CN111944828B - 花生突变体的制备方法、花生突变基因及其编码的蛋白质和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及花生突变体的制备方法、花生突变基因及其编码的蛋白质和应用。本发明通过设计sgRNA T1‑T4以构建CRISPR/Cas9基因组编辑系统，由sgRNA引导的Cas9酶在基因靶点对花生去饱和脂肪酸酶基因AhFAD2A进行切割，经DNA修复后产生基因序列的插入或碱基的突变，从而完成对花生去饱和脂肪酸酶基因AhFAD2A的靶向突变，使得该基因不能合成有功能的去饱和脂肪酸酶，无法催化油酸脱氢产生亚油酸，有利于获得高油酸含量的花生，改良花生品种的品质。

Description

花生突变体的制备方法、花生突变基因及其编码的蛋白质和 应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种花生突变体的制备方法、一种花生突变基因及其编码的蛋白质和应用，以及一种用于检测花生突变基因的引物。
背景技术
花生作为优质食用油的原料，是我国重要的油料作物和经济作物，其总产量和消费量占世界的40%以上，出口量占世界的55%以上（联合国数据中心，2012），在国际上具有很强的竞争力。花生种子含油量非常丰富，平均含油量可达51%左右，广受市场欢迎。花生油的主要成分有单不饱和脂肪酸油酸（C18:1，Δ9）、多不饱和脂肪酸亚油酸（C18:2，Δ9，Δ12）以及饱和脂肪酸棕榈酸（C16:0）和硬脂酸(C18:0)组成，其中，不饱和脂肪酸约为80％(油酸36％-67％，亚油酸15％-43％)，饱和脂肪酸占20％(棕榈酸6％-11％，硬脂酸2％-6％，花生酸5％-7％，山嵛酸2％-3％)。花生种子中的脂肪酸组成及其含量是衡量其品质优劣的重要指标。油脂稳定性方面，亚油酸属多不饱和脂肪酸，其油酰残基易氧化而导致油脂腐败劣变，严重影响油脂储存期；而油酸分子只含有一个双价不饱和键，化学结构相对比较稳定，抗氧化能力强，油酸的自氧化性比亚油酸稳定10倍，油酸/亚油酸比例高的花生更耐储存，在精炼、储藏和煎炸时不易变质，与普通花生相比，高油酸含量的花生具有更长的货架期。营养价值方面，花生油的品质对花生油固定消费人群的健康具有重要影响。油酸的营养价值较高，其可降低血液中低密度脂蛋白的含量，同时维持有益高密度脂蛋白水平，更有效地保护心脑血管，还能逆转炎性细胞因子TNF-α对胰岛素产生的抑制作用。在食品健康越来越受重视的今天，高油酸比例的食用油是众多食品加工企业平衡饱和脂肪酸和非饱和脂肪酸使用的一个优佳选择。因此，提高油酸含量已经成为花生品质育种的一个重要目标。
去饱和脂肪酸酶(Δ12FAD或FAD2)是催化油酸的C12位上脱氢生成双不饱和亚油酸的关键酶，它控制油酸、亚油酸的含量及其比值(O/L)。分子生物学研究越来越多的证据表明，AhFAD2是油酸生成亚油酸的关键基因，决定花生种子中油酸和亚油酸的相对含量。栽培种花生(Arachis hypogaea)是具有基因组A和基因组B的异源四倍体物种(2n＝4x＝40)，AhFAD2由位于不同基因组上的2对非等位同源基因AhFAD2A和AhFAD2B共同编码，它们分别来源于花生野生种A和B基因组，该2个基因均不属于种子特异表达基因，在普通油酸含量花生品种中这2个基因或者其中之一能正常表达，而在高油酸品种中，AhFAD2A和AhFAD2B基因均突变共同导致高油酸性状的产生。
美国科学家最早从花生资源中鉴定筛选出油酸含量79％(O/L为37)的高油酸花生自然突变体F435。通过对普通油酸花生与F435序列比对发现，在AhFAD2A的编码区从起始密码子起第448bp碱基发现存在单碱基替换(G＞A)，使编码的蛋白质第150位氨基酸由天冬氨酸(D)转变为天冬酰胺(N)，而D150残基在所有FAD2中是绝对保守的，是高油酸性状的关键位点，突变导致AhFAD2A酶活性降低；在AhFAD2B基因起始密码子起第441_442bp处存在单碱基插入(442insA)，造成密码突变，导致翻译的蛋白质序列提前终止，产生无活性的蛋白。之后，美国科学家利用化学诱变直接育成了高油酸花生品种C458和M2-225，它们在AhFAD2A自然突变(G448A)基础上，诱变又使AhFAD2B基因起始密码子后第665bp和997bp处分别插入微型反向重复转座元件MITE(205bp)，导致肽链提前终止，使蛋白功能丧失。以上AhFAD2B突变基因均属于无义突变(Nonsense mutation)，使产生的蛋白不完全而丧失原基因的功能，已成为花生高油酸育种的基因源。
然而，符合高油酸低软脂酸要求的花生种质资源长期掌握在国外研究机构及农资企业手中，同时受到国际政治博弈、专利保护等因素的钳制限制了这些优质资源在国内的应用。系谱分析追溯我国已育成高油酸品种的高油酸基因来源，70％以上品种的高油酸基因供体来源于F435。高油酸基因源单一化，已造成育成的高油酸品种遗传基础相对狭窄、遗传多样性下降，产量与品质的矛盾及优质与抗病性的矛盾日益突出。目前，国内生产上大面积应用的花生品种油酸含量普遍较低(＜50％)，而棕榈酸含量较高(＞11％)，国内花生种质资源的油酸含量均未超过70％，最大含量仅67.2％。
