心轮串动5-8个滚轴,再转动时挤压弹性软管,使液体向一个方向挤压而达到输送液体的作用。一般的蠕动泵其滚轴都是被动的,即本身不自转,完全靠摩擦力转动并压过软管。软管受挤压会往一个方向延伸、拉长,最后可因磨损而断裂。本发明中选用的蠕动泵的滚轴是主动的,中心轮转动时,滚轴按相反方向旋转,使软管只受挤压而不拉伸。因此,软管的使用寿命得以延长。软管的磨损及更换会使流速改变,故使用本泵可取得长时间恒定的液流速度。
(2)为更换方便,蠕动泵可配有一般流量(0.01μl/分-30ml/分)及大流量(1ml/分-70ml/分)两种泵头。一般流量泵头有8个滚轴,大流量泵头有5个滚轴。滚轴越多,泵出溶液的脉动越小。
(3)蠕动泵需配有RS-232接口,通过此接口连接至色谱工作站8,由工作站控制其开、停及流速(操作方法见色谱工作站)。
(4)蠕动泵的软管一般为硅橡胶管,有各种内径可供选择,但管壁厚度应一致(1.5mm),否则不能使用。硅橡胶管只能耐受水、甲醇、乙醇和乙二醇等极性溶剂,遇丙酮、氯仿、乙酸乙酯和苯等非极性溶剂即被溶胀而不能使用。此时可改用Viton、氟橡胶或氟硅橡胶等特种软性材料管,或使用内衬四氟的硅橡胶管。硅橡胶管的抗撕裂强度低,不能遇锋利器具以防切出伤口而发生断裂。硅橡胶管可以耐受110高压灭菌。需无菌操作时可卸下,用布包好,灭菌后装上使用。
本发明选用的蠕动泵,可参照表1参数:
表1:本发明蠕动泵空载时流量范围
蠕动泵型号 | 泵管内径(mm) | 流量范围(ml/min) | 平均流量范围(ml/min) |
普通型 | 1.5 | 0.26~33.2 | 0.26~33.2 |
0.25~33.3 | |||
0.27~33.1 | |||
3.0 | 0.38~40.1 | 0.39~40.0 | |
0.40`39.9 | |||
0.39~40.0 | |||
大流量 | 6.0 | 0.71~200 | 0.70~200 |
0.70~200 | |||
0.69~200 | |||
8.0 | 1.73~610 | 1.75~610 | |
1.76~610 | |||
1.76~610 |
本发明用作中压色谱分离时,所述泵2采用钛合金泵。此钛泵应具有下述特点:
(1)流量为0.1-40ml/min或0.1-80ml/min的钛泵,详见表2。
(2)钛泵接触液体的部件由钛合金、氟塑料和宝石等材料制成。
(3)钛泵可用手动操作,键盘启动,也可以通过设置RS-232接口与色谱工作站连接,由工作站控制其开、停及流速(操作方法见色谱工作站)。
本发明的钛泵是定容量方式工作,所以应配有压力显示及过压和欠压保护功能。
表2:本发明钛泵空载时流量范围
钛泵型号 | 仪表指示(ml/min) | 流量范围(ml/min) | 平均流量范围(ml/min) |
#40 | 0.1~40 | 0.08~40 | 0.084~40 |
0.09~40 | |||
0.08~40 | |||
#80 | 0.1~80 | 0.08~86 | 0.086~85.2 |
0.09`85 | |||
0.08~85 |
本发明使用色谱柱5为不锈钢分析柱、常压玻璃柱和中压色谱钛合金柱以及高分子材质色谱柱。
本发明使用梯度阀3为24V DC三路二通切换阀,由色谱工作站驱动。
同时,使用七通阀31用于定量进样,与进样环或管32连接,位于泵2及柱5之间,设有装样、进样和洗涤三个位置。
本发明中从色谱柱5流出的洗脱液,携带了柱分离后被洗脱的各个成份,逐个流经紫外检测器6,产生吸收。以流出液体积与光密度作图就构成由一系列色谱峰组成的色谱图81。
