CN111961058B - 4-氨基-吡咯并三嗪衍生物及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了4‑氨基‑吡咯并三嗪衍生物及其制备方法和用途，其中，4‑氨基‑吡咯并三嗪衍生物由阿魏酸衍生物部分和4‑氨基‑吡咯并三嗪部分组成，4‑氨基‑吡咯并三嗪衍生物的制备中，首先由阿魏酸与对羟基苯甲酰氯制备得到阿魏酸衍生物，将阿魏酸衍生物用草酰氯进行酰氯化，然后与4‑氨基‑吡咯并三嗪反应生成4‑氨基‑吡咯并三嗪衍生物。本发明得到的4‑氨基‑吡咯并三嗪衍生物抗的肿瘤效果好，4‑氨基‑吡咯并三嗪衍生物在抗肿瘤细胞中的IC50的浓度不高于12μM，对CDC25B的抑制效果好，抑制效果至少达到了95％，同时具有抗菌效果，抑菌圈至少达到了10mm。

Description

4-氨基-吡咯并三嗪衍生物及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及一种4-氨基-吡咯并三嗪衍生物及其制备方法和用途。
背景技术
在当今世界范围内，癌症已成为了快速增长的流行性疾病，严重影响着人类的健康。因此，长期以来各国政府都对肿瘤的研究给以了高度关注，在很多方面也取得了重大进展。药物治疗是肿瘤治疗中发展最快的，目前它已经成为了临床治疗恶性肿瘤的重要方法之一。以肿瘤发生机制、关键信号通路和调控因子为靶向的治疗具有特异性抗肿瘤作用。并且毒性明显减少，是目前肿瘤研究的热点，也是解决目前肿瘤临床治疗问题的重要研究方向。细胞周期紊乱是肿瘤最主要的发生机制。调控因子细胞分裂周期25B双特异性磷酸酶(cell division cycle 25B dual specificity phosphatase，CDC25B)过量表达可促进肿瘤的发生，同时在响应DNA损伤激活的细胞周期检查点和在调控细胞周期过程中都起关键作用，使其成为极具潜力的肿瘤治疗靶点之一。
目前，虽然已有多种CDC25B的抑制剂被报道，且已经取得了一些有希望的进步，但在这一领域能具有临床活性的候选抑制剂并未出现。因此，发现结构新颖的CDC25B抑制剂是非常需要的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种对CDC25B具有抑制效果的、可用于抗肿瘤药物、具有抑菌效果的4-氨基-吡咯并三嗪衍生物。
一种4-氨基-吡咯并三嗪衍生物，
Figure BDA0002615882380000011
其中，R的通式为C17H14O5。
优选地，阿魏酸衍生物的分子式为
Figure BDA0002615882380000012
本发明的另一目的在于提供一种对CDC25B具有抑制效果的、可用于抗肿瘤药物中的、具有抑菌效果的4-氨基-吡咯并三嗪衍生物的制备方法。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