国际上除上述F435高油酸基因资源外，最近，美国科学家又鉴定出2个新的高油酸花生自然突变体PI342664和PI342666，其AhFAD2A基因编码区448位G＞A突变与先前报道相同，而AhFAD2B基因突变C301G导致氨基酸H101D改变属于新的突变位点，最终使突变体油酸含量达到79％以上。印度花生育种家采用γ射线诱变抗病品种，获得2个新的高油酸突变体(GM6-1和GM4-3)，油酸含量均在75％以上，研究发现AhFAD2B基因发生碱基替换G1111A导致氨基酸G372S改变，从而产生高油酸表型。另外，国内花生研究者利用EMS化学诱变获得AhFAD2B基因新的突变位点C313T，引起氨基酸序列H105Y突变，使油酸含量由44％提高到60％以上。但是，传统的育种手段需要消耗大量的人力物力财力，在大量的自然群体或诱变群体中寻找极少的突变材料，不能在较短的时期内完成有针对性的育种任务，同时伴有极大的失败可能性。
发明内容
本发明的目的是提供一种花生突变体的制备方法、一种花生突变基因及其编码的蛋白质和应用，以及一种用于检测花生突变基因的引物，旨在解决现有对高油酸花生育种中存在工作量大的技术问题。
为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明一方面提供了一种花生突变体的制备方法，其包括如下步骤：
提供花生去饱和脂肪酸酶基因AhFAD2A的编码区序列、CRISPR/Cas9基因编辑载体和花生胚性愈伤组织；
根据所述花生去饱和脂肪酸酶基因AhFAD2A的编码区序列，得到sgRNA靶点序列T1-T4；
根据所述sgRNA靶点序列T1-T4，分别合成含粘性末端的sgRNA靶点序列核苷酸片段及其互补链，经混合退火，得到两端含所述粘性末端的双链DNA T1-T4；
将所述双链DNA T1-T4分别与所述CRISPR/Cas9基因编辑载体进行连接处理，得到基因编辑载体T1-T4；
将所述基因编辑载体T1-T4中的至少一种对所述花生胚性愈伤组织进行基因转化，经培养，得到所述花生突变体；
其中，所述sgRNA靶点序列T1-T4的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1-4所示，所述花生去饱和脂肪酸酶基因AhFAD2A的编码区序列如SEQ ID NO:5所示。
本发明另一方面提供了一种花生突变基因，其是花生去饱和脂肪酸酶基因AhFAD2A的编码区序列发生突变，使得该基因不能合成有功能的去饱和脂肪酸酶。该花生突变基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
本发明再一方面提供了上述花生突变基因编码的蛋白质，其是花生去饱和脂肪酸酶基因AhFAD2A的编码区序列所编码的蛋白质，氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。
本发明又一方面提供了上述花生突变体的制备方法制备得到的花生突变体、上述的花生突变基因及其编码的蛋白质在高油酸花生品种选育中的应用。
本发明最后一方面提供了一种用于检测花生突变基因的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO:10-11所示。
本发明提供的花生突变体的制备方法中，通过设计CRISPR靶点序列sgRNA T1-T4以构建CRISPR/Cas9基因组编辑系统，由sgRNA引导的Cas9酶在基因靶点对花生去饱和脂肪酸酶基因AhFAD2A进行切割，经DNA修复后产生基因序列的插入或碱基的突变，从而完成对花生去饱和脂肪酸酶基因AhFAD2A的靶向突变，使得该基因不能合成有功能的去饱和脂肪酸酶，进而影响催化油酸向亚油酸的反应，得到高油酸含量的花生突变体。本发明提供的制备方法可以实现对基因位点的靶向突变，减少传统突变方法中存在的随意性、偶然性和不可知性，具有操作方便、突变速度快、效率高的优点，所得花生突变体可稳定遗传，对提升花生的品质、丰富其遗传多样性具有重要意义。
本发明提供的花生突变基因是在花生去饱和脂肪酸酶基因AhFAD2A的编码区序列基础上，按照不同碱基的突变、碱基的插入等多种突变方式中的至少一种突变，使得该基因不能合成有功能的去饱和脂肪酸酶，因此无法催化油酸脱氢产生亚油酸，有利于获得高油酸含量的花生，改良花生品种的品质。
本发明提供的花生突变基因编码的蛋白质是在花生去饱和脂肪酸酶基因AhFAD2A的编码区序列所编码的蛋白质的基础上，经氨基酸的突变得到。与野生型花生相比，本发明提供的花生突变基因编码的蛋白质可通过育种获得花生突变体，影响花生去饱和脂肪酸酶的活性，使其无法催化油酸脱氢产生亚油酸，有利于获得高油酸含量的花生，改良花生品种的品质。
由于本发明提供的花生突变基因及其编码的蛋白质均对花生去饱和脂肪酸酶基因AhFAD2A的编码序列及其编码蛋白进行了突变，且本发明提供的花生突变体的制备方法所制备得到的花生突变体具有高油酸含量的特点，因此，将上述突变基因或上述花生突变体应用于花生品种选育时，可以获得高油酸含量的花生品种。
本发明提供的用于检测花生突变基因的引物通过对花生突变体植株的基因组DNA为模板进行扩增，扩增产物与野生型植株的基因序列进行比对，即可准确、快速地鉴定花生突变体植株中的突变基因和突变位点，可显著提高花生育种性状鉴定的准确性，加快育种进程。
附图说明
图1为本发明实施例基因组编辑载体的构建流程图，其中，图1A为基因编辑载体T1克隆到载体的过程；图1B为基因编辑载体T1-T4克隆到同一个载体的过程；
图2为本发明实施例通过CRISPR/CAS9基因组编辑制备花生突变体的流程图；
图3为本发明实施例所得花生突变体基因与花生去饱和脂肪酸酶基因AhFAD2A的核苷酸序列对比图（第一部分）；
图4为本发明实施例所得花生突变体基因与花生去饱和脂肪酸酶基因AhFAD2A的核苷酸序列对比图（第二部分）；