紫外检测器6可以选择两种,即用无极放电灯作为光源的MP-D型紫外检测器和用空心阴极灯作为光源的8823A型紫外检测器。对这两种紫外检测器长期稳定性进行测试:将其置于层析冷柜中,定温于4~8℃,在检测池中充满2%异丙醇,开启紫外灯,将信号输出端连接至中央检测系统,同时检测系统、室温和层析冷柜上下两个位置的温度变化,测试时间为00,000分钟,记录其变化情况,见图3、图4。
依据测试结果,层析冷柜中的温度基本不影响紫外检测器的稳定性;从长期漂移情况看,MP-D长期稳定性稍优于8823A型,适用于工作时间较长的色谱分离;而经长期点燃使用后,8823A型稳定性有所改善,由于其波长更换较为方便,可适用于工作时间较短的色谱分离。
光源选用无极放电碘灯时,从顶端出光通过干涉滤色片选择单色光,波长一般用280nm,可以选购260nm,206nm等。分离蛋白一般用280nm,也可在206nm处取得更高的灵敏度(约为280nm处光吸收的50倍)。
本发明中此检测器可长期在层析冷柜中使用,最好在柜外室温时开灯起辉,然后将整套仪器移入冷柜,一旦移入冷柜就不再关灯。灯寿命>10,000小时,即可连续(昼夜不关)使用一年以上。如果有较长时间不用,则可将整套仪器从冷柜中移至室温下,放置2小时后再断电关灯,以免有冷气凝于电路中。该检测器可以手动使用(配记录仪),也可以与色谱工作站联用。
本发明中收集器7,可以使用北京新技术应用研究所或上海新波无线电厂生产的自动馏分收集器,这种收集器有定时、计滴功能,使用于小量组分的收集;还可以配备更为先进的1×10阀作为按峰收集用。收集器与色谱工作站联用。
本发明采用的色谱工作站,为泰立化电子技术有限公司开发的TL-2000型商业色谱工作站,该色谱工作站适用于本发明制备液相色谱仪的需要,除具有数据采集及处理功能外,还具有控制泵、阀式梯度、双泵内梯度和按峰收集等功能。
上述色谱工作站由智能调理控制单元、计算机主机、工作站软件三个主要部分组成,请参见附图2、5。
智能调理控制单元(简称调控单元)采用泰立化电子技术有限公司的TL-CSITU-8型智能调理单元。它由控制单元82和调理单元83组成。控制单元82用来对梯度洗脱电磁阀3、单机流量泵2和组分收集器7的控制;调理单元83用来将色谱仪检测器6输出的峰信号(模拟信号)转换成计算机可以识别的数字信号;
计算机主机84为工作站的载体;
工作站软件为泰立化电子技术有限公司开发TL-2000型智能化色谱工作站系统软件,将完成控制单元的控制及对峰信号的识别、处理、积分、计算,最终得到实验者需要的数据结果。
为完成本发明,需按下面条件运行色谱工作站:
准备色谱仪(GC,LC,CE或生化制备色谱仪,最多可同时控制四台套色谱系统);微型计算机一台:需有80586(或更高)处理器,内存32M,120M以上空闲硬盘,SVGA显示器(显示分辨率800×600),CPU主频100M,Win95或Win98操作平台,标准键盘一个,鼠标器一个,打印机一台;一台计算机最多可配四台智能调理控制单元,同时控制四套色谱系统。
色谱工作站的安装:
色谱工作站的安装分为硬件及软件两部分:
本发明色谱工作站主要由以下部分连接组成系统硬件:
主机1台,显示器1台,键盘1个,鼠标1个,打印机1台,软盘6张(工作站软件),色谱智能调理控制单元,视需求配置(1-4台),电缆线、信号线、数据线,遥控开关,每通道1个,加密狗1只。
其中,调理单元后面板设:
RS-232:标准数字通讯串口,通过数据线与对应的主机通讯口(com)连接。RS-232接口是调理单元和色谱工作站主机之间传榆数据和控制命令的一种接口。其形状可以为带有25针插孔的长方形。
多通道工作站配置多个调理单元。每个调理单元的RS-232通讯口通过数据线连接工作站主机的一个通讯口(com)。
REMOTE:遥控启动开关插孔。
当工作站主机距色谱仪较远时,为保证较为准确的保留时间,进样后不便用鼠标和键盘启动工作站采样程序,这种情况下,可以用遥控开关启动采样,方法是按一下开关顶部的按钮。
