CN111943828A - 一种壳二孢氯素类化合物及其在制备抗肿瘤药物或二氢乳清酸脱氢酶抑制剂药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供壳一种二孢氯素类化合物及其在制备抗肿瘤药物或二氢乳清酸脱氢酶抑制剂药物中的应用，涉及海洋天然产物领域。公开一种壳二孢氯素类化合物，其结构式如式(Ⅰ)所示，该化合物的环己醇片段上具有罕见的偕二甲基及环外双键，且具有广谱显著的肿瘤细胞增殖抑制活性和二氢乳清酸脱氢酶抑制活性，因此是开发成为结构新颖、活性高效的抗肿瘤药物或二氢乳清酸脱氢酶抑制剂药物的理想侯选化合物。

Description

一种壳二孢氯素类化合物及其在制备抗肿瘤药物或二氢乳清 酸脱氢酶抑制剂药物中的应用
技术领域
本发明涉及海洋天然产物领域，具体涉及一种壳二孢氯素类化合物及其在制备抗肿瘤药物或二氢乳清酸脱氢酶抑制剂药物中的应用。
背景技术
恶性肿瘤仍然是全球发病率和死亡率极高的非传播性疾病，严重威胁人类生命健康。天然产物是药物研发的重要源泉。据报道，1981年到2019年间，天然产物来源的抗肿瘤药物占上市抗肿瘤药物的75％以上。海洋微生物资源丰富，是发现新颖活性代谢产物的新理想资源。
二氢乳清酸脱氢酶(dihydroorotate dehydrogenase，DHODH)是存在于线粒体内膜的一种含铁的黄素依赖酶，催化嘧啶核苷酸从头合成途径的第4步关键反应，对于细胞代谢和细胞增殖至关重要。细胞内的嘧啶核苷酸主要来自于从头合成和补救合成途径，其中人源二氢乳清酸脱氢酶(hDHODH)抑制剂通过阻断嘧啶核苷酸的从头合成过程来阻止DNA复制的S期，进而抑制恶性增殖的肿瘤细胞的生长，逆转肿瘤的异质性。近年来的研究表明，DHODH与多种肿瘤的发生、发展密切相关，抑制或下调DHODH可以降低肿瘤细胞增殖，诱导其凋亡或者增加其他靶点药物的抗肿瘤效果，是潜在的肿瘤治疗靶点。
壳二孢氯素类(ascochlorins)化合物是真菌来源的抗生素，目前已发现不到50个ascochlorin类天然产物。壳二孢氯素类报道有抗氧化、抗菌等活性，对部分肿瘤细胞也有抑制活性，但是作用机制研究非常薄弱，抗肿瘤潜力有待进一步挖掘。
发明内容
本发明的第一个目的是，针对上述问题，提供一种壳二孢氯素类化合物。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种壳二孢氯素类化合物，其结构式如式(Ⅰ)所示，将其命名为acremochlorin A：
Figure BDA0002642476140000021
本发明的第二个目的是，针对上述问题，提供一种用于制备所述的壳二孢氯素类化合物的菌核生枝顶孢霉(Acremonium sclerotigenum)GXIMD 02501，保藏编号为：GDMCCNo.60670。
本发明的第三个目的是，针对上述问题，提供一种生产所述的壳二孢氯素类化合物的制备方法，所述壳二孢氯素类化合物是从菌核生枝顶孢霉(Acremoniumsclerotigenum)GXIMD 02501的发酵培养物中制备分离得到的。
优选的，所述的壳二孢氯素类化合物的制备方法，包括以下步骤：
S1.制备菌核生枝顶孢霉(Acremonium sclerotigenum)GXIMD 02501的发酵培养物，用乙酸乙酯浸泡发酵培养物，将发酵物切成小块，超声提取15min，用布氏漏斗过滤，滤液经蒸馏浓缩后得到浸膏A；滤渣继续用乙酸乙酯提取3遍，经蒸馏浓缩后得到浸膏B；
S2.将浸膏A和浸膏B合并的粗提物经中压正相液相色谱，用石油醚/二氯甲烷作为洗脱剂，从体积比(100：0)～(0：100)进行梯度洗脱，收集石油醚/二氯甲烷体积比70：30梯度洗脱下来的流份，继续过中压反相C18柱色谱，用甲醇/水作为洗脱剂，从体积比(10：90)～(100：0)进行梯度洗脱，收集甲醇/水体积比85：15梯度洗脱下来的流份，收集流份再经纯化后得到壳二孢氯素类化合物。
优选的，所述的步骤S1的制备菌核生枝顶孢霉(Acremonium sclerotigenum)GXIMD 02501的发酵培养物是将活化的菌核生枝顶孢霉(Acremonium sclerotigenum)GXIMD 02501接入种子培养基中，25℃，180rpm，培养72h制得种子液，将种子液以5％的接种量接入到发酵培养基中，25℃，静态培养30天制得发酵培养物。
优选的，所述的种子培养基配方为每1L培养基中含有：麦芽提取粉15g，粗海盐20g，余量为水，pH7.5；所述的发酵培养基的配方为每1L三角瓶培养基中含有：大米120g，细菌学蛋白胨1.5g，粗海盐3g，水150mL，pH7.5。
本发明的第四个目的是，针对上述问题，提供一种所述的壳二孢氯素类化合物在制备抗肿瘤药物或二氢乳清酸脱氢酶抑制剂药物中的应用。