图5为本发明实施例所得花生突变体基因与花生去饱和脂肪酸酶基因AhFAD2A的核苷酸序列对比图（第三部分）。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和技术效果更加清楚，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。结合本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
在本发明的描述中，术语“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B的情况。其中A，B可以是单数或者复数。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
需要理解的是，本发明实施例中所提到的相关成分的重量不仅仅可以指代各组分的具体含量，也可以表示各组分间重量的比例关系，因此，只要是按照本发明实施例相关组分的含量按比例放大或缩小均在本发明公开的范围之内。具体地，本发明实施例中所述的重量可以是μg、mg、g、kg等化工领域公知的质量单位。
另外，除非上下文另外明确地使用，否则词的单数形式的表达应被理解为包含该词的复数形式。术语“包括”或“具有”旨在指定特征、数量、步骤、操作、元件、部分或者其组合的存在，但不用于排除存在或可能添加一个或多个其它特征、数量、步骤、操作、元件、部分或者其组合。
需要说明的是，本发明实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；相关试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
本发明实施例提供了一种花生突变体的制备方法，其包括如下步骤：
S1、提供花生去饱和脂肪酸酶基因AhFAD2A的编码区序列、CRISPR/Cas9基因编辑载体和花生胚性愈伤组织；
S2、根据花生去饱和脂肪酸酶基因AhFAD2A的编码区序列，得到sgRNA靶点序列T1-T4；
S3、根据sgRNA靶点序列T1-T4，分别合成含粘性末端的sgRNA靶点序列核苷酸片段及其互补链，经混合退火，得到两端含粘性末端的双链DNA T1-T4；
S4、将双链DNA T1-T4分别与CRISPR/Cas9基因编辑载体进行连接处理，得到基因编辑载体T1-T4；
S5、将基因编辑载体T1-T4中的至少一种对花生胚性愈伤组织进行基因转化，经培养，得到花生突变体；
其中，sgRNA靶点序列T1-T4的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1-4所示，花生去饱和脂肪酸酶基因AhFAD2A的编码区序列如SEQ ID NO:5所示。
本发明实施例提供的花生突变体的制备方法中，通过设计CRISPR靶点序列sgRNAT1-T4以构建CRISPR/Cas9基因组编辑系统，由sgRNA引导的Cas9酶在基因靶点对花生去饱和脂肪酸酶基因AhFAD2A进行切割，经DNA修复后产生基因序列的插入或碱基的突变，从而完成对花生去饱和脂肪酸酶基因AhFAD2A的靶向突变，使得该基因不能合成有功能的去饱和脂肪酸酶，无法催化油酸脱氢产生亚油酸，有利于获得高油酸含量的花生，改良花生品种的品质。本发明实施例提供的制备方法可以实现对基因位点的靶向突变，减少传统突变方法中存在的随意性、偶然性和不可知性，具有操作方便、突变速度快、效率高的优点，所得花生突变体可稳定遗传，对提升花生的品质、丰富其遗传多样性具有重要意义。
本发明实施例提供的花生突变体的制备方法以及对所得突变体进行鉴定的流程如图2所示。具体地，S1中，花生去饱和脂肪酸酶基因AhFAD2A的编码区序列可通过PCR扩增得到。在一些实施例中，以花生去饱和脂肪酸酶基因FadS（Arachis hypogaea omega-6desaturase (FadS) mRNA序列，GenBank: AF030319.1）为模板，用于扩增的引物包括正向扩增引物FAD2A-f和反向扩增引物FAD2A-r，且正向扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示，所述反向扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。
进一步地，通过对PCR反应的体系和反应条件的优化，可以提高PCR反应效率，避免发生非特异性扩增。具体地，每50μlPCR扩增的反应体系包括双蒸水（ddH2O）13μl、扩增引物5μl（FAD2A-f和FAD2A-f各2.5μl）、花生去饱和脂肪酸酶基因FadS 5μl、2×Taq mix 25μl、Mg2+ 1μl和甘油1μl。PCR扩增的反应条件是：先95℃预变性5min，然后以95℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸1min为一个循环，循环40次后，72℃完全延伸10min后，4℃保存。
CRISPR/Cas9基因编辑载体，由于本发明实施例采用CRISPR/Cas9基因编辑系统制备花生突变体，相应地，所用的载体应为CRISPR/Cas9基因编辑载体。可以理解的是，该基因编辑载体中含有应Cas9系统，在转入宿主细胞后，其产生的人工构建的向导RNA就能指导Cas9蛋白切割宿主细胞特定的DNA序列，从而起到基因编辑的作用。在一些实施例中，选择pKSE401双元载体作为基因编辑载体。这是因为花生属于双子叶植物，pKSE401双元载体是一种适用于双子叶植物的基因编辑载体，可高效诱导基因组编辑，并且该载体融合了绿色荧光蛋白，有利于后续进行高效筛选。