一种4-氨基-吡咯并三嗪衍生物的制备方法，将阿魏酸与对羟基苯甲酰氯在氢氧化钠溶液中制备得到阿魏酸衍生物，将阿魏酸衍生物与草酰氯在引发剂作用下反应得到酰氯化阿魏酸衍生物，酰氯化阿魏酸衍生物与4-氨基-吡咯并三嗪在缚酸剂的作用下得到4-氨基-吡咯并三嗪衍生物。经过阿魏酸衍生物制备得到4-氨基-吡咯并三嗪衍生物对肿瘤细胞具有优异的防治效果，对CDC25B蛋白酶具有抑制效果，同时发现4-氨基-吡咯并三嗪衍生物具有抑菌效果，提高机体免疫力。
优选地，阿魏酸衍生物的制备中，将阿魏酸加入氢氧化钠的溶液中溶解，冰浴下搅拌0.5-5h，加入对羟基苯甲酰氯，在温度为80-100℃下搅拌反应3-9h，反应完毕后调pH6-7，抽滤，水洗，烘干得到阿魏酸衍生物；阿魏酸的添加量为氢氧化钠溶液的5-20wt％；氢氧化钠溶液的质量分数为2-15wt％；对羟基苯甲酰氯的添加量为阿魏酸80-90wt％。
优选地，酰氯化阿魏酸衍生物的制备中，将阿魏酸衍生物加入二氯甲烷中，搅拌混合，加入引发剂二甲氨基甲酰胺，回流反应0.5-3h，加入草酰氯，搅拌回流反应3-12h，反应完毕后，蒸干溶剂，再加入二氯甲烷蒸干草酰氯，得到酰氯化阿魏酸衍生物；阿魏酸衍生物的添加量为二氯甲烷的1-8wt％；引发剂二甲氨基甲酰胺的添加量为阿魏酸衍生物的0.1-1wt％；草酰氯的添加量为阿魏酸衍生物的50-90wt％。
优选地，4-氨基-吡咯并三嗪衍生物的制备中，将4-氨基-吡咯并三嗪加入乙腈中，加入缚酸剂三乙胺，冰浴中搅拌0.5-3h，滴加含酰氯化阿魏酸衍生物的乙腈溶液，在20-35℃的温度下反应3-12h，反应后旋干溶剂得到粗产物，粗产物经硅胶柱层析纯化得到4-氨基-吡咯并三嗪衍生物；4-氨基-吡咯并三嗪的添加量为乙腈的2-8wt％；缚酸剂的添加量为4-氨基-吡咯并三嗪衍生物的90-120wt％；酰氯化阿魏酸衍生物的乙腈溶液的质量分数为30-50wt％，酰氯化阿魏酸衍生物的乙腈溶液的添加量为4-氨基-吡咯并三嗪的乙腈溶液的25-55wt％。
优选地，抗肿瘤细胞治疗中，在加入4-氨基-吡咯并三嗪衍生物的同时还可以协同加入香叶醇和蒙花苷；香叶醇的添加量为4-氨基-吡咯并三嗪衍生物的3-15wt％，蒙花苷的添加量为4-氨基-吡咯并三嗪衍生物的1-10wt％。香叶醇和蒙花苷一起可以增益4-氨基-吡咯并三嗪衍生物的活性，提高了4-氨基-吡咯并三嗪衍生物的抗肿瘤活性及对CDC25B的抑制作用，提高对治疗效果。
本发明还公开4-氨基-吡咯并三嗪衍生物在制备抗肿瘤药物和/或提高免疫力药物中的用途。
优选地，4-氨基-吡咯并三嗪衍生物、香叶醇和蒙花苷在制备抗肿瘤药物中的用途。
本发明还公开4-氨基-吡咯并三嗪衍生物在抑制CDC25B蛋白酶中的用途。
优选地，4-氨基-吡咯并三嗪衍生物、香叶醇和蒙花苷在抑制CDC25B蛋白酶中的用途。
本发明还公开4-氨基-吡咯并三嗪衍生物在抑菌中的用途。
本发明还公开一种抗肿瘤药物，包括，4-氨基-吡咯并三嗪衍生物。
本发明由于采用了阿魏酸衍生物制备得到4-氨基-吡咯并三嗪衍生物，因而具有如下有益效果：抗肿瘤效果好，4-氨基-吡咯并三嗪衍生物在抗肿瘤细胞中的IC50的浓度不高于12μM，对CDC25B的抑制效果好，抑制效果至少达到了95％，同时具有抗菌效果，抑菌圈至少达到了10mm。因此，本发明是一种对CDC25B具有抑制效果的、抗肿瘤效果好的、具有抑菌效果的4-氨基-吡咯并三嗪衍生物。
