CN111955344B - 一种土人参多倍体高效诱导的方法 - Google Patents

一种土人参多倍体高效诱导的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种土人参多倍体高效诱导的方法,包括如下步骤:(1)取土人参组培苗带芽点茎段切短,灭菌；(2)采用1～3mg/ml的秋水仙素培养液浸泡,诱导处理24～72h,采用60Coγ射线辐照；(3)快速转至含5～10mg/L秋水仙素培养液的1/2MS培养基黑暗共培养；转至含秋水仙素培养液、NAA和6‑BA的1/2MS培养基光照培养；转至含NAA、6‑BA和色氨酸的MS培养基光照培养,获得土人参组培幼苗,倍性鉴定；本发明有效实现了土人参多倍体诱导的高变异率和高出苗率,形成稳定高效的土人参多倍体诱导技术,降低土人参多倍体诱导的死亡率和提高出苗质量。

Description

一种土人参多倍体高效诱导的方法
技术领域
本发明涉及土人参多倍体育种技术领域，特别涉及一种土人参多倍体高效诱导的方法。
背景技术
土人参，别名玉参、飞来参、绿兰菜等，为马齿苋科土人参属一年生或多年生草本植物。原产于热带美洲，分布于西非，南美热带和东南亚等地，在中国中部，南部至中国台湾均有栽培。土人参的利用价值非常广泛，主要有以下几个方面：(1)土人参是餐桌上一道美味佳肴，它不仅营养丰富，风味独特，且含有丰富的氨基酸，矿物质和维生素；(2)土人参也是一种有医疗价值的中草药，其根叶均可入药性平味甘，补中益气润肺生精，具有清热解毒，滋补强身之功效。土人参适应性抗逆性很强，且病虫害少。
一般而言，多倍体具有植株长势旺盛，株体、果实增大的特性，但根据诱导植株的不同，在现有的离体多倍体诱导的育种技术中，常常存在诱导时间周期长，药品耗量大，变异率低、易出现嵌合体、出苗率低等问题。目前尚未有土人参加倍技术的研究，仅有土人参原生质体培养再生植株，土人参愈伤组织诱导及植株再生技术。
因此，研究土人参多倍体诱导技术，提出一种土人参多倍体高效诱导的方法，获得多倍体土人参对于其在蔬菜生产，医疗应用及土壤固化等方面具有重要意义，改变现有土人参的品种单一，遗传相对狭窄的现状。
发明内容
鉴以此，本发明提出一种高诱导率、出苗率的土人参多倍体高效诱导的方法。
本发明的技术方案是这样实现的：
本发明提供一种土人参多倍体高效诱导的方法，包括如下步骤：
(1)灭菌处理：取土人参组培苗带芽点茎段切成0.8～1.2cm长，经 0.1～0.3％HgCl2灭菌10～12min，无菌水冲洗5-6次；
(2)多倍体诱导：将经过灭菌处理后的带芽点茎段，采用质量浓度为 1～3mg/ml的秋水仙素培养液浸泡，进行诱导处理24～72h后，采用60Coγ射线辐照，辐照剂量为10～15Gy，辐射剂量率为2～3Gy/min；
(3)组培幼苗：
第一阶段：将辐照后的带芽点茎段快速转至加入质量浓度为5～10mg/L秋水仙素培养液的1/2MS培养基中黑暗共培养3～5d，pH5.6～6.0；
第二阶段：转移至加入质量浓度为1.0～1.5mg/L秋水仙素培养液、0.2～0.5mg /LNAA和0.5～1.0mg/L 6-BA的1/2MS培养基中光照培养5～7d，pH5.6～6.0；
第三阶段：转移至加入质量浓度为1.5～2.5mg/L NAA、1.5～2.0mg/L 6-BA、 3.0～6.5mg/L色氨酸的MS培养基中光照培养30～40d，pH5.2～5.8，获得土人参组培幼苗；
(4)倍性鉴定：将步骤(3)获得的土人参组培幼苗，通过流式细胞仪测苗体倍性，即得到多倍体土人参。本发明通过采用了0.5～3mg/ml的秋水仙素培养液浸泡联合60Coγ射线低剂量辐照进行多倍体诱导处理，同时，结合利用含有微剂量的秋水仙素诱导培养液的1/2MS培养基与含有色氨酸的MS培养基进行分段组合诱导培养的方式，有效实现了土人参多倍体诱导的高变异率和高出苗率，其变异率可达到60.5％以上，并且四倍体得率可达48.5％以上；出苗率均可在52.0％以上，最高可达58.61％，形成稳定高效的土人参多倍体诱导技术，从而实现了土人参变异率和出苗率的同步提高，降低土人参多倍体诱导的死亡率和提高出苗质量。
进一步说明，步骤(2)中，所述秋水仙素培养液的质量浓度为1.0mg/ml，诱导处理72h。