花生胚性愈伤组织，在本发明实施例中用于诱导获得花生突变体。
S2中，根据花生去饱和脂肪酸酶基因AhFAD2A的编码区序列，对靶点序列进行设计，得到sgRNA靶点序列T1-T4。具体地，对靶点序列的设计要求为：（1）靶点序列主要包括15-25个碱基，（2）这15-25个碱基后面是NGG（N 为任意碱基）3 个碱基的PAM区（Protospacer adjacent motif，PAM）。所得sgRNA靶点序列为sgRNA靶点序列T1、sgRNA靶点序列T2、sgRNA靶点序列T3和sgRNA靶点序列T4。
需要说明的是，本发明实施例的CRISPR靶点是以基因同源序列区域进行设计为例来说明其步骤，并非是对本发明的靶点序列选择的限制。事实上，靶点既可以是基因编码区的任意序列，也可以是影响基因表达的上游或下游调控序列，如启动子序列，增强子序列等。此外，靶点既可以是1个，也可以是2个或多个，在使用时，可以单独或一起使用。
S3中，根据sgRNA靶点序列T1-T4，分别合成含粘性末端的sgRNA靶点序列核苷酸片段及其互补链。在一些实施例中，粘性末端为BsaI限制性内切酶切割的粘性末端，相应地，含粘性末端的sgRNA靶点序列核苷酸片段及其互补链的末端序列分别为5’-ATTG-3’和3’-CAAA-5’。
通过将含粘性末端的sgRNA靶点序列核苷酸片段及其互补链混合退火，得到两端含粘性末端的双链DNA T1-T4。
双链DNA T1的序列如下：
5’-ATTGAACCCTCCATTCAGTGTTGG
TTGGGAGGTAAGTCACAACCCAAA-5’
双链DNA T2的序列如下：
5’-ATTGCAAGGCTGCATTCTCACTGG
GTTCCGACGTAAGAGTGACCCAAA-5’
双链DNA T3的序列如下：
5’-ATTGGAGATAGCCCTCCCTGGTGG
CTCTATCGGGAGGGACCACCCAAA-5’
双链DNA T4的序列如下：
5’-ATTGACAGTGGACAGAGATTATGG
TGTCACCTGTCTCTAATACCCAAA-5’
S4中，将双链DNA T1-T4分别与CRISPR/Cas9基因编辑载体进行连接处理，分别得到基因编辑载体T1-T4。基因编辑载体T1-T4的构建流程图如图1所示。在一些实施例中，CRISPR/Cas9基因编辑载体经过限制性内切酶的酶切处理。具体地，限制性内切酶优选BsaI酶，这是因为sgRNA靶点序列T1-T4核苷酸片段及其互补链的末端经过BsaI限制性内切酶切割，因此选择BsaI酶对CRISPR/Cas9基因编辑载体进行酶切处理将有利于双链DNA T1-T4与CRISPR/Cas9基因编辑载体的连接。
S5中，将基因编辑载体T1-T4中的至少一种对花生胚性愈伤组织进行基因转化，经培养，得到花生突变体。其中，基因编辑载体T1-T4可以分别单独转化，也可以混合转化，还可以将两者克隆到同一个载体进行转化，或设计更多的靶点进行转化，同时敲除多个基因或基因位点，设计含有2个以上靶点的载体。具体方法可参照(Xing HL, Dong L, Wang ZP,Zhang HY, Han CY, Liu B, Wang XC, Chen QJ. A CRISPR/Cas9 toolkit formultiplex genome editing in plants. BMC Plant Biol. 2014 Nov 29;14(1):327.)发表的方法进行，此处不再赘述。
本发明实施例还提供了一种花生突变基因，其是花生去饱和脂肪酸酶基因AhFAD2A的编码区序列发生突变，使得该基因不能合成有功能的去饱和脂肪酸酶，其核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
本发明实施例提供的花生突变基因是在花生去饱和脂肪酸酶基因AhFAD2A的编码区序列基础上，按照不同碱基的突变、碱基的插入等多种突变方式中的至少一种突变得到多个花生突变基因，使得该基因不能合成有功能的去饱和脂肪酸酶，无法催化油酸脱氢产生亚油酸，有利于获得高油酸含量的花生，改良花生品种的品质。
相应地，本发明实施例还提供了上述花生突变基因编码的蛋白质，其是花生去饱和脂肪酸酶基因AhFAD2A的编码区序列所编码的蛋白质突变得到，其氨基酸序列如SEQ IDNO:9所示。
本发明实施例提供的花生突变基因编码的蛋白质是在花生去饱和脂肪酸酶基因AhFAD2A的编码区序列所编码的蛋白质的基础上，经氨基酸的突变得到。与野生型花生相比，本发明实施例提供的花生突变基因编码的蛋白质可通过育种获得花生突变体，影响花生去饱和脂肪酸酶的活性，使其无法催化油酸脱氢产生亚油酸，有利于获得高油酸含量的花生，改良花生品种的品质。
相应地，本发明实施例还提供了上述花生突变体的制备方法制备得到的花生突变体、上述的花生突变基因及其编码的蛋白质在高油酸花生品种选育中的应用。
由于本发明实施例提供的花生突变基因及其编码的蛋白质均对花生去饱和脂肪酸酶基因AhFAD2A的编码序列及其编码蛋白进行了突变，使得该基因不能合成有功能的去饱和脂肪酸酶，无法催化油酸脱氢产生亚油酸，且本发明实施例提供的花生突变体的制备方法所制备得到的花生突变体具有高油酸含量的特点，因此，将上述突变基因或上述花生突变体应用于花生品种选育时，可以获得高油酸含量的花生品种。
本发明实施例还提供了一种用于检测花生突变基因的引物FAD2A-f’和FAD2B-r’，其核苷酸序列如SEQ ID NO:10-11所示。