附图说明
图1为4-氨基-吡咯并三嗪衍生物的抗肿瘤活性图；
图2为香叶醇、蒙花苷和4-氨基-吡咯并三嗪衍生物的协同抗肿瘤活性图；
图3为CDC25B蛋白酶抑制率图；
图4为4-氨基-吡咯并三嗪衍生物的抗菌效果图。
具体实施方式
以下结合具体实施方式和附图对本发明的技术方案作进一步详细描述：
实施例1：
一种4-氨基-吡咯并三嗪衍生物的制备方法及其抗肿瘤测试，
阿魏酸衍生物的制备：将阿魏酸加入氢氧化钠的溶液中溶解，冰浴下搅拌2h，加入对羟基苯甲酰氯，在温度为100℃下搅拌反应5h，反应完毕后调pH6.5，抽滤，水洗，烘干得到阿魏酸衍生物；阿魏酸的添加量为氢氧化钠溶液的16wt％；氢氧化钠溶液的质量分数为10wt％；对羟基苯甲酰氯的添加量为阿魏酸90wt％。
酰氯化阿魏酸衍生物的制备：将阿魏酸衍生物加入二氯甲烷中，搅拌混合，加入引发剂二甲氨基甲酰胺，回流反应1h，加入草酰氯，搅拌回流反应6h，反应完毕后，蒸干溶剂，再加入二氯甲烷蒸干草酰氯，得到酰氯化阿魏酸衍生物；阿魏酸衍生物的添加量为二氯甲烷的3wt％；引发剂二甲氨基甲酰胺的添加量为阿魏酸衍生物的0.4wt％；草酰氯的添加量为阿魏酸衍生物的70wt％。
4-氨基-吡咯并三嗪衍生物的制备：将4-氨基-吡咯并三嗪加入乙腈中，加入缚酸剂三乙胺，冰浴中搅拌0.5h，滴加含酰氯化阿魏酸衍生物的乙腈溶液，在30℃的温度下反应9h，反应后旋干溶剂得到粗产物，粗产物经硅胶柱层析纯化得到4-氨基-吡咯并三嗪衍生物；4-氨基-吡咯并三嗪的添加量为乙腈的6wt％；缚酸剂的添加量为4-氨基-吡咯并三嗪衍生物的100wt％；酰氯化阿魏酸衍生物的乙腈溶液的质量分数为50wt％，酰氯化阿魏酸衍生物的乙腈溶液的添加量为4-氨基-吡咯并三嗪的乙腈溶液的30wt％。
抗肿瘤活性实验：将结肠癌细胞(HT29)用含FBS的RPMI 1640培养基制成2.0×105个/mL细胞悬液，接种到96孔培养板中，每孔150μL，加入4-氨基-吡咯并三嗪衍生物，用FBS溶液调节每孔细胞液总体积为200μL，于37℃，5％CO2饱和湿度的无菌培养箱中培养48h。培养结束前5h，在每孔中加入20μL的MTT，培育完成后取出培养板，离心弃上清液，加入DMSO，振荡溶解，用多孔酶标测定仪测定490nm处的吸光度(OD值)；FBS溶液的质量分数为10wt％，4-氨基-吡咯并三嗪衍生物的添加量为4μM/孔；MTT的浓度为5mg/mL；DMSO的添加量为150μL/孔。
实施例2：
一种4-氨基-吡咯并三嗪衍生物的制备方法及其抗肿瘤测试，
阿魏酸衍生物的制备：将阿魏酸加入氢氧化钠的溶液中溶解，冰浴下搅拌2h，加入对羟基苯甲酰氯，在温度为100℃下搅拌反应5h，反应完毕后调pH6.5，抽滤，水洗，烘干得到阿魏酸衍生物；阿魏酸的添加量为氢氧化钠溶液的16wt％；氢氧化钠溶液的质量分数为10wt％；对羟基苯甲酰氯的添加量为阿魏酸90wt％。
酰氯化阿魏酸衍生物的制备：将阿魏酸衍生物加入二氯甲烷中，搅拌混合，加入引发剂二甲氨基甲酰胺，回流反应1h，加入草酰氯，搅拌回流反应6h，反应完毕后，蒸干溶剂，再加入二氯甲烷蒸干草酰氯，得到酰氯化阿魏酸衍生物；阿魏酸衍生物的添加量为二氯甲烷的3wt％；引发剂二甲氨基甲酰胺的添加量为阿魏酸衍生物的0.4wt％；草酰氯的添加量为阿魏酸衍生物的70wt％。
