CN111944886B - 一种合成寡聚脱氧核糖核苷酸的方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种合成寡聚脱氧核糖核苷酸的方法和试剂盒。本发明的合成寡聚脱氧核糖核苷酸的方法，包括如下步骤：A)制备模板引物库，所述模板引物库为随机模板引物的集合，每一模板引物的3’端被磷酸化修饰；B)制备起始引物库，所述起始引物库为随机起始引物的集合，每一起始引物固定在固相载体上；C)根据待合成寡聚脱氧核糖核苷酸的序列在起始引物库中选择对应的起始引物，随后依次在模板引物库中选择对应的模板引物并进行单个碱基的延伸反应，以在起始引物的3’端合成下个碱基，直至合成完整的寡聚脱氧核糖核苷酸。本发明的方法和试剂盒能够高通量、低成本、快速地合成超长寡聚脱氧核糖核苷酸。
Description
技术领域
本发明涉及DNA合成技术领域，尤其是涉及一种合成寡聚脱氧核糖核苷酸的方法和试剂盒。
背景技术
传统的化学法合成寡聚脱氧核糖核苷酸(即Oligo DNA)起源于20世纪四十年代末，于六十至七十年代逐渐完善，形成了今天广泛应用的固相亚磷酰胺三酯法。该方法虽经历了数十年的发展和完善，但仍然存在诸多缺点，其中包括：①一般情况下最多只能合成120bp-175bp的Oligo DNA，且随着Oligo DNA长度的增加，成本、错误率都显著增加，一般合成长度为90-120bp；②合成工序复杂，每延伸一个碱基都需要经过去封闭、活化、偶联、盖帽、氧化；③复杂的工序导致耗时长；④化学合成中需要使用多种易导致污染的化学试剂，如二甲氧基三苯甲基(DMT)等。
近几年，合成生物学的发展取得了巨大进步，合成生物学的基础是人工合成长达50000bp-16000000bp的基因组，基于传统的合成Oligo DNA方法显然需要花费巨大的时间成本、人工成本、试剂成本，这将不利于合成生物学的快速发展。因此，一种高通量、低成本、快速合成超长Oligo DNA的方法亟待发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种合成寡聚脱氧核糖核苷酸的方法和试剂盒，该方法和试剂盒能够高通量、低成本、快速地合成超长寡聚脱氧核糖核苷酸。
本发明提供一种合成寡聚脱氧核糖核苷酸的方法，包括如下步骤：
A)制备模板引物库，所述模板引物库为随机模板引物的集合，每一模板引物的3’端被磷酸化修饰；
B)制备起始引物库，所述起始引物库为随机起始引物的集合，每一起始引物固定在固相载体上；
C)根据待合成寡聚脱氧核糖核苷酸的序列在起始引物库中选择对应的起始引物，随后依次在模板引物库中选择对应的模板引物并进行单个碱基的延伸反应，以在起始引物的3’端合成下个碱基，直至合成完整的寡聚脱氧核糖核苷酸。
本发明基于二代测序中焦磷酸测序的原理以及可逆终止荧光dNTP技术，通过设计两种特殊的引物库(即上述模板引物库和起始引物库)，利用DNA聚合酶的聚合特性以及不带荧光基团的可逆终止dNTP的终止特性，开发了一种高通量、低成本、快速、低污染的合成超长Oligo DNA的方法，所述合成的超长Oligo DNA最高可达500bp，平均可达400bp。
本发明对待合成寡聚脱氧核糖核苷酸的长度不作严格限制，长度可以≤500bp，优选为200-500bp。
本发明合成方法的具体原理如下：
设计模板引物库和起始引物库，模板引物库中的引物3’端为磷酸化，不能被聚合酶延伸；起始引物库中的引物为正常引物，引物5’端偶联到固相载体(例如磁珠)上。开始合成时，从起始引物库中按照目标合成序列选择一条起始引物，再按照规律在模板引物库中选择磷酸化的模板引物，这些磷酸化的模板引物能够按照规律与磁珠固定的起始引物(或其延伸物)配对，并导致起始引物(或其延伸物)的3’端形成单个碱基的粘性末端，利用DNA聚合酶的聚合能力，补齐该单个碱基的黏性末端，该延伸反应使用的是可逆终止dNTP，使得起始引物(或其延伸物)在单个延伸反应中只能延伸一个碱基。再洗去未反应可逆终止dNTP等杂质，再去掉修饰基团，使得起始引物的延伸DNA可以进入下一个反应。循环往复即实现起始引物的不断延伸，直至合成完整的寡聚脱氧核糖核苷酸。
本发明对随机模板引物和随机起始引物的长度不作严格限制；具体地，所述随机模板引物的长度可以为6bp-9bp，所述随机起始引物的长度可以为6bp-9bp。
此外，对随机模板引物和随机起始引物的装载方式不作严格限制，可根据实际需求合理设置。具体地，所述模板引物库中的随机模板引物可以预设规则置于模板引物孔板的矩阵小孔中；同样地，所述起始引物库中的随机起始引物可以预设规则置于起始引物孔板的矩阵小孔中。