本发明实施例提供的用于检测花生突变基因的引物通过对花生突变体植株的基因组DNA为模板进行扩增，扩增产物与野生型植株的基因序列进行比对，即可准确、快速地鉴定花生突变体植株中的突变基因和突变位点，可显著提高花生育种性状鉴定的准确性，加快育种进程。
为使本发明上述实施细节和操作能清楚地被本领域技术人员理解，以及本发明实施例花生突变体的制备方法、花生突变基因及其编码的蛋白质和应用的进步性能显著的体现，以下通过实施例来举例说明上述技术方案。
实施例
1. 花生去饱和脂肪酸酶基因AhFAD2A的克隆及测序
根据栽培花生（Arachis hypogaea）omega-6 desaturase (FadS) mRNA序列（GenBank: AF030319.1）设计PCR引物FAD2A-f和FAD2A-r，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示。
取花生叶片，试剂盒提取基因组DNA，通过PCR扩增AhFAD2A基因。PCR反应体系如下：
50 μl反应体系中包括：ddH2O：13μl，引物:5μl，DNA:5μl，2×Taq mix：25μl，Mg2+：1μl，甘油：1μl。
反应条件如下：先95℃预变性5min，然后以95℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸1min为一个循环，循环40次后，72℃完全延伸10min后，4℃保存。
对PCR产物进行DNA测序，获得AhFAD2A基因编码区序列，其核苷酸序列分别如SEQID NO:5所示。
2. 基因组编辑载体的构建
利用CRISPR设计程序Cas-Designer（http://www.rgenome.net/）根据上述AhFAD2A基因编码区序列，以野生花生Arachis duranensis基因组序列（PeantBase v1.0）为参考基因组，设计4条sgRNA靶点序列T1-T4，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1-4所示。分别合成带接头的该4条sgRNA序列的正义链和反义链，混合退火后形成如下4条双链DNA：
双链DNA T1的序列如下：
5’-ATTGAACCCTCCATTCAGTGTTGG
TTGGGAGGTAAGTCACAACCCAAA-5’
双链DNA T2的序列如下：
5’-ATTGCAAGGCTGCATTCTCACTGG
GTTCCGACGTAAGAGTGACCCAAA-5’
双链DNA T3的序列如下：
5’-ATTGGAGATAGCCCTCCCTGGTGG
CTCTATCGGGAGGGACCACCCAAA-5’
双链DNA T4的序列如下：
5’-ATTGACAGTGGACAGAGATTATGG
TGTCACCTGTCTCTAATACCCAAA-5’
然后分别插入到sgRNA表达框的BsaI位点（如图1所示），再克隆到pKSE401双元载体上，得到基因编辑载体T1-T4，进行基因转化（图1A）。其中，基因编辑载体T1和基因编辑载体T2可以单独转化，也可以混合转化，也可以将基因编辑载体T1和基因编辑载体T2克隆到同一个载体进行转化（图1B），或者设计更多的靶点进行转化，同时敲除多个基因或基因位点。设计含有2个以上的靶点的基因编辑载体，参照(Xing HL, Dong L, Wang ZP, ZhangHY, Han CY, Liu B, Wang XC, Chen QJ. A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplexgenome editing in plants. BMC Plant Biol. 2014 Nov 29;14(1):327.) 发表的方法进行。
3. 花生胚性愈伤组织的诱导和培养
成熟花生种子表面消毒：20% Clorox（含1% w/v次氯酸钠）中20分钟2次，无菌水冲洗3次。超净台中切去花生胚芽(plumule)，去掉子叶及胚根，放MS5PG诱导培养基上，26-28℃暗培养，诱导胚性愈伤组织。胚性愈伤组织每2-3周继代1次，4-6周后转入MS3PG培养基进行胚状体的扩增及保持。
诱导培养基成分：
MS5PG：4.4 g/L MS basal salts (Sigma-Aldrich #M5519)，蔗糖30.0 g/L，谷氨酰胺1.0 g/L，毒莠定 5.0 mg/L，琼脂粉8 g/L，pH 5.8，高压灭菌后分装。
MS3PG：4.4 g/L MS basal salts (Sigma-Aldrich #M5519)，蔗糖30.0 g/L，谷氨酰胺1.0 g/L，毒莠定 3.0 mg/L，琼脂粉8 g/L，pH 5.8，高压灭菌后分装。
花生胚性愈伤组织的基因转化：花生胚性愈伤组织在MS3PGO培养基上进行渗透压预处理4小时，利用伯乐公司基因枪PDS-1000/HE进行转化，金粉颗粒为伯乐公司0.6微米金粉，每个转化质粒DNA用量为2微克，转化压力为650 PSI，转化距离为6厘米。转化后在渗透培养基上保留过夜，然后重新转到MS3PG培养基上，26-28℃暗培养7天后转入筛选培养基MS3PGK50 （MS3PG培养基，添加50 mg/L卡那霉素），26-28℃暗培养8-10周，每3-4周换一次培养基。