4-氨基-吡咯并三嗪衍生物的制备：将4-氨基-吡咯并三嗪加入乙腈中，加入缚酸剂三乙胺，冰浴中搅拌0.5h，滴加含酰氯化阿魏酸衍生物的乙腈溶液，在30℃的温度下反应9h，反应后旋干溶剂得到粗产物，粗产物经硅胶柱层析纯化得到4-氨基-吡咯并三嗪衍生物；4-氨基-吡咯并三嗪的添加量为乙腈的6wt％；缚酸剂的添加量为4-氨基-吡咯并三嗪衍生物的100wt％；酰氯化阿魏酸衍生物的乙腈溶液的质量分数为50wt％，酰氯化阿魏酸衍生物的乙腈溶液的添加量为4-氨基-吡咯并三嗪的乙腈溶液的42wt％。
抗肿瘤活性实验：将结肠癌细胞(HT29)用含FBS的RPMI 1640培养基制成2.0×105个/mL细胞悬液，接种到96孔培养板中，每孔150μL，加入4-氨基-吡咯并三嗪衍生物，用FBS溶液调节每孔细胞液总体积为200μL，于37℃，5％CO2饱和湿度的无菌培养箱中培养48h。培养结束前5h，在每孔中加入20μL的MTT，培育完成后取出培养板，离心弃上清液，加入DMSO，振荡溶解，用多孔酶标测定仪测定490nm处的吸光度(OD值)；FBS溶液的质量分数为10wt％，4-氨基-吡咯并三嗪衍生物的添加量为4μM/孔；MTT的浓度为5mg/mL；DMSO的添加量为150μL/孔。
实施例3：
一种4-氨基-吡咯并三嗪衍生物的制备方法及其抗肿瘤测试，
阿魏酸衍生物的制备：将阿魏酸加入氢氧化钠的溶液中溶解，冰浴下搅拌2h，加入对羟基苯甲酰氯，在温度为100℃下搅拌反应5h，反应完毕后调pH6.5，抽滤，水洗，烘干得到阿魏酸衍生物；阿魏酸的添加量为氢氧化钠溶液的16wt％；氢氧化钠溶液的质量分数为10wt％；对羟基苯甲酰氯的添加量为阿魏酸90wt％。
酰氯化阿魏酸衍生物的制备：将阿魏酸衍生物加入二氯甲烷中，搅拌混合，加入引发剂二甲氨基甲酰胺，回流反应1h，加入草酰氯，搅拌回流反应6h，反应完毕后，蒸干溶剂，再加入二氯甲烷蒸干草酰氯，得到酰氯化阿魏酸衍生物；阿魏酸衍生物的添加量为二氯甲烷的3wt％；引发剂二甲氨基甲酰胺的添加量为阿魏酸衍生物的0.4wt％；草酰氯的添加量为阿魏酸衍生物的70wt％。
4-氨基-吡咯并三嗪衍生物的制备：将4-氨基-吡咯并三嗪加入乙腈中，加入缚酸剂三乙胺，冰浴中搅拌0.5h，滴加含酰氯化阿魏酸衍生物的乙腈溶液，在30℃的温度下反应9h，反应后旋干溶剂得到粗产物，粗产物经硅胶柱层析纯化得到4-氨基-吡咯并三嗪衍生物；4-氨基-吡咯并三嗪的添加量为乙腈的6wt％；缚酸剂的添加量为4-氨基-吡咯并三嗪衍生物的100wt％；酰氯化阿魏酸衍生物的乙腈溶液的质量分数为50wt％，酰氯化阿魏酸衍生物的乙腈溶液的添加量为4-氨基-吡咯并三嗪的乙腈溶液的42wt％。