进一步说明，步骤(2)中，所述60Coγ射线辐照剂量为12Gy，辐射剂量率为3Gy/min。
进一步说明，步骤(3)中，第一阶段的1/2MS培养基中的秋水仙素培养液的质量浓度为7.5mg/L。
进一步说明，步骤(3)中，第二阶段的光照培养为光照6h/d和暗培养18h/d 交替进行，光照强度为1200lx～1300lx，培养温度为23～25℃。
进一步说明，步骤(3)中，第二阶段的1/2MS培养基中秋水仙素培养液、 NAA与6-BA的质量浓度比为：1.2：0.3：0.8。
进一步说明，步骤(3)中，第三阶段的光照培养为光照12h/d和暗培养12h/d 交替进行，光照强度为1500lx～2000lx，培养温度为26～28℃。
进一步说明，步骤(3)中，第三阶段的MS培养基中NAA、6-BA和色氨酸的质量浓度比为：2.0：1.7：4.8。
进一步说明，步骤(1)中，所述带芽点茎段的长度为1.0cm，带芽点茎段的芽点数量为31～33个。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明通过以土人参的组培苗带芽点的茎段作为外植体，经过灭菌处理后，采用了0.5～3mg/ml的秋水仙素培养液浸泡联合60Coγ射线低剂量辐照进行多倍体诱导处理，不仅有效提高组培苗的变异率，变异率可达到60.5％以上，四倍体得率可达48.5％以上；在此基础上，进一步通过利用含有微剂量的秋水仙素诱导培养液的1/2MS培养基与含有色氨酸的MS培养基进行分段组合诱导培养的方式，有效降低了出现嵌合体概率，提高四倍体得率的同时，显著增加了土人参出苗率，出苗率均可在52.0％以上，最高可达58.61％，从而实现了土人参变异率和出苗率的同步提高，降低土人参多倍体诱导的死亡率和提高出苗质量。
附图说明
图1为本发明实施例的土人参组培幼苗生长情况图；
图2～5为本发明实施例的土人参组培幼苗移栽生长情况图；
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1-一种土人参多倍体高效诱导的方法，包括如下步骤：
(1)灭菌处理：取土人参组培苗带芽点茎段切成0.8cm长，带芽点茎段的芽点数量为31；经0.1％HgCl2灭菌10min，无菌水冲洗5次；
(2)多倍体诱导：将经过灭菌处理后的带芽点茎段，采用质量浓度为1mg/ml 的秋水仙素培养液浸泡，进行诱导处理24h后，采用60Coγ射线辐照，辐照剂量为10Gy，辐射剂量率为2Gy/min；
(3)组培幼苗：
第一阶段：将辐照后的带芽点茎段快速转至加入质量浓度为5mg/L秋水仙素培养液的1/2MS培养基中黑暗共培养3d，pH5.6～6.0；
第二阶段：转移至加入质量浓度为1.0mg/L秋水仙素培养液、0.2mg/L NAA 和0.5mg/L 6-BA的1/2MS培养基中光照培养5d，pH5.6～6.0；光照培养条件为光照6h/d和暗培养18h/d交替进行，光照强度为1200lx，培养温度为23℃；
第三阶段：转移至加入质量浓度为1.5mg/L NAA、1.5mg/L 6-BA、3.0mg/L 色氨酸的MS培养基中光照培养30d，pH5.2～5.8，光照培养条件为光照12h/d和暗培养12h/d交替进行，光照强度为1500lx，培养温度为26℃；获得土人参组培幼苗；
(4)倍性鉴定：将步骤(3)获得的土人参组培幼苗，通过流式细胞仪测苗体倍性，即得到多倍体土人参。
实施例2-一种土人参多倍体高效诱导的方法，包括如下步骤：
(1)灭菌处理：取土人参组培苗带芽点茎段切成1.2cm长，带芽点茎段的芽点数量为33；经0.3％HgCl2灭菌12min，无菌水冲洗6次；
(2)多倍体诱导：将经过灭菌处理后的带芽点茎段，采用质量浓度为3mg/ml 的秋水仙素培养液浸泡，进行诱导处理48h后，采用60Coγ射线辐照，辐照剂量为15Gy，辐射剂量率为3Gy/min；
(3)组培幼苗：
第一阶段：将辐照后的带芽点茎段快速转至加入质量浓度为10mg/L秋水仙素培养液的1/2MS培养基中黑暗共培养5d，pH5.6～6.0；
第二阶段：转移至加入质量浓度为1.5mg/L秋水仙素培养液、0.5mg/L NAA 和1.0mg/L 6-BA的1/2MS培养基中光照培养7d，pH5.6～6.0；光照培养条件为光照6h/d和暗培养18h/d交替进行，光照强度为1300lx，培养温度为25℃；