抗性愈伤组织的分化：8-10周后筛选出来的抗性愈伤组织转移到MSC分化培养基（4.4 g/L MS basal salts (Sigma-Aldrich #M5519)，蔗糖20.0 g/L，活性炭 1.0 g/L，卡那霉素50 mg/L，琼脂粉8 g/L，pH 5.8，高压灭菌后分装），26-28℃光照培养（每日16小时光照）4-6周，胚状体转移到MS10培养基（4.4 g/L MS basal salts (Sigma-Aldrich #M5519)，蔗糖20.0 g/L，苄氨基嘌呤 10 mg/L，卡那霉素50 mg/L，琼脂粉8 g/L，pH 5.8，高压灭菌后分装），26-28℃光照培养（每日16小时光照），每3-4周继代一次，直至长成小苗，然后将小苗转入MSOR培养基（4.4 g/L MS basal salts (Sigma-Aldrich #M5519)，蔗糖20.0g/L，萘乙酸 1.0 mg/L，卡那霉素50 mg/L，琼脂粉8 g/L，pH 5.8，高压灭菌后分装），26-28℃光照培养（每日16小时光照），诱导生根，3-4叶大的生根幼苗移栽到花盆土中，在培养室中光照培养直至开花结果。
4. 转基因植物的鉴定
移栽成活的幼苗，取幼苗叶片，试剂盒提取基因组DNA。根据pKSE401载体上Cas9基因序列，设计PCR引物Cas9f（核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示）和Cas9r（核苷酸序列如SEQID NO:13所示）。
以花生幼苗基因组DNA为模板，通过PCR进行验证转基因。在11株转基因幼苗中有12株为阳性，阳性率为75.0%。
5. 突变体的鉴定
以转基因植株基因组DNA为模板，扩增引物为FAD2A-f’（核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示）和FAD2A-r’（核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示）。将扩增PCR片段进行克隆，然后挑选单克隆进行测序。每个基因转化植株挑选10个单克隆进行测序，测序结果通过NCBI网站BLAST程序和野生型植株基因序列（SEQ ID NO:5）比对，鉴定突变基因。鉴定结果和突变基因位点如图3-5所示。
对突变位点进行统计，如表1所示。
表1 AhFAD2A基因突变位点
Figure 814938DEST_PATH_IMAGE001
结合图3-5和表1的对比结果可以看出，本发明实施例共获得16株转基因花生，通过对靶基因分析，发现29个突变。其中13个突变不造成编码蛋白质序列的变化，16个突变引起蛋白质序列的变化。其中突变体12-6在451位的碱基由G变为T引起相应的密码子由GAA变为终止密码子TAA（核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示），使蛋白质翻译提前终止，产生150个氨基酸的蛋白质（如SEQ ID NO:9所示），该突变破坏了位于79-340氨基酸的脂肪酸去饱和酶结构域，因此产生的多肽失去催化油酸去饱和产生亚油酸的功能，有利于获得高油酸含量的花生，改良花生品种的品质。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 深圳大学
<120> 花生突变体的制备方法、花生突变基因及其编码的蛋白质和应用
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aaccctccat tcagtgttgg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caaggctgca ttctcactgg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gagatagccc tccctggtgg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acagtggaca gagattatgg 20
<210> 5
<211> 1140
<212> DNA
<213> 花生(Arachis hypogaea)
<400> 5
atgggagctg gagggcgtgt cactaagatt gaagctcaaa agaagcctct ttcaagggtt 60
ccacattcaa accctccatt cagtgttggc caactcaaga aagcaattcc accacattgc 120
tttgaacgtt ctcttttcat atcattctcc tatgttgtct atgatctctt agtggcctac 180
ttactcttct acattgccac cacttatttc cacaagcttc catacccatt ttccttcctt 240
gcttggccaa tctattgggc catccaaggc tgcattctca ctggtgtttg ggtgattgct 300
catgagtgtg gccaccatgc cttcagcaag taccaacttg ttgatgacat ggttggtttg 360
acccttcact cttgtctatt agttccttat ttctcatgga aaatcagcca ccgccgccac 420
cactccaaca ccggttccct cgaccgcaac gaagtgtttg tcccaaaacc aaaatcaaag 480
gtatcatggt ataacaagta catgaacaat ccaccaggga gggctatctc cctcttcatc 540
acactcacac taggatggcc cttgtacttg gccttcaatg tttctggcag accctatgat 600