进一步地，可以理解，所述模板引物库中的随机模板引物的数量为4m，m为随机模板引物的长度；所述起始引物库中的随机起始引物的数量为4n，n为随机起始引物的长度。
在本发明中，DNA聚合酶可以是经过基因工程改造的不具有外切酶活性的Taq DNA聚合酶、Pfu聚合酶等。
在本发明的步骤A)制备模板引物库中，模板引物库可以为长度6bp-9bp随机引物的所有集合，每一引物的3’端磷酸化修饰，用于阻断DNA聚合酶延伸。
具体地，以随机引物长度8bp为例(即：5’-NNNNNNNN-P-3’)，此时包含所有可能的Oligo DNA组成的集合，设计如下：
首先使用传统的化学合成方法合成4×4×4×4×4×4×4×4＝65536条引物，每一引物的3’端磷酸化修饰，该65536条引物即构成模板引物库；随后，将每一条具体的8bp引物按照一定的规律放置在1×1mm矩阵小孔中，这些小孔集合在300mm×300mm板上(即模板引物孔板)，每行256个孔，每列同样也是256孔(如图1所示)。引物的放置规律如下：
在孔1中放置引物：3’-P-AAAAAAAA-5’
在孔2中放置引物：3’-P-AAAAAAAT-5’
在孔3中放置引物：3’-P-AAAAAAAG-5’
在孔4中放置引物：3’-P-AAAAAAAC-5’
在孔5中放置引物：3’-P-AAAAAATA-5’
在孔6中放置引物：3’-P-AAAAAATT-5’
……
在孔65533中放置引物：3’-P-CCCCCCCA-5’
在孔65534中放置引物：3’-P-CCCCCCCT-5’
在孔65535中放置引物：3’-P-CCCCCCCG-5’
在孔65536中放置引物：3’-P-CCCCCCCC-5’。
上述步骤A)中，可以采用本技术领域的常规方法对每一引物的3端’进行磷酸化修饰的，在此不再赘述。
在本发明的步骤B)制备起始引物库中，起始引物库与模板引物库的不同之处在于：模板引物库的3’端是磷酸化修饰的，不能被延伸；而起始引物库是普通的引物，并固定在磁珠等固相载体上，后续反应中其3’端将被Taq DNA聚合酶延伸；由于其固定在磁珠等固相载体上，因此很容易自动化纯化。
具体地，起始引物库可以为长度7bp-9bp随机引物的所有集合。以8bp引物库为例(即5’-NNNNNNNN-3’)，此时起始引物库包含所有可能的Oligo DNA组成的集合，设计如下：
首先，使用传统的化学合成方法合成4×4×4×4×4×4×4×4(即48)＝65536条引物，每条引物固定在磁珠上；随后，将每一条具体的8bp引物按照一定的规律放置在1×1mm矩阵小孔中，这些小孔集合到256mm×256mm板上(即起始引物孔板)，用于下一步自动化操作。
上述步骤B)中，将单链DNA固定到固相载体表面的技术很成熟，本领域具有多种实现方法，在此不再赘述。
在上述模板引物库和起始引物库制备完成后，可以根据需求开始自动化合成。本发明对合成各碱基的延伸反应体系及条件不作严格限制，可以根据实际情况合理设置。
具体地，合成第一个碱基的延伸反应体系可以为：10×DNA聚合酶Buffer 1μL，起始引物1μL，模板引物1μL，可逆终止dNTP 1μL，DNA聚合酶1μL，加ddH2O至总体积为10μL；合成第二个碱基及其后续单个碱基的延伸反应体系可以为：10×DNA聚合酶Buffer 1μL，上一延伸反应产物1μL，模板引物1μL，可逆终止dNTP 1μL，DNA聚合酶0.5μL，加ddH2O至总体积为10μL。
进一步地，10×DNA聚合酶Buffer的配方可以为：100mM Tris-Cl pH8.4，500mMKCl，15mM MgCl2，1％Triton-100；不同的DNA聚合酶应使用不同的缓冲液，可根据具体情况进行配制。
进一步地，所述起始引物的母液浓度可以为0.05-0.15μM，优选为0.1μM；所述模板引物的母液浓度可以为8-12μM，优选为10μM；所述可逆终止dNTP的母液浓度可以为20-30mM，优选为25mM；所述DNA聚合酶的浓度可以为1-5U/μL，优选为2U/μL。
上述延伸反应体系采用的可逆终止dNTP，其3’端-OH末端带有可化学切割的部分，只容许每一轮反应掺入单个碱基；例如，dGTP只容许每一轮反应掺入单个碱基G，dATP只容许每一轮反应掺入单个碱基A等；可根据实际需求选择适宜的可逆终止dNTP。
此外，所述延伸反应的条件为：94℃变性30s，20-40℃退火30s，72℃延伸30s。特别是，在每一碱基的延伸反应中，延伸反应可以重复进行3-5次，以使得起始引物(或其延伸物)的反应更加充分。