第三阶段：转移至加入质量浓度为2.5mg/L NAA、2.0mg/L 6-BA、6.5mg/L 色氨酸的MS培养基中光照培养40d，pH5.2～5.8，光照培养条件为光照12h/d和暗培养12h/d交替进行，光照强度为2000lx，培养温度为28℃，获得土人参组培幼苗；
(4)倍性鉴定：将步骤(3)获得的土人参组培幼苗，通过流式细胞仪测苗体倍性，即得到多倍体土人参。
实施例3-一种土人参多倍体高效诱导的方法，包括如下步骤：
(1)灭菌处理：取土人参组培苗带芽点茎段切成1.0cm长，带芽点茎段的芽点数量为32，经0.2％HgCl2灭菌11min，无菌水冲洗6次；
(2)多倍体诱导：将经过灭菌处理后的带芽点茎段，采用质量浓度为1mg/ml 的秋水仙素培养液浸泡，进行诱导处理72h后，采用60Coγ射线辐照，辐照剂量为12Gy，辐射剂量率为3Gy/min；
(3)组培幼苗：
第一阶段：将辐照后的带芽点茎段快速转至加入质量浓度为7.5mg/L秋水仙素培养液的1/2MS培养基中黑暗共培养4d，pH5.6～6.0；
第二阶段：转移至加入质量浓度为1.2mg/L秋水仙素培养液、0.3mg/L NAA 和0.8mg/L 6-BA的1/2MS培养基中光照培养6d，pH5.6～6.0；光照培养条件为光照6h/d和暗培养18h/d交替进行，光照强度为1300lx，培养温度为24℃；
第三阶段：转移至加入质量浓度为2.0mg/L NAA、1.7mg/L 6-BA、4.8mg/L 色氨酸的MS培养基中光照培养30～40d，pH5.2～5.8，光照培养条件为光照12h/d 和暗培养12h/d交替进行，光照强度为1800lx，培养温度为27℃；获得土人参组培幼苗；
(4)倍性鉴定：将步骤(3)获得的土人参组培幼苗，通过流式细胞仪测苗体倍性，即得到多倍体土人参。
对比例组1-根据实施例3的土人参多倍体高效诱导的方法，分别调整步骤 (2)中，所述秋水仙素培养液的质量浓度及处理时间如下表，其余均与实施例 3相同。
组号 处理浓度 处理时间
A1-1 4mg/ml 72h
A1-2 0.5mg/ml 72h
A1-3 1mg/ml 18h
A1-4 1mg/ml 78h
对比例组2-根据实施例3的土人参多倍体高效诱导的方法，分别调整步骤 (2)中，所述60Coγ射线辐照剂量和辐射剂量率如下表，其余均与实施例3相同。
组号 辐照剂量 辐射剂量率
A2-1 18Gy 3Gy/min
A2-2 12Gy 6Gy/min
A2-3 0 0
对比例3-根据实施例3的土人参多倍体高效诱导的方法，在步骤(3)中，将采用含有0.3mg/L NAA和0.8mg/L 6-BA的1/2MS培养基对辐照后的带芽点茎分别进行4d暗培养和6d光照培养，pH5.6～6.0；光照培养条件为光照6h/d和暗培养18h/d交替进行，光照强度为1300lx，培养温度为24℃；再采用含有2.0mg /L NAA、1.7mg/L 6-BA的MS培养基，pH5.2～5.8，培养条件为光照12h/d和暗培养12h/d交替进行，光照强度为1800lx，培养温度为27℃，其余均与实施例3 相同。
根据上述实施例和对比例的土人参多倍体高效诱导的方法进行土人参多倍体诱导培养实验，诱导处理时间为2020年3月10，并在4月23日后，分别统计死亡率和变异率，其结果如下表：
通过流式细胞仪测苗体倍性：取土人参幼苗肉质茎放入塑料培养皿中；添加400μL提取缓冲液浸泡60s，切碎，静置3min；进行过滤，加入1.6mL染色缓冲液染色90s；最后采用流式细胞仪进行分析，数据采用SPSS 16进行统计和分析，结果如下：
Figure BDA0002657471540000061
Figure BDA0002657471540000071
由上表结果可知，根据本发明的土人参多倍体高效诱导的方法，通过采用一定浓度秋水仙素培养液浸泡联合60Coγ射线低剂量辐照进行多倍体诱导处理，以及利用含有微剂量的秋水仙素诱导培养液的1/2MS培养基与含有色氨酸的 MS培养基进行分段组合诱导培养的方式，能够实现稳定获得多倍体土人参，且变异率可达到60.5％以上，同时有效降低了出现嵌合体概率，四倍体得率可达 48.5％以上，并显著增加了土人参出苗率，出苗率均可在52.0％以上，最高可达 58.61％，从而实现了土人参变异率和出苗率的同步提高，降低土人参多倍体诱导的死亡率和提高出苗质量。