agatttgcaa gccactatga cccttatgct cccatatact ctaacaggga aaggcttcta 660
atttatgtct cagattcatc tgtctttgct gtaacatatc tgctatatca catagcaact 720
ctgaaaggtt tgggttgggt ggtatgtgtt tatggggtgc cattgctcat tgtgaatggg 780
tttctagtta ccataaccta tttgcagcac acacatgcat cattgcctca ctatgattca 840
tccgaatggg actggttaag aggagcattg gcaacagtgg acagagatta tgggatactg 900
aataaggcat ttcatcatat aactgatacg catgtggctc atcatttgtt ctcaacaatg 960
cctcattacc atgcaatgga agcaaccaat gcaataaagc caatattggg tgattactac 1020
caatttgatg gcaccccatt ttacaaagca ttgtggagag aagccaaaga gtgcctctat 1080
gtggagccag atgatggagc ttctaagaag ggtgtttatt ggtacaagaa caagttctga 1140
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcgagattca tcataggaga agcac 25
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aaactagtag tagtagtagt agtac 25
<210> 8
<211> 1147
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atgggagctg gagggcgtgt cactaagatt gaagctcaaa agaagcctct ttcaagggtt 60
ccacattcaa accctccatt cagtgttggc caactcaaga aagcaattcc accacattgc 120
tttgaacgtt ctcttttcat atcattctcc tatgttgtct atgatctctt agtggcctac 180
ttactcttct acattgccac cacttatttc caccagcttc catacccatt ttccttcctt 240
gcttggccaa tctattgggc catccaaggc tgcattctca ctggtgtttg ggtgattgct 300
catgagtgtg gccaccatgc cttcagcaag tatcaacttg ttgatgacat ggttggtttg 360
atccttcact cttgtctatt agtcccttat ttctcatgga aaatcagcca ccgccacctc 420
cactccaaca ccggttccct cgaccgcgac taagtgtttg tcctgaaacc aaaatcaaag 480
gtatcacggt ataacaagta catgaacaat ccactagaga gggctatttc ccttttcatc 540
acactcacac taggatggcc cttgtacttg gccttcaatg tttctggcag accctatgat 600
agatttgcaa gccactatga cccttatgct cccatatact ctaacaggga aaggcttcta 660
atttatgtct caggactcag attcatctgt ctttgctgta acatatctgc tatatcacat 720
agcaactttg aaaggtttgg gttgggtggt atgtgtttat ggggtgccat tgctcattgt 780
gaatgggttt ctagttacca taacctattt gcagcacaca catgcatcat tgcctcacta 840
tgattcatcc gaatgggact ggttaagagg agcattggca acagtggaca gagattatgg 900
gatactgaat aaggcatttc atcatataac tgatacgcat gtggctcatc atttgttctc 960
aacaatgcct cattaccatg caatggaagc aaccaatgca ataaagccaa tattgggtga 1020
ttactaccaa tttgatggca ccccatttta caaagcattg tggagagaag ccaaagagtg 1080
cctctatgtg gagccagatg atggagcttc taagaagggt gtttattggt acaagaacaa 1140
gttctga 1147
<210> 9
<211> 150
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Met Gly Ala Gly Gly Arg Val Thr Lys Ile Glu Ala Gln Lys Lys Pro
1 5 10 15
Leu Ser Arg Val Pro His Ser Asn Pro Pro Phe Ser Val Gly Gln Leu
