CN111965281A - 一种依克多因的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种依克多因的检测方法，所述方法包括使用高效液相色谱法对依克多因进行检测，所述高效液相色谱法的色谱条件如下：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A是甲醇，所述流动相B是磷酸二氢钠溶液。本发明提供的依克多因的检测方法操作简单、检测时间短、分离效果好、精密度和准确度高、节省溶剂、样品制备便捷、能够用于快速准确检测依克多因。

Description

一种依克多因的检测方法
技术领域
本发明涉及高效液相色谱检测领域，且更为具体地涉及一种依克多因的检测方法。
背景技术
依克多因(Ectoine)，又称四氢嘧啶(化学名为1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸，英文名为1,4,5,6-tetrahydro-2-methyl-4-pyrimidinecarboxylic acid)，是一种环状氨基酸衍生物，它能在高盐、热变性、干燥、冰冻等极端环境下，被用作酶、核酸、膜及细胞的保护剂及稳定剂，因此在酶剂生产、医学、保健食品以及化妆品工业等领域具有广泛的应用前景。
目前，依克多因的检测方法主要是采用高效液相色谱法，但是它一种强烈的亲水性物质，在常规的色谱条件或常规反相色谱柱上的保留很弱，其应用范围主要在原料或水质中，对于基质比较复杂的化妆品领域还未有报道。其中，李耀东、龙启福、李文军等的高效液相色谱检测青海湖嗜盐菌胞内积聚的相溶物质四氢嘧啶一文采用乙腈/甲醇(V/V,95:5)EClipse XDB-C18柱(150×4.6mm)，柱温20℃，流速1.0mL/min，检测波长204nm等色谱条件分析Ectoine，文献中指出该色谱条件下Ectoine的保留时间为1.400-1.429min，从文献结果及色谱柱特性可知被分析物在该色谱条件及色谱柱上并未保留。贺冰,陶萍,陈爱连等的亲水相互作用色谱法测定中度嗜盐菌中四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶一文中采用亲水性色谱柱Merck-SeQuant ZIC-HILIC(150×4.6mm，5μm)，流动相乙腈:0.3％磷酸二氢钠缓冲液(pH5)＝80：20(V/V)，流速1mL/min，检测波长210nm，柱温30℃条件下分析，其四氢嘧啶保留时间在12分钟以上，时间较长，且分析成本较高。专利CN108120792A也公开了一种四氢嘧啶的高效液相检测及含量测定方法，该专利中采用Shiseido CAPCELL PAK ADME(250×4.6mm，5μm)色谱柱，流动相为甲醇/20mM磷酸二氢钾水溶液(磷酸调pH至3.0)＝5/95(V/V)，柱温为30℃，流速为1mL/min，检测波长为204nm等色谱条件对四氢嘧啶进行检测，该专利中四氢嘧啶的保留时间为3.739min，从其结果可知，被分析物在色谱柱上的保留也不是很理想，且该专利中的色谱柱为非常规分析色谱柱，成本较高。
发明内容
针对现有技术存在的依克多因检测方法的不足。本发明通过选择合适的色谱条件，提供一种依克多因的检测方法。
具体来说，本发明涉及如下的技术方案：
1、一种依克多因的检测方法，其特征在于，包括使用高效液相色谱法对依克多因进行检测，所述高效液相色谱法的色谱条件如下：
色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；
流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A是甲醇，所述流动相B是磷酸二氢钠溶液。
2、根据项1所述的依克多因的检测方法，其特征在于，所述十八烷基硅烷键合硅胶柱为Poroshell 120EC-C18色谱柱。
3、根据项1或2所述的依克多因的检测方法，其特征在于，所述色谱柱的柱长为50-250mm，优选为100-250mm。
4、根据项1-3任一项所述的依克多因的检测方法，其特征在于，所述磷酸二氢钠溶液还包含1-庚烷磺酸钠，其中所述磷酸二氢钠溶液中磷酸二氢钠的浓度为5-100mM，优选为10-50mM，所述磷酸二氢钠溶液中1-庚烷磺酸钠的浓度为1-20mM，优选为5-15mM。
5、根据项1-4任一项所述的依克多因的检测方法，其特征在于，所述磷酸二氢钠溶液的pH为2.5-3.5。
6、根据项1-5任一项所述的依克多因的检测方法，其特征在于，所述流动相A与所述流动相B的体积比为(5-20)：(95-80)，优选为(5-10):(95-90)。