抗肿瘤活性实验：将结肠癌细胞(HT29)用含FBS的RPMI 1640培养基制成2.0×105个/mL细胞悬液，接种到96孔培养板中，每孔150μL，加入4-氨基-吡咯并三嗪衍生物并协同加入香叶醇和蒙花苷，用FBS溶液调节每孔细胞液总体积为200μL，于37℃，5％CO2饱和湿度的无菌培养箱中培养48h。培养结束前5h，在每孔中加入20μL的MTT，培育完成后取出培养板，离心弃上清液，加入DMSO，振荡溶解，用多孔酶标测定仪测定490nm处的吸光度(OD值)；FBS溶液的质量分数为10wt％，4-氨基-吡咯并三嗪衍生物的添加量为4μM/孔；香叶醇的添加量为4-氨基-吡咯并三嗪衍生物的4wt％；蒙花苷的添加量为4-氨基-吡咯并三嗪衍生物的2wt％；MTT的浓度为5mg/mL；DMSO的添加量为150μL/孔。
实施例4：
一种4-氨基-吡咯并三嗪衍生物的制备方法及其抗肿瘤测试，
阿魏酸衍生物的制备：将阿魏酸加入氢氧化钠的溶液中溶解，冰浴下搅拌2h，加入对羟基苯甲酰氯，在温度为100℃下搅拌反应5h，反应完毕后调pH6.5，抽滤，水洗，烘干得到阿魏酸衍生物；阿魏酸的添加量为氢氧化钠溶液的16wt％；氢氧化钠溶液的质量分数为10wt％；对羟基苯甲酰氯的添加量为阿魏酸90wt％。
酰氯化阿魏酸衍生物的制备：将阿魏酸衍生物加入二氯甲烷中，搅拌混合，加入引发剂二甲氨基甲酰胺，回流反应1h，加入草酰氯，搅拌回流反应6h，反应完毕后，蒸干溶剂，再加入二氯甲烷蒸干草酰氯，得到酰氯化阿魏酸衍生物；阿魏酸衍生物的添加量为二氯甲烷的3wt％；引发剂二甲氨基甲酰胺的添加量为阿魏酸衍生物的0.4wt％；草酰氯的添加量为阿魏酸衍生物的70wt％。
4-氨基-吡咯并三嗪衍生物的制备：将4-氨基-吡咯并三嗪加入乙腈中，加入缚酸剂三乙胺，冰浴中搅拌0.5h，滴加含酰氯化阿魏酸衍生物的乙腈溶液，在30℃的温度下反应9h，反应后旋干溶剂得到粗产物，粗产物经硅胶柱层析纯化得到4-氨基-吡咯并三嗪衍生物；4-氨基-吡咯并三嗪的添加量为乙腈的6wt％；缚酸剂的添加量为4-氨基-吡咯并三嗪衍生物的100wt％；酰氯化阿魏酸衍生物的乙腈溶液的质量分数为50wt％，酰氯化阿魏酸衍生物的乙腈溶液的添加量为4-氨基-吡咯并三嗪的乙腈溶液的42wt％。
抗肿瘤活性实验：将结肠癌细胞(HT29)用含FBS的RPMI 1640培养基制成2.0×105个/mL细胞悬液，接种到96孔培养板中，每孔150μL，加入4-氨基-吡咯并三嗪衍生物并协同加入香叶醇和蒙花苷，用FBS溶液调节每孔细胞液总体积为200μL，于37℃，5％CO2饱和湿度的无菌培养箱中培养48h。培养结束前5h，在每孔中加入20μL的MTT，培育完成后取出培养板，离心弃上清液，加入DMSO，振荡溶解，用多孔酶标测定仪测定490nm处的吸光度(OD值)；FBS溶液的质量分数为10wt％，4-氨基-吡咯并三嗪衍生物的添加量为4μM/孔；香叶醇的添加量为4-氨基-吡咯并三嗪衍生物的12wt％；蒙花苷的添加量为4-氨基-吡咯并三嗪衍生物的8wt％；MTT的浓度为5mg/mL；DMSO的添加量为150μL/孔。
对比例1：
本对比例与实施例2相比，不同之处仅在于，抗细胞增殖实验中，将4-氨基-吡咯并三嗪衍生物替换为4-氨基-吡咯并三嗪。
对比例2：
本对比例与实施例2相比，不同之处仅在于，4-氨基-吡咯并三嗪衍生物的制备中，将阿魏酸衍生物替换为阿魏酸。
对比例3：