20 25 30
Lys Lys Ala Ile Pro Pro His Cys Phe Glu Arg Ser Leu Phe Ile Ser
35 40 45
Phe Ser Tyr Val Val Tyr Asp Leu Leu Val Ala Tyr Leu Leu Phe Tyr
50 55 60
Ile Ala Thr Thr Tyr Phe His Lys Leu Pro Tyr Pro Phe Ser Phe Leu
65 70 75 80
Ala Trp Pro Ile Tyr Trp Ala Ile Gln Gly Cys Ile Leu Thr Gly Val
85 90 95
Trp Val Ile Ala His Glu Cys Gly His His Ala Phe Ser Lys Tyr Gln
100 105 110
Leu Val Asp Asp Met Val Gly Leu Thr Leu His Ser Cys Leu Leu Val
115 120 125
Pro Tyr Phe Ser Trp Lys Ile Ser His Arg Arg His His Ser Asn Thr
130 135 140
Gly Ser Leu Asp Arg Asn
145 150
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
acggagcttt aacaacacaa caatg 25
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cgttttcaac tctgactatg catca 25
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gacaagaagt actcgatcgg cctcg 25
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tcgtagggta cttctcgtgg taggc 25

Claims (9)

1.一种花生突变体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
提供花生去饱和脂肪酸酶基因AhFAD2A的编码区序列、CRISPR/Cas9基因编辑载体和花生胚性愈伤组织；
根据所述花生去饱和脂肪酸酶基因AhFAD2A的编码区序列，得到sgRNA靶点序列T1-T4；
根据所述sgRNA靶点序列T1-T4，分别合成含粘性末端的sgRNA靶点序列核苷酸片段及其互补链，经混合退火，得到两端含所述粘性末端的双链DNA T1-T4；
将所述双链DNA T1-T4分别与所述CRISPR/Cas9基因编辑载体进行连接处理，得到基因编辑载体T1-T4；
将所述基因编辑载体T1-T4中的至少一种对所述花生胚性愈伤组织进行基因转化，经培养，得到所述花生突变体；
其中，所述sgRNA靶点序列T1-T4的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1-4所示，所述花生去饱和脂肪酸酶基因AhFAD2A的编码区序列如SEQ ID NO:5所示。
2.根据权利要求1所述花生突变体的制备方法，其特征在于，所述花生去饱和脂肪酸酶基因AhFAD2A的编码区序列是以花生去饱和脂肪酸酶基因FadS为模板，通过扩增引物进行PCR扩增得到，所述扩增引物包括正向扩增引物和反向扩增引物，所述正向扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示，所述反向扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。
3.根据权利要求2所述花生突变体的制备方法，其特征在于，所述扩增引物进行PCR扩增的步骤中，每50μl所述PCR扩增的反应体系包括双蒸水13μl、所述扩增引物5μl、所述花生去饱和脂肪酸酶基因AhFAD2A 5μl、2×Taq mix25μl、Mg2+1μl和甘油1μl。
4.根据权利要求2所述花生突变体的制备方法，其特征在于，所述扩增引物进行PCR扩增的步骤中，所述PCR扩增的反应条件是：先95℃预变性5min，然后以95℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸1min为一个循环，循环40次后，72℃完全延伸10min。
5.根据权利要求1-4任一项所述花生突变体的制备方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9基因编辑载体为pKSE401双元载体。
6.根据权利要求1-4任一项所述花生突变体的制备方法，其特征在于，所述粘性末端为BsaI限制性内切酶粘性末端。
7.一种花生突变基因，其特征在于，所述花生突变基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
8.权利要求7所述花生突变基因编码的蛋白质，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDNO:9所示。
9.权利要求1-6任一项所述花生突变体的制备方法制备得到的花生突变体、权利要求7所述的花生突变基因及其编码的蛋白质在高油酸花生品种选育中的应用。
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