优选的，所述抗肿瘤药物或二氢乳清酸脱氢酶抑制剂药物，包括有效量的壳二孢氯素类化合物或其药用盐，和药学上可以接受的载体。
优选的，所述抗肿瘤药物为抗人乳腺癌、人胃癌、人胃腺癌、人前列腺癌、人骨肉瘤癌或人早幼粒急性白血病的药物。
优选的，所述抗肿瘤药物为抗人乳腺癌、人胃癌、人胃腺癌、人早幼粒急性白血病的药物。
由于采用上述技术方案，本发明具有以下有益效果：
1.本发明在对广西北部湾鹿角杯形珊瑚(Pocillopora damicornis)共附生菌核生枝顶孢霉(Acremonium sclerotigenum)GXIMD02501的次生代谢产物的研究过程中，分离获得一个新颖骨架的壳二孢氯素类化合物，该化合物的环己醇片段上具有罕见的偕二甲基及环外双键，且具有广谱显著的肿瘤细胞增殖抑制活性和二氢乳清酸脱氢酶抑制活性，诱导乳腺癌细胞MDA-MB-231和MDA-MB-468凋亡，显著抑制PDX模型小鼠乳腺肿瘤的生长，因此是开发成为结构新颖、活性高效的抗肿瘤药物或二氢乳清酸脱氢酶抑制剂药物的理想侯选化合物。
2.本发明的菌核生枝顶孢霉(Acremonium sclerotigenum)GXIMD02501，于2019年05月20日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市先烈中路100号广东省微生物研究所59号楼五楼，广东省微生物研究所，保藏编号为：GDMCC No.60670。
附图说明
图1是壳二孢氯素类化合物acremochlorin A的化学结构及其关键的HMBC(箭头)、1H–1H COSY(加粗黑线)和NOESY(虚线双箭头)相关；其中A为化合物acremochlorin A的化学结构说明，B为HMBC、1H–1H COSY和NOESY关键相关说明；
图2是壳二孢氯素类化合物acremochlorin A的铜靶单晶衍射示意图；
图3是壳二孢氯素类化合物acremochlorin A的实测和计算ECD图谱；
图4是壳二孢氯素类化合物acremochlorin A与二氢乳清酸脱氢酶(DHODH)的分子对接图；
图5是化合物壳二孢氯素类化合物acremochlorin A和壳二孢氯素ascofuranone对乳腺癌细胞MDA-MB-231和MDA-MB-468的细胞活力及添加200μM Uridine的细胞活力图；
图6是壳二孢氯素类化合物acremochlorin A对乳腺癌细胞MDA-MB-231和MDA-MB-468的细胞凋亡图；
图7是壳二孢氯素类化合物acremochlorin A对乳腺癌细胞MDA-MB-231和MDA-MB-468的免疫印迹(WesternBlot)实验图；
图8是壳二孢氯素类化合物acremochlorin A对PDX模型小鼠乳腺肿瘤生长的抑制图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例和附图，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1菌核生枝顶孢霉(Acremonium sclerotigenum)GXIMD02501
从采自中国广西北部湾鹿角杯形珊瑚共附生菌分离得到菌核生枝顶孢霉(Acremonium sclerotigenum)GXIMD 02501，于2019年05月20日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市先烈中路100号广东省微生物研究所59号楼五楼，广东省微生物研究所，保藏编号为：GDMCC No.60670。
实施例2壳二孢氯素类化合物acremochlorin A的制备和分离
1、培养基
1.1、种子培养基：每1L升培养基中含有麦芽提取粉15g，粗海盐20g，余量为水，pH7.5。按上述组份和含量混合均匀，然后121℃，灭菌30min备用。
1.2、发酵培养基：每1L三角瓶培养基中含有：大米120g，细菌学蛋白胨1.5g，粗海盐3g，水150mL，pH7.5。按上述组份和含量混合均匀，然后121℃，灭菌30min备用。
2、发酵
2.1、种子培养：将活化的菌核生枝顶孢霉(Acremonium sclerotigenum)GXIMD02501接入每瓶含有300mL种子培养基的1L的三角培养瓶中，25℃，180rpm，培养72h制得种子液。
2.2、发酵培养：将种子液以5％的接种量(体积百分比)接入到48瓶发酵培养基三角瓶中，25℃，静态培养30d，制得发酵培养物。
3、提取：用乙酸乙酯浸泡发酵培养物，将发酵培养物切成小块，超声破碎提取15min，采用布氏漏斗过滤，滤液经蒸馏浓缩后得到浸膏A；滤渣继续用乙酸乙酯提取3遍，经蒸馏浓缩后得到浸膏B，合并浸膏A和浸膏B得总提取物(100g)。