REMOTE插孔的形状可以是带有五个针的圆孔形。
INPUT:模拟信号输入端子。该端子通过信号线与色谱仪信号输出端连接,接受色谱仪检测器输出的模拟电压信号。
INPUT端子的形状可以是带有五个针的圆孔形。
FUSE:保险管,额定值0.2安培。
AC-LINE:交流电源插座,通过电源线接交流220V电源。
其中调理单元前面板设:
POWER:电源开关。
显示屏:用八位数码跟踪显示色谱仪输出的电信号。数码显示最左边一位是符号位,表示色谱电信号的极性“+[正]”或“-[负]”。中间六位十进制数字位显示色谱信号瞬时电压值,单位毫伏,以每秒一次的速率更新。最右边一位为量程位。
ZERO:调零按钮,它的功能是:按下此钮,工作站即以当前电压值作为相对零点。
该按钮一般用于下列几种情况:
当色谱仪输出信号不能再被继续调成零,其基线偏正或偏负,而操作者希望把该基线值作为参考零点(相对零点),以后的信号以此为基准时,可按一下此调零按钮,调理单元会自动将当前信号作为参考零点,数码显示变为零。
调理单元自校准调零。由于长期使用、季节或环境温度变化,调理单元本身也会发生零点漂移,这时如果需要也可以进行零点调整。
做高精度分析时,例如做高重复性实验,每次样品分析时间超过一小时,实验前后基线可能发生相对漂移,如果每次进样前进行零点调整,可保证分析结构的高精度。
F:量程选择按钮,连续按下此按钮可以切换量程,显示屏数码显示的最后一位会依次显示“H”(-20mV~+1180mV)、“L”、(-10mV~+140mV)“E”(-1.25mV~+1.25mV)。
其中,控制单元后面板主要包括24伏支流电源输入端(电磁阀)、电磁阀接线柱、组分收集器接线柱、组分收集器电源输入端、通信端口(控制两台蠕动泵)、通讯端口(控制两台钛泵)。
控制单元前面板主要包括:
RS-232标准数字通讯串口,通过数据线与对应的受空部件(如泵及收集器)的通讯口连接。RS-232标准数字通讯串口是控制单元和色谱工作站主机之间传输数据和控制命令的一种接口,其形状可以为带有5针插孔的长方形。
还包括控制单元电源开关和控制单元电源插座
将上面所述的调理单元和控制单元,以及鼠标、打印机和显示器与计算机主机连接起来。加密狗直接插在打印口上,再将打印电缆插在加密狗的另一端。
系统连接完毕检查无误后,依照软件说明书安装软件,调试软硬件,进行分离试验。
应用上述安装调试好的本发明的色谱仪,进行下面生物样品分离测试:
一、中华眼镜蛇蛇毒分离
中华眼镜蛇蛇毒中含有6%α-克痛宁,这是一种有很强止痛作用的肽类成分,分子量6960。有可能口服给药,大鼠剂量1.25-5μg/kg时痛阈明显升高,镇痛作用比吗啡强,药效持续时间也比吗啡长,并不具成瘾性。
离子交换色谱分离方式:Triacryl-CM为固定相(5ml),乙酸铵为流动相,阀式梯度(0.05M,pH5.0~0.5M,pH7.0;0.5M,pH7.0~1M,pH7.0),上样量50mg(2ml),流速1.0ml/min,λ=280nm。
分离结果参见图6。一次色谱分离了50毫克蛇毒,其中标有“↓”的峰为克痛宁峰,多次重复分离都得到满意结果,重复性很好。
二、血液制品中有效成分的分离
人血浆中含有许多有用成分,抗凝血酶III是人血浆中的一种抗凝血蛋白,它可以用于心脏搭桥手术中作抗凝剂,无抗原性,无毒无害,在人血浆中含量为每百毫升29毫克。
亲合色谱分离方式:肝素为固定相(4ml),Tris-HCL为流动相,阀式梯度,上样量75ml,流速7.0ml/min,λ=280nm。
分离结果参见图7,有箭头的峰表示有抗凝活性的峰,只要放大色谱柱就可以得到较多的抗凝血酶III。20余分钟可完成依次分离,得到满意的分离结果。