可以理解，在每个碱基的延伸反应之后还包括：洗去除起始引物外的所有杂质，并将延伸的可逆dNTP修饰基团去掉，使之可以参与下一轮延伸反应。
本发明还提供一种合成寡聚脱氧核糖核苷酸的试剂盒，包括：
模板引物孔板，其装载有模板引物库，所述模板引物库为随机模板引物的集合，每一模板引物的3’端被磷酸化修饰；
起始引物孔板，其装载有起始引物库，所述起始引物库为随机起始引物的集合，每一起始引物固定在固相载体上。
具体地，所述寡聚脱氧核糖核苷酸的长度可以≤500bp，优选为200-500bp；所述固相载体可以为磁珠；所述随机模板引物的长度可以为6bp-9bp；所述随机起始引物的长度可以为6bp-9bp。
此外，本发明的试剂盒还可以包括10×DNA聚合酶Buffer、可逆终止dNTP、DNA聚合酶和ddH2O中的至少一种；其中，起始引物的母液浓度可以为0.05-0.15μM，优选为0.1μM；模板引物的母液浓度可以为8-12μM，优选为10μM；可逆终止dNTP的母液浓度可以为20-30mM，优选为25mM；DNA聚合酶的浓度可以为1-5U/μL，优选为2U/μL。
本发明的实施，至少具有以下优势：
1、本发明的方法和试剂盒基于二代测序中焦磷酸测序的原理以及可逆终止荧光dNTP技术，通过设计两种特殊的引物库，利用DNA聚合酶的聚合特性以及不带荧光基团的可逆终止dNTP的终止特性，从而能够合成超长Oligo DNA；
2、本发明的方法和试剂盒能够高通量、低成本、快速、低污染地合成超长OligoDNA，所合成的超长Oligo DNA的长度最高可达500bp，平均可达400bp，有利于适应合成生物学的快速发展。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1的模板引物库的设置示意图；
图2为本发明实施例2的Oligo DNA合成流程图；
图3为本发明实施例2的测序结果；
图4为本发明对照例1的Oligo DNA合成流程图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1制备模板引物库和起始引物库
一、制备模板引物库
本实施例的模板引物库为长度8bp随机模板引物的所有集合，模板引物的3’端磷酸化修饰，以阻断DNA聚合酶延伸。模板引物表示为：5’-NNNNNNNN-P-3’，模板引物库包含所有可能的Oligo DNA组成的集合，设计如下：
首先，使用传统的化学合成方法合成4×4×4×4×4×4×4×4＝65536条引物，并采用常规方法对每一条引物的3’端磷酸化修饰。
随后，将每一条8bp引物按照一定的规律放置在1×1mm矩阵小孔中，这些小孔集合到300mm×300mm板上，每行256个孔，每列同样也是256孔(参见图1)；模板引物库中的模板引物将用于下一步自动化合成操作。
模板引物库中的模板引物在各孔中的特定设置方式如下(为了方便描述，引物方向为3’-5’)：
在孔1中放置引物：3’-P-AAAAAAAA-5’
在孔2中放置引物：3’-P-AAAAAAAT-5’
在孔3中放置引物：3’-P-AAAAAAAG-5’
在孔4中放置引物：3’-P-AAAAAAAC-5’
在孔5中放置引物：3’-P-AAAAAATA-5’
在孔6中放置引物：3’-P-AAAAAATT-5’
……
在孔65533中放置引物：3’-P-CCCCCCCA-5’
在孔65534中放置引物：3’-P-CCCCCCCT-5’
在孔65535中放置引物：3’-P-CCCCCCCG-5’
在孔65536中放置引物：3’-P-CCCCCCCC-5’。
二、制备起始引物库
本实施例的起始引物库为长度8bp随机起始引物的所有集合，起始引物库与模板引物库不同之处在于：模板引物库的3’端是磷酸化修饰的，不能被延伸；而起始引物库是普通的引物，并固定在磁珠上，后续反应中其3’端将被Taq DNA聚合酶延伸；由于其固定在磁珠上，因此很容易自动化纯化。
起始引物表示为：5’-NNNNNNNN-3’；此时，起始引物库包含所有可能的Oligo DNA组成的集合，设计如下：
首先，使用传统的化学合成方法合成4×4×4×4×4×4×4×4＝65536条引物，并采用常规方法将其固定在磁珠上。
随后，将每一条具体的8bp引物按照一定的规律放置在1×1mm矩阵小孔中，这些小孔集合到256mm×256mm板上；起始引物库中的起始引物在各孔中的特定设置方式可参照模板引物的设置方式。起始引物库中的起始引物将用于下一步自动化合成操作。