由实施例3与对比例组1对比可知，在采用一定浓度秋水仙素浸泡诱导处理的过程中，在等量处理时间下，当秋水仙素处理浓度高于3mg/ml时，变异率和出苗率显著减少；在较低浓度下，随着处理时间的增加，变异率逐渐增加，但当超过72h时，出苗率显著下降。由实施例3与对比例组2对比可知，当60Coγ射线的辐射剂量大于15Gy时，其变异率和出苗率显著降低，在辐射剂量率过高时，容易导致出苗率降低；由实施例3与对比例3对比可知，通过采用利用含有微剂量的秋水仙素诱导培养液的1/2MS培养基与含有色氨酸的MS培养基进行分段组合诱导培养的方式，可进一步降低了出现嵌合体概率，从而有效提高高四倍体得率，并有效保证了土人参幼苗的出苗率。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种土人参多倍体高效诱导的方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)灭菌处理：取土人参组培苗带芽点茎段切成0.8～1.2cm长，经0.1～0.3％HgCl2灭菌10～12min，无菌水冲洗5-6次；
(2)多倍体诱导：将经过灭菌处理后的带芽点茎段，采用质量浓度为1～3mg/ml的秋水仙素培养液浸泡，进行诱导处理24～72h后，采用60Coγ射线辐照，辐照剂量为10～15Gy，辐射剂量率为2～3Gy/min；
(3)组培幼苗：
第一阶段：将辐照后的带芽点茎段快速转至加入含质量浓度为5～10mg/L秋水仙素的1/2MS培养基中黑暗共培养3～5d，pH5.6～6.0；
第二阶段：转移至加入含质量浓度为1.0～1.5mg/L秋水仙素、0.2～0.5mg/L NAA和0.5～1.0mg/L 6-BA的1/2MS培养基中光照培养5～7d，pH5.6～6.0；
第三阶段：转移至加入含质量浓度为1.5～2.5mg/L NAA、1.5～2.0mg/L 6-BA、3.0～6.5mg/L色氨酸的MS培养基中光照培养30～40d，pH5.2～5.8，获得土人参组培幼苗；
(4)倍性鉴定：将步骤(3)获得的土人参组培幼苗，通过流式细胞仪测苗体倍性，即得到多倍体土人参。
2.如权利要求1所述的一种土人参多倍体高效诱导的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述秋水仙素的质量浓度为1.0mg/ml，诱导处理72h。
3.如权利要求1所述的一种土人参多倍体高效诱导的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述60Coγ射线辐照剂量为12Gy，辐射剂量率为3Gy/min。
4.如权利要求1所述的一种土人参多倍体高效诱导的方法，其特征在于：步骤(3)中，第一阶段的1/2MS培养基中的秋水仙素的质量浓度为7.5mg/L。
5.如权利要求1所述的一种土人参多倍体高效诱导的方法，其特征在于：步骤(3)中，第二阶段的光照培养为光照6h/d和暗培养18h/d交替进行，光照强度为1200lx～1300lx，培养温度为23～25℃。
6.如权利要求1所述的一种土人参多倍体高效诱导的方法，其特征在于：步骤(3)中，第二阶段的1/2MS培养基中秋水仙素、NAA与6-BA的质量浓度比为：1.2：0.3：0.8。
7.如权利要求1所述的一种土人参多倍体高效诱导的方法，其特征在于：步骤(3)中，第三阶段的光照培养为光照12h/d和暗培养12h/d交替进行，光照强度为1500lx～2000lx，培养温度为26～28℃。
8.如权利要求1所述的一种土人参多倍体高效诱导的方法，其特征在于：步骤(3)中，第三阶段的MS培养基中NAA、6-BA和色氨酸的质量浓度比为：2.0：1.7：4.8。
9.如权利要求1所述的一种土人参多倍体高效诱导的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述带芽点茎段的长度为1.0cm，带芽点茎段的芽点数量为31～33个。
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