三、生物工程制品-血管内皮抑素的分离
基因重组的血管内皮抑素,是一种分子量30000左右的重组蛋白,能阻止肿瘤组织周围微血管内皮生长,从而达到抑制肿瘤生长和弥散。
亲合色谱分离方式:肝素为固定相(25ml),Tris-HCL为流动相,阀式梯度,上样量10 mg(15ml),流速1.0ml/min,λ=218nm。
分离色谱参见图8,得到满意的分离结果。
四、利用本发明色谱仪分离中华眼镜蛇蛇毒重现性的测定:
以中华眼镜蛇蛇毒为样品,在30×20mm Triacryl-CM色谱柱上分别进样50mg和40mg,用相同的梯度洗脱条件进行分离,记录分离结果见图9。
从测试结果可以看出,本发明制备液相色谱仪,在分离复杂蛋白组分时可以得到重现性较好的分离结果,能应用于实际样品的制备分离纯化。
五、本发明制备液相色谱仪回收率实验
1.实验材料:
样品:1%IgG(人)生理盐水溶液;
洗脱液A:0.01mol/L Tris-HCL,pH7.4;
洗脱液B:0.01mol/L Tris-HCI+0.05mol/L NaCl,pH7.4;
色谱柱:DEAE-Trisacryl离子交换柱(20×32mm,5ml);
1×5ml容量瓶,5×10ml容量瓶,1×100ml容量瓶,500μl定量进样管,10ml注射器;
本发明生化制备液相色谱仪,Spectrumlab 22型紫外可见分光光度计。
2.实验条件:
进样:500μl;检测波长:280nm;流速:1.2ml/min;平行五次试验。
阀式梯度洗脱:
时间(min) | B% |
0.0 | 0 |
19.0 | 100 |
19.2 | 100 |
20.5 | 100 |
21.0 | 0 |
25.0 | 0 |
3.实验结果:
用10.00ml容量瓶定量收集色谱柱流出组分,备测。平行五次试验,分别用五只10.00ml容量瓶进行收集。
在Speictrumlab 22型紫外可见分光光度计280nm处,以洗脱液A与洗脱液B的混合液(各占50%)作为空白吸收溶液,分别测定10.00ml容量瓶收集的色谱柱流出组分的吸光度值Ai(I=1,2,3,4,5)。
取1%IgG生理盐水溶液5ml并用空白吸收溶液稀释定容至100ml容量瓶中,按上述方法测定其吸光度值As。
回收率(R)的计算:
因为,A=abc;所以R=Ai/As
计算结果见下表。
表:回收率试验结果
A1 As Ri(%) R(%)
0.760 97.69
0.802 103.08
101.46
0.790 0.778 101.54
0.810 104.11
0.785 100.90
由上表可知,平均回收率是101.46%。
从以上测试中,可以看出,本发明提供的制备色谱仪,分离效果明显,回收率较高,操作过程中,色谱站工作正常。
Claims (4)
1、一种生化制备液相色谱仪,包括流动相贮罐、注入流动相的泵、阀、色谱柱、检测器、收集器以及控制数据采集和处理的色谱工作站,其特征在于,所述泵为常压色谱蠕动泵和中压色谱钛泵,所述色谱柱为钛合金色谱柱,所述收集器为自动馏分收集器,或十通道阀按峰收集器,所述色谱工作站实现对泵、阀的控制。
2、根据权利要求1所述的生化制备液相色谱仪,其特征在于,所述色谱工作站为泰立化电子技术有限公司开发的TL-2000智能化商业色谱工作站。
3、根据权利要求1所述的生化制备液相色谱仪,其特征在于,所述流动相贮罐、注入流动相的泵、阀、色谱柱、检测器、收集器以及控制数据采集和处理的色谱工作站等结构上采用积木式。
4、根据权利要求1所述的生化制备液相色谱仪,其特征在于,所述检测器单波长检测,波长为280nm,更换滤光片也可以改变波长。
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