7、根据项1-6任一项所述的依克多因的检测方法，其特征在于，所述流动相流速为0.2-2.0mL/min，优选为0.5-1.0mL/min。
8、根据项1-7任一项所述的依克多因的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法中色谱柱的柱温为20-50℃，优选为25-40℃。
9、根据项1-8任一项所述的依克多因的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法中检测器为紫外检测器或二极管阵列检测器。
10、根据项9所述的依克多因的检测方法，其特征在于，检测波长为200-220nm，优选为210nm。
11、根据项1-10任一项所述的依克多因的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法中进样量为0.5-20μL，优选为1-2μL。
12、根据项1-11任一项所述的依克多因的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法的洗脱方式为等度洗脱。
本发明提供的依克多因的检测方法操作简单、检测时间短、分离效果好、精密度和准确度高、节省溶剂、样品制备便捷、能够用于快速准确检测依克多因。
附图说明
图1为实施例1中依克多因的色谱图。
图2为实施例2中依克多因的色谱图
图3为对比例1中依克多因的色谱图。
图4为对比例2中依克多因的色谱图。
图5为依克多因浓度-峰面积的标准曲线。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本发明，并非用于限制本发明。
除非另外定义，本说明书中有关技术的和科学的术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述相似或相同的方法和材料，本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下，以本说明书包括其中定义为准，另外，材料、方法和例子仅供说明，而不具限制性。以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但不用来限制本发明的范围。
依克多因(Ectoine)，又称四氢嘧啶(化学名为1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸，英文名为1,4,5,6-tetrahydro-2-methyl-4-pyrimidinecarboxylic acid)，是一种环状氨基酸衍生物。目前，依克多因的检测方法主要是采用高效液相色谱法，但是它一种强烈的亲水性物质，在常规的色谱条件或常规反相色谱柱上的保留很弱。虽然已有使用亲水性色谱柱Merck-SeQuant ZIC-HILIC(150ck-SeQ，5μm)，流动相乙腈:0.3％磷酸二氢钠缓冲液，Shiseido CAPCELL PAK ADME(250seido，5μm)色谱柱，流动相为甲醇/20mM磷酸二氢钾水溶液检测依克多因的报道，但是依克多因的保留时间不理想，其分析成本较高。因此，目前还没有使用常规色谱柱有效检测依克多因的方法。
本发明提供一种依克多因的检测方法，所述方法包括使用高效液相色谱法对依克多因进行检测，所述高效液相色谱法的色谱条件如下：
色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；
流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A是甲醇，所述流动相B是磷酸二氢钠溶液。
十八烷基硅烷键合硅胶柱是一个常规的色谱柱，目前大多数色谱厂家，如waters、岛津、phenomenex、Agilent、迪马等公司都有十八烷基硅烷键合硅胶柱。在一个优选的实施方案中，所述十八烷基硅烷键合硅胶柱为Poroshell 120EC-C18色谱柱，为美国Agilent公司生产。
所述十八烷基硅烷键合硅胶柱的柱长为50-250mm，优选为100-250mm。在仪器压力条件允许的情况下，比如使用超高效液相色谱仪时，更优选所使用的十八烷基硅烷键合硅胶柱的柱长为100mm。色谱柱为色谱厂家提供的规格，柱长的选择要根据测定的物质和具体的色谱条件综合考虑。目前十八烷基硅烷键合硅胶柱主要有50mm、100mm、150mm、250mm四个规格，其中50mm、100mm的色谱柱的内径会小一点，3mm左右，通常为超高效液相色谱(UPLC)的优选项，优点是溶剂节省、分析时间短。