本对比例与实施例4相比，不同之处仅在于，抗细胞增殖实验中未协同加入蒙花苷。
对比例4：
本对比例与实施例4相比，不同之处仅在于，抗细胞增殖实验中未协同加入香叶醇。
试验例1：
1.产物的表征
化合物结构用600MHz超导核磁共振仪进行1H NMR，TMS作为内标。
以实施例2中使用到的及得到的产物进行核磁测试。
阿魏酸的1H NMR谱中，12.05ppm处出现羧酸氢的化学位移，9.54ppm处出现酚羟基氢的化学位移，7.48-7.46ppm间出现与苯环相连的烯碳上氢的化学位移，6.69-7.23ppm间出现苯环上氢的化学位移，6.31-6.33ppm处出现与羧基相连的烯碳上氢的化学位移，3.76ppm处出现甲氧基氢的化学位移。
阿魏酸衍生物的1H NMR谱中，9.54ppm处出现酚羟基氢的化学位移消失，在9.35ppm处出现新的酚羟基氢的化学位移，在8.16ppm处出现与羰基相连的苯环上相邻碳上氢的化学位移，表明成功得到阿魏酸衍生物。
4-氨基-吡咯并三嗪衍生物的1H NMR谱中，在6.93ppm处出现氮上氢的化学位移，在9.28ppm处现三嗪中氮氮之间双键碳上氢的化学位移，表明成功得到4-氨基-吡咯并三嗪衍生物。
2.4-氨基-吡咯并三嗪衍生物的产率
计算实施例1和实施例2中4-氨基-吡咯并三嗪衍生物的实际产量与理论上完全反应完毕得到的理论产量。
产率＝实际产量/理论产量
表1 4-氨基-吡咯并三嗪衍生物的产率
实施例1 实施例2
产率/％ 42.6 49.3
本发明实施例1和实施例2中4-氨基-吡咯并三嗪衍生物的产率如表1所示，实施例2与实施例1相比，表明酰氯化阿魏酸衍生物的添加量的提高可以进一步提高4-氨基-吡咯并三嗪衍生物的产率。
试验例2：
1.抗肿瘤活性测试
测试方案如各实施例和对比例中的抗细胞增殖实验的方案为药物组，测试方案如各实施例和对比例中的抗细胞增殖实验但其中并未加入各实施例和对比例得到的4-氨基-吡咯并三嗪衍生物的方案为对照组。
抑瘤率＝(1-药物组平均吸光度/阴性对照组平均吸光度)×100％
测试中选用抗肿瘤药物顺铂(DDP)与各实施例和对比例的抗肿瘤测试结果进行检测药物的效果。
抗肿瘤测试结果如图1和图2所示，图1中，实施例2的抗肿瘤效果最优，实施例2与实施例1相比，抗肿瘤活性基本一致，表明分离得到的4-氨基-吡咯并三嗪衍生物纯度相当，效果相当；实施例2与对比例1相比，实施例2的效果显著优于对比例1，表明经阿魏酸衍生物与4-氨基-吡咯并三嗪反应后得到的4-氨基-吡咯并三嗪衍生物具有优异的抗肿瘤活性；实施例2与对比例2相比，表明经阿魏酸与4-氨基-吡咯并三嗪反应后得到的4-氨基-吡咯并三嗪-阿魏酸化合物的效果达不到4-氨基-吡咯并三嗪衍生物的抗肿瘤效果；实施例2与药物顺铂(DDP)的效果相比，表明4-氨基-吡咯并三嗪衍生物的抗肿瘤效果优于顺铂(DDP)。本发明得到的4-氨基-吡咯并三嗪衍生物的IC50的浓度不高于12μM。