实施例2合成大肠杆菌LacZα基因
本实施例采用实施例1制备的模板引物库和起始引物库来合成大肠杆菌LacZα基因，其基因序列如下(全长324bp)：atgaccatgattacgccaagcttgcatgcctgcaggtcgactctagaggatccccgggtaccgagctcgaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatggcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatag。
一、配制溶液
10×Taq Buffer配方为：100mM Tris-Cl pH8.4，500mM KCl，15mM MgCl2，1％Triton-100；
起始引物(磁珠)的母液浓度为0.1μM；
模板引物的母液浓度为10μM；
可逆终止dNTP的母液浓度为25mM；
DNA聚合酶(无外切酶活性)的浓度为2U/μL。
二、合成反应
采用自动化程序进行合成操作；参见图2，具体的合成步骤如下：
1、延伸第一个碱基g：
第一步：在起始引物库中寻找已固定在磁珠上的引物5’-atgaccat-3’；
第二步：在模板引物库中寻找引物3’-P-ACTGGTAC-5’；
第三步：配制反应体系，在小管内加入如下反应体系：
上述可逆终止dGTP，其3’端-OH末端带有可化学切割的部分，只容许每一轮反应掺入单个碱基G。
第四步：延伸反应
94℃变性 30s
30℃退火 30s
72℃延伸 30s。
在单次反应中，重复第四步3次以使得起始引物充分反应。
第五步：洗涤
洗去除起始引物外的所有杂质，并将延伸的可逆dGTP上的修饰基团去掉，使之可以参与下一轮延伸反应。
至此，第一个碱基g合成完毕，获得第一轮延伸产物。
2、延伸第二个碱基a：
第一步：在模板引物库中寻找引物3’-P-CTGGTACT-5’；
第二步：配制反应体系，在小管内加入如下反应体系：
上述可逆终止dATP，其3’端-OH末端带有可化学切割的部分，只容许每一轮反应掺入单个碱基A。
第三步：延伸反应
94℃变性 30s
30℃退火 30s
72℃延伸 30s。
第四步：洗涤
洗去除起始引物外的所有杂质，并将延伸的可逆dATP上的修饰基团去掉，使之可以参与下一轮延伸反应。
至此，第二个碱基a合成完毕。
以此类推，直到合成全长的单链LacZα基因；实际耗费时间约5h。
三、测序
对合成的全长单链LacZα基因进行PCR扩增(合成的全长单链DNA量很少，不能直接用于测序；扩增引物添加了测序接头，以便完整测序)、测序后使用软件CodonCode进行比对；结果见图3，结果表明：上述合成的全长的单链LacZα包含目标基因序列全长，且无突变。
对照例1
采用常规方法合成实施例2的大肠杆菌LacZα基因；步骤如下：
①首先将基因分成4段，每段之间包含20bp同源臂，设计如下4条引物：
引物1，5’-3’：
atgaccatgattacgccaagcttgcatgcctgcaggtcgactctagaggatccccgggtaccgagctcgaattcactggccgtcgttttacaacgt
引物2，5’-3’：
tattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggcca
引物3，5’-3’：
tttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatggcgcctgatgcggtattt
引物3，5’-3’：
tggcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatag
②将上述4条引物进行常规化学合成，这将花费7-8h。
③配制反应体系：
④PCR扩增，耗时1.5h。
具体见图4。
采用上述常规合成方法全长总共耗时8.5-9.5h，此外增加的步骤将导致实验难度加大，特别是上述步骤④，在不同的基因合成中需要调整实验方案，时常会失败导致重做。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (13)
1.一种合成寡聚脱氧核糖核苷酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：
A）制备模板引物库，所述模板引物库为随机模板引物的集合，每一模板引物的3’端被磷酸化修饰，所述随机模板引物的长度为6bp-9bp，所述模板引物库中的随机模板引物的数量为4m，m为随机模板引物的长度，所述模板引物库中的随机模板引物以预设规则置于模板引物孔板的矩阵小孔中；