在一个具体的实施方案中，所述流动相B，即磷酸二氢钠溶液还包含1-庚烷磺酸钠。其中，在所述磷酸二氢钠溶液中磷酸二氢钠的浓度为5-100mM，优选为10-50mM，例如可以为5mM，10mM，20mM，30mM，40mM，50mM，60mM，70mM，80mM，90mM，100mM。所述磷酸二氢钠溶液中1-庚烷磺酸钠的浓度为1-20mM，优选为5-15mM，例如可以为1mM，2mM，3mM，4mM，5mM，10mM，15mM，20mM。所述磷酸二氢钠溶液的pH使用磷酸进行调节至2.5-3.5，例如可以为2.5，2.6，2.7，2.8，2.9，3.0，3.1，3.2，3.3，3.4，3.5。
在一个具体的实施方案中，所述流动相A与所述流动相B的体积比为(5-20)：(95-80)，优选为(5-10):(95-90)，例如可以为5:95，6:94，7:93，8:92，9:91，10:90，12:88，15:85，18:82，20:80。
在一个具体的实施方案中，所述流动相的流速为0.2-2.0mL/min，例如可以为0.2mL/min，0.5mL/min，0.8mL/min，1.0mL/min，1.2mL/min，1.5mL/min，1.8mL/min，2.0mL/min。优选为0.5-1.0mL/min。流动相的流速可以根据选用的具体色谱柱的类型，柱长等因素进行调整。例如当使用100mm长的色谱柱时，流动相的流速优选为0.5-1.0mL/min，当使用250mm长的色谱柱时，流速优选为1.0-1.5mL/min。
在一个具体的实施方案中，所述高效液相色谱法中色谱柱的柱温为20-50℃，例如可以为20℃，22℃，25℃，28℃，30℃，32℃，35℃，40℃，45℃,50℃。优选为25-40℃。
在一个具体的实施方案中，所述高效液相色谱法中检测器为紫外检测器(UV检测器)或二极管阵列检测器(DAD检测器)。检测波长为200-220nm，优选为210nm。
在一个具体的实施方案中，所述高效液相色谱法中进样量为0.5-20μL，例如可以为0.5μL，1μL，2μL，5μL，8μL，10μL，12μL，15μL，20μL。优选为1～2μL。具体的在使用时，可根据选用的色谱柱和流动相等条件的不同进行调整。比如为了避免待测样溶剂效应，100mm长色谱柱优选1-2μL，250mm长色谱柱优选5-10μL。
在一个具体的实施方式中，所述高效液相色谱法的洗脱方式为等度洗脱。其中，等度洗脱是指在样品组分的分析周期中，流动相的组成比例和流速恒定不变的洗脱方式。
本发明使用传统的十八烷基硅烷键合硅胶柱，通过采用由流动相A甲醇和流动相B含有磷酸二氢钠和1-庚烷磺酸钠的溶液组成的流动相，并精确控制流动相流速(0.5-1.0mL/min)、A和B的体积比((5-20)：(95-80))、流动相B的磷酸盐和1-庚烷磺酸钠、pH(磷酸二氢钠的浓度为5-100mM、1-庚烷磺酸钠的浓度为1-20mM，pH为2.5-3.5)等条件使得依克多因在色谱柱上能有效的保留，并保持良好的峰形。比如在0.5-1.0ml/min的流速下，所有实施例中依克多因的保留时间在0.9-1.5min，而拖尾因子均在1.0左右。从而获得了使用传统十八烷基硅烷键合硅胶柱检测依克多因的检测方法，克服了传统十八烷基硅烷键合硅胶柱无法进行依克多因检测的技术偏见(如CN108120792)。
本发明所使用的仪器和材料如下：
仪器与试剂：超高效液相色谱仪Agilent 1260Prime(美国Agilent公司)，配DAD检测器；色谱柱：Poroshell 120EC-C18(3.0×100mm，2.7μm，美国Agilent公司)；甲醇，HPLC级，Merck；乙腈，HPLC级，Merck；依克多因(华熙生物科技股份有限公司)；超纯水机Milli-Q，Merck；磷酸二氢钠·二水，HPLC级，上海安谱公司；磷酸二氢钾，HPLC级，上海安谱公司；1-庚烷磺酸钠，HPLC级，Fisher公司；磷酸，HPLC级，上海安谱公司。
实施例1
配制供试品溶液：取适量依克多因对照品用50％甲醇水溶解，并制成浓度为100μg/mL的溶液。
色谱条件为：
色谱柱：Poroshell 120EC-C18(3.0×100mm，2.7μm)
流动相：流动相A(甲醇)：流动相B(磷酸二氢钠缓冲溶液)＝5:95，其中流动相B中，磷酸二氢钠的浓度为40mM，1-庚烷磺酸钠浓度为10mM，pH为3.0。具体的操作步骤为，取适量的二水合磷酸二氢钠和1-庚烷磺酸钠溶于1000mL水中，用磷酸调节pH至3.0。