图2中，实施例4的抗肿瘤效果最佳，实施例3-4与实施例2相比，表明香叶醇和蒙花苷提高了4-氨基-吡咯并三嗪衍生物的抗肿瘤效果；实施例4与实施例3相比，表明香叶醇和蒙花苷的添加量提高可以进一步提高4-氨基-吡咯并三嗪衍生物的抗肿瘤效果；实施例4与实施例2、对比例3相比，表明香叶醇的单独使用不能提高抗肿瘤效果；实施例4与实施例2、对比例4相比，表明蒙花苷的单独使用不能提高抗肿瘤效果；结合实施例4、对比例3、对比例4，表明香叶醇和蒙花苷在共同添加的情况下，可以进一步4-氨基-吡咯并三嗪衍生物的抗肿瘤效果，而香叶醇和蒙花苷在分开使用的情况下没有增益效果。本发明得到的香叶醇、蒙花苷和4-氨基-吡咯并三嗪衍生物的协同下IC50的浓度不高于10μM。
2.体外CDC25B蛋白酶抑制测试
CDC25B，应用大肠杆菌表达系统表达得到GST融合蛋白。采用荧光底物OMFP，经CDC25B去磷酸化后得到的产物OMF，使用Envision(PerkinElmer,USA)在被485nm激发光激发后可发射出波长为535nm的可检测的荧光信号，从而观察酶的活性变化以及化合物对其的抑制情况。实验中CDC25B所采用的参考药为Na3VO4。初筛选择单浓度条件(20μg/mL)，对样品的活性进行测试。一般情况下，每个样品在测试中均设置复孔(n≥3)。
实验中所用测试样品为各实施例和对比例得到的4-氨基-吡咯并三嗪衍生物。
CDC25B蛋白酶抑制测试结果如图3所示，实施例4中CDC25B蛋白酶抑制效果最好，达到了99.14％，实施例3-4与实施例2相比，表明香叶醇和蒙花苷提高了4-氨基-吡咯并三嗪衍生物的CDC25B蛋白酶抑制效果；实施例4与实施例3相比，表明香叶醇和蒙花苷的添加量提高可以进一步提高4-氨基-吡咯并三嗪衍生物的CDC25B蛋白酶抑制效果效果；实施例4与实施例2、对比例3相比，表明香叶醇的单独使用不能提高CDC25B蛋白酶抑制效果效果；实施例4与实施例2、对比例4相比，表明蒙花苷的单独使用不能提高CDC25B蛋白酶抑制效果效果；结合实施例4、对比例3、对比例4，表明香叶醇和蒙花苷在共同添加的情况下，可以进一步4-氨基-吡咯并三嗪衍生物的CDC25B蛋白酶抑制效果效果，而香叶醇和蒙花苷在分开使用的情况下不能产生增益效果。本发明得到的4-氨基-吡咯并三嗪衍生物的CDC25B蛋白酶抑制效果至少达到了95％。
3.抑菌测试
TCBS培养基：酵母膏粉0.5g，氯化钠1.0g，牛胆盐0.8g，蔗糖2.0g，柠檬酸铁0.1g，柠檬酸三钠1.0g，硫代硫酸钠1.0g，溴百里香草酚蓝0.01g，百里香酚蓝0.01g，琼脂2.0g，加入蒸馏水100mL，缓慢倾入灭菌培养皿，待凝固后接种溶藻弧菌。
样品配制：将各实施例1-2和对比例1-2合成得到的衍生物分别用二甲基亚砜溶解，浓度为0.5mM。
分别用微量移液枪移取每种待测药品溶液15μL到直径6mm灭菌过的圆形纸片上，稍干后贴于TCBS培养基平板上，同时进行溶剂(DMSO)空白对照实验和氯霉素的阳性对照实验，置于34℃恒温培养箱中倒置培养24h，每个样品做3组实验，取平均值。以上步骤均在无菌条件下操作。观察结果，测量各组实验抑菌圈直径的大小。