4、化合物acremochlorin A的分离纯化
将浸膏A和浸膏B合并的粗提物(100g)经中压正相柱层析液相色谱(MPLC)，用石油醚/二氯甲烷作为洗脱剂，从体积比100：0～0：100进行梯度洗脱，收集石油醚/二氯甲烷体积比为70：30洗脱的流份(2.5g)，继续过中压反相C18柱色谱，用甲醇/水作为洗脱剂，从体积比10：90～100：0进行梯度洗脱，收集甲醇/水体积比85：15梯度洗脱下来的流份，收集流份采用HPLC-DAD检测收集最大吸收波长在225和295nm吸收的流份，该流份最后用半制备高效液相精细分离，在洗脱体系为乙腈/水(体积比80：20，YMC-pack ODS-A色谱柱,10×250mm,5μm,2mL/min)进行纯化后得到壳二孢氯素类化合物，命名为acremochlorin A(40mg，保留时间是36min)。
实施例3壳二孢氯素类化合物acremochlorin A的结构鉴定
壳二孢氯素类化合物acremochlorin A为无色针状晶体，其核磁数据归属如表1所示；其高分辨质谱HRESIMS给出一个准分子离子峰m/z407.1968[M+H]+(calcd forC23H32ClO4,407.1989)确定其分子式为C23H31ClO4，含8个不饱和度。1HNMR谱图显示1个酚羟基2-OH(δH12.89,s)，1个醛基(δH10.17,s)，3个烯烃质子H-10(δH5.20,t,J＝7.0Hz)和末端亚甲基H2-21(δH4.79,s,H-21a；4.53,s,H-21b)，1个连氧次甲基H-18(δH3.27,overlapped)和1个次甲基H-14(δH1.63,m)，5个亚甲基H2-9(δH3.36–3.40,d,J＝7.0Hz)，H2-12(δH2.04,m；1.79,m)，H2-13(δH1.61,m)，H2-16(δH2.25,m；1.82,m)和H2-17(δH1.73,m；1.44,m)，以及4个单峰甲基，分别为H3-7(δH2.63)，H3-20(δH0.96)，H3-22(δH0.69)和H3-23(δH1.77)。13CNMR和DEPT 135谱图显示除了以上14个连氢的碳信号以外，还剩下8个芳香或烯烃季碳信号[(δC114.0,114.7,115.6,136.4,139.2,149.2)，含2个连氧芳香季碳(δC162.8,159.2)]，和1个季碳(δC41.1)。以上核磁数据分析推测acremochlorin A为一个壳二孢氯素类衍生物，其化学结构与文献报道的ilicicolin C[农药学学报2017,19,(04),457–464.]的结构比较相似。
表1.核磁数据归属
Figure BDA0002642476140000051
Figure BDA0002642476140000061
表1.acremochlorin A的1H-(700MHz)和13C-(175MHz)NMR数据归属，溶剂为acetone-d6。同化合物ilicicolin C的核磁数据进行对比发现，化合物acremochlorin A中C-18变为连羟基的次甲基(δH/C3.27/76.8)，C-15(δC149.2)与C-21(δH/C4.79,4.53/108.2)间形成环外双键，另外Me-20由14位迁移至19位，以上推断通过HMBC谱图中H3-20/C-14,C-18,C-19，H3-22/C-14,C-18,C-19，H-14/C-16,C-19,C-21，H2-16/C-21相关以及COSY谱图中H2-16/H2-17/H-19相关等信号加以证实。通过NOESY谱图信号确定化合物acremochlorin A的相对构型，NOESY谱图中H-8/H3-7，H-9/H3-23，H-10/H2-12，H-14/H-18，H-18/H3-20，H-21b/H2-16，H-21a/H-14等系列相关信号说明C-10处的碳碳双键为E式构型，H-14，H3-20与H-18位于环己烷环的同一侧。另外8位醛基氢位于7位甲基侧，环己烷环外烯烃质子H-21a与C-14同侧而H-21b与C-16同侧。化合物acremochlorinA的关键HMBC、COSY和NOESY相关信息见图1。化合物acremochlorinA的绝对构型主要通过X-ray单晶衍射分析和ECD计算方法确定的，通过铜靶X-ray单晶衍射的方法，不仅验证了新颖化合物acremochlorin A的平面结构，而且确定了新颖化合物acremochlorin A的绝对构型为14R,18S，同时经ECD计算结果加以证实，确定化合物acremochlorin A的结构式如式(Ⅰ)所示。化合物acremochlorin A的X-射线单晶衍射图见图2，其实测和计算ECD图谱见图3。
化合物acremochlorin A