流速：0.5ml/min
进样量：1μL
柱温：25℃
检测波长：210nm
洗脱方式：等度洗脱
按照上述色谱条件对供试品溶液进行检测，得到的依克多因供试品的色谱图如图1所示。由图1可以看出依克多因具有良好的峰形，保留时间为2.894min，拖尾因子(T)为1.02，拖尾因子(T)是用于评价色谱峰对称性的参数，一般理想的T值应在0.95～1.05之间。该色谱柱在该色谱条件下的死时间为1.0min，因也依克多因在色谱柱上得到很大的保留，满足检测的需要。
实施例2
实施例2与实施例1的不同之处在于，流速采用0.8ml/min，其他条件与实施例1相同。得到的依克多因供试品的色谱图如图2所示。由图2可以看出依克多因具有良好的峰形，保留时间为1.92min，拖尾因子(T)为1.04。该色谱柱在该色谱条件下的死时间为0.6min。与实施例1相比，该色谱条件下依克多因在色谱柱上同样保留优秀，且本实施例中依克多因的峰形更窄更好，能满足检测的要求。
实施例3
实施例3与实施例2的不同之处在于，柱温采用45℃，其他条件与实施例2相同。得到的依克多因峰的保留时间为1.56min，拖尾因子(T)为1.02。该色谱柱在该色谱条件下的死时间为0.6min，因此1.56min的保留时间能满足检测的要求。
实施例4实施例4与实施例2的不同之处在于，流动相A(甲醇)：流动相B(磷酸二氢钠缓冲溶液)＝6:94，流动相B中磷酸二氢钠的浓度为10mM，1-庚烷磺酸钠的浓度为5mM，其他条件与实施例2相同。得到的依克多因的保留时间为1.699min，色谱峰的拖尾因子为1.06，色谱峰形良好，1.699min的保留时间能满足检测的要求。
实施例5
实施例5与实施例2的不同之处在于，流动相A(甲醇)：流动相B(磷酸二氢钠缓冲溶液)＝7:93，流动相B中磷酸二氢钠的浓度为50mM，流动相B中1-庚烷磺酸钠的浓度为15mMpH为3.5，其他条件与实施例2相同。得到的依克多因的保留时间为2.21min，色谱峰的拖尾因子为1.00，色谱峰形良好，2.21min的保留时间能满足检测的要求。
实施例6
实施例6与实施例2的不同之处在于，流动相A(甲醇)：流动相B(磷酸二氢钠缓冲溶液)＝20:80，流动相B中磷酸二氢钠的浓度为20mM，流动相B中磷酸二氢钠的浓度为20mM，1-庚烷磺酸钠的浓度为20mM，pH为2.5，柱温为40℃，流速为1.0ml/min，其他条件与实施例2相同。得到的依克多因的保留时间为2.436min，色谱峰的拖尾因子为0.96，色谱峰形良好，2.436min的保留时间能满足检测的要求。
实施例7
实施例7与实施例2的不同之处在于流动相：流动相A(甲醇)：流动相B(磷酸二氢钠缓冲溶液)＝10:90，流动相B中磷酸二氢钠的浓度为100mM，1-庚烷磺酸钠浓度为1mM，流速为0.9ml/min，其他条件与实施例2相同。得到的依克多因峰的保留时间为0.91min，拖尾因子(T)为1.04。该色谱柱在该色谱条件下的死时间为0.47min，因此0.91min的保留时间能满足检测的要求。
对比例1
对比例1与实施例1的区别在于，所使用的流动相不同。对比例1中使用乙腈作为A相，以5mM的磷酸二氢钾溶液作为B相。其他反应条件同实施例1相同。得到的依克多因供试品的色谱图如图3所示。由图3可以看出依克多因的保留时间为0.956min。该色谱柱在该色谱条件下的死时间为1.0min，依克多因在色谱柱的死时间出峰，所以基本无保留，不能满足检测的需要。
对比例2
对比例2与实施例1的区别在于，所使用的流动相不同。对比例1中使用甲醇作为A相，以5mM的磷酸二氢钾溶液作为B相。其他反应条件同实施例1相同。得到的依克多因供试品的色谱图如图4所示。由图4可以看出依克多因的保留时间为1.032min。该色谱柱在该色谱条件下的死时间为1.0min，依克多因在色谱柱的死时间出峰，所以基本无保留，不能满足检测的需要。
对比例3
对比例3与实施例2的不同之处在于，流动相B中不含1-庚烷磺酸钠，其他条件与实施例2相同。得到的依克多因的保留时间为0.825min，色谱峰的拖尾因子为0.60，在该条件下依克多因基本无保留，且峰形差，不能满足检测的需要。
对比例4
对比例4与实施例2的不同之处在于，流动相A:B为25:75，其他条件与实施例2相同。依克多因的保留时间早于该色谱条件下的死时间0.6min，因此不能满足检测的需要。
对比例5
对比例5与实施例2的不同之处在于，流动相B中磷酸盐的浓度为4mM，其他条件与实施例2相同。得到的依克多因的保留时间为2.936min，色谱峰的拖尾因子为1.64，在该条件下依克多因的色谱峰拖尾严重，流动相的洗脱能力弱，不能满足检测的需要。