B）制备起始引物库，所述起始引物库为随机起始引物的集合，每一起始引物固定在固相载体上，所述随机起始引物的长度为6bp-9bp，所述起始引物库中的随机起始引物的数量为4n，n为随机起始引物的长度，所述起始引物库中的随机起始引物以预设规则置于起始引物孔板的矩阵小孔中；
C）根据待合成寡聚脱氧核糖核苷酸的序列在起始引物库中选择对应的起始引物，随后依次在模板引物库中选择对应的模板引物并进行单个碱基的延伸反应，以在起始引物的3’端合成下个碱基，直至合成完整的寡聚脱氧核糖核苷酸；
所述寡聚脱氧核糖核苷酸的长度为200-500bp。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固相载体为磁珠。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，第一个碱基的延伸反应体系为：10×DNA聚合酶 Buffer 1μL，起始引物 1μL，模板引物 1μL，可逆终止dNTP 1μL，DNA聚合酶 1μL，加ddH2O至总体积为10μL。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，第二个碱基及其后续单个碱基的延伸反应体系为：10×DNA 聚合酶 Buffer 1μL，上一延伸反应产物 1μL，模板引物 1μL，可逆终止dNTP 1μL，DNA聚合酶 0.5μL，加ddH2O至总体积为10μL。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述起始引物的母液浓度为0.05-0.15μM；所述模板引物的母液浓度为8-12μM；所述可逆终止dNTP的母液浓度为20-30mM；所述DNA聚合酶的浓度为1-5U/μL。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述起始引物的母液浓度为0.1μM；所述模板引物的母液浓度为10μM；所述可逆终止dNTP的母液浓度为25mM；所述DNA聚合酶的浓度为2U/μL。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述延伸反应的条件为：94℃变性30s，20-40℃退火30s，72℃延伸30s。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在每一碱基的延伸反应中，延伸反应重复进行3-5次。
9.一种合成寡聚脱氧核糖核苷酸的试剂盒，其特征在于，包括：
模板引物孔板，其装载有模板引物库，所述模板引物库为随机模板引物的集合，每一模板引物的3’端被磷酸化修饰；所述模板引物库中的随机模板引物的数量为4m，m为随机模板引物的长度，所述模板引物库中的随机模板引物以预设规则置于模板引物孔板的矩阵小孔中；
起始引物孔板，其装载有起始引物库，所述起始引物库为随机起始引物的集合，每一起始引物固定在固相载体上；所述起始引物库中的随机起始引物的数量为4n，n为随机起始引物的长度，所述起始引物库中的随机起始引物以预设规则置于起始引物孔板的矩阵小孔中；
所述随机模板引物的长度为6bp-9bp；所述随机起始引物的长度为6bp-9bp；
所述寡聚脱氧核糖核苷酸的长度为200-500 bp。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述固相载体为磁珠。
11. 根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，还包括10×DNA 聚合酶 Buffer、可逆终止dNTP、DNA聚合酶和ddH2O中的至少一种。
12.根据权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，起始引物的母液浓度为0.05-0.15μM；模板引物的母液浓度为8-12μM；可逆终止dNTP的母液浓度为20-30mM；所述DNA聚合酶的浓度为1-5U/μL。
13.根据权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，起始引物的母液浓度为0.1μM；模板引物的母液浓度为10μM；可逆终止dNTP的母液浓度为25mM述DNA聚合酶的浓度为2U/μL。
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