抑菌测试结果如图4所示，其中，氯霉素组的抑菌效果最好，抑菌圈达到了18.2mm，溶剂(DMSO)空白组的抑菌圈为6.3mm，实施例2的抑菌圈达到了13mm，对比例1的抑菌圈达到了7.1mm，对比例2的抑菌圈达到了8.2mm，实施例1或实施例2与氯霉素组相比，表明4-氨基-吡咯并三嗪衍生物的抑菌效果弱于氯霉素；实施例2与空白组相比，表明4-氨基-吡咯并三嗪衍生物具有抑菌效果；实施例2与对比例1相比，表明4-氨基-吡咯并三嗪衍生物的抑菌效果优于4-氨基-吡咯并三嗪；实施例2与对比例2相比，表明4-氨基-吡咯并三嗪衍生物的抑菌效果优于4-氨基-吡咯并三嗪-阿魏酸化合物；综上，表明4-氨基-吡咯并三嗪衍生物具有一定的抑菌效果，但同时效果弱于氯霉素。本发明得到的4-氨基-吡咯并三嗪衍生物的抑菌圈至少达到了10mm。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。

Claims (7)

1.一种4-氨基-吡咯并三嗪衍生物，
Figure 935833DEST_PATH_IMAGE001
，其中，R基团为
Figure 56236DEST_PATH_IMAGE002
。
2.权利要求1所述的4-氨基-吡咯并三嗪衍生物在制备抗肿瘤药物中的用途。
3.一种权利要求1所述4-氨基-吡咯并三嗪衍生物的制备方法，包括，
将阿魏酸与对羟基苯甲酰氯在氢氧化钠溶液中制备得到阿魏酸衍生物；
将所述阿魏酸衍生物与草酰氯在引发剂作用下反应得到酰氯化阿魏酸衍生物；以及，
将所述酰氯化阿魏酸衍生物与4-氨基-吡咯并三嗪在缚酸剂的作用下得到4-氨基-吡咯并三嗪衍生物。
4.根据权利要求3所述的4-氨基-吡咯并三嗪衍生物的制备方法，其特征在于：酰氯化阿魏酸衍生物的制备：将阿魏酸衍生物加入二氯甲烷中，搅拌混合，加入引发剂二甲氨基甲酰胺，回流反应0.5-3h，加入草酰氯，搅拌回流反应3-12h，反应完毕后，蒸干溶剂，再加入二氯甲烷蒸干草酰氯，得到酰氯化阿魏酸衍生物。
5.根据权利要求4所述的4-氨基-吡咯并三嗪衍生物的制备方法，其特征在于：所述阿魏酸衍生物的添加量为二氯甲烷的1-8wt%。
6.根据权利要求4所述的4-氨基-吡咯并三嗪衍生物的制备方法，其特征在于：所述引发剂二甲氨基甲酰胺的添加量为阿魏酸衍生物的0.1-1wt%。
7.根据权利要求3所述的4-氨基-吡咯并三嗪衍生物的制备方法，其特征在于：所述4-氨基-吡咯并三嗪衍生物制备中缚酸剂为三乙胺。
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Denomination of invention: 4-Amino pyrrolotriazine derivatives and their preparation methods and applications

Effective date of registration: 20230712

Granted publication date: 20221216

Pledgee: Tianjin Binhai rural commercial bank Limited by Share Ltd.

Pledgor: TIANJIN QUANHECHENG TECHNOLOGY Co.,Ltd.

Registration number: Y2023120000061