对比例6
对比例6与实施例2的不同之处在于，流动相B中磷酸盐的浓度为120mM，其他条件与实施例2相同。在该条件下依克多因出峰早、拖尾严重，而且磷酸盐的浓度太高，由于容易析出，易造成系统压力偏高，对仪器和色谱柱不利，不能满足检测的需要。
对比例7
对比例7与实施例2的不同之处在于，B中1-庚烷磺酸钠浓度为25mM，其他条件与实施例2相同。该条件中由于1-庚烷磺酸钠属于阳离子表面活性剂，其浓度高，会产生大量的泡沫，易污染仪器系统，难冲洗，系统平衡时间长，不能满足检测的需要。
对比例8
对比例8与实施例2的不同之处在于，B中用磷酸调节pH至2.0其他条件与实施例2相同。得到的依克多因的保留时间为3.684min，色谱峰的拖尾因子为1.39，在该条件下依克多因的色谱峰拖尾，不能满足检测的需要。
对比例9
对比例9与实施例2的不同之处在于，B中用磷酸调节pH至4.0其他条件与实施例2相同。得到的依克多因的保留时间为0.995min，色谱峰的拖尾因子为1.38，在该条件下依克多因出峰早且拖尾，可知，pH值对依克多因的分析影响较大，不能满足检测的需要。
综上所述，实施例1-7和对比例1-9的色谱条件如表1所示。
表1各实施例和对比例的色谱条件
Figure BDA0002636138990000091
Figure BDA0002636138990000101
通过上述实施例中的色谱检测条件，可进一步制作该条件下依克多因浓度和峰面积的标准曲线。具体的操作步骤为：精密称取依克多因对照品0.1g(精确至0.0001g)，置于25mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，制成4mg/mL的标准储备液。并分别取一定体积的标准储备液，用50％甲醇水溶液稀释至一系列不同溶度的标准溶液。按选定的色谱条件测定，对系列标准溶液进行测定，以依克多因的浓度(x，μg/mL)为横坐标，峰面积(y)为纵坐标绘制标准工作曲线，计算回归方程。以实施例2中的色谱条件获得依克多因的线性方程为y＝3.2204x-2.6644，相关系数r2＝0.9999，如图5所示。图5的结果表明依克多因在8～800μg/mL范围内线性关系良好。通过得到的线性方程，根据色谱的峰面积计算可得待测样品依克多因的含量。

Claims (10)

1.一种依克多因的检测方法，其特征在于，包括使用高效液相色谱法对依克多因进行检测，所述高效液相色谱法的色谱条件如下：
色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；
流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A是甲醇，所述流动相B是磷酸二氢钠溶液。
2.根据权利要求1所述的依克多因的检测方法，其特征在于，所述十八烷基硅烷键合硅胶柱为Poroshell 120EC-C18色谱柱。
3.根据权利要求1或2所述的依克多因的检测方法，其特征在于，所述色谱柱的柱长为50-250mm，优选为100-250mm。
4.根据权利要求1-3任一项所述的依克多因的检测方法，其特征在于，所述磷酸二氢钠溶液还包含1-庚烷磺酸钠，其中所述磷酸二氢钠溶液中磷酸二氢钠的浓度为5-100mM，优选为10-50mM，所述磷酸二氢钠溶液中1-庚烷磺酸钠的浓度为1-20mM，优选为5-15mM。
5.根据权利要求1-4任一项所述的依克多因的检测方法，其特征在于，所述磷酸二氢钠溶液的pH为2.5-3.5。
6.根据权利要求1-5任一项所述的依克多因的检测方法，其特征在于，所述流动相A与所述流动相B的体积比为(5-20)：(95-80)，优选为(5-10):(95-90)。
7.根据权利要求1-6任一项所述的依克多因的检测方法，其特征在于，所述流动相流速为0.2-2.0mL/min，优选为0.5-1.0mL/min。
8.根据权利要求1-7任一项所述的依克多因的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法中色谱柱的柱温为20-50℃，优选为25-40℃。
9.根据权利要求1-8任一项所述的依克多因的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法中检测器为紫外检测器或二极管阵列检测器。
10.根据权利要求9所述的依克多因的检测方法，其特征在于，检测波长为200-220nm，优选为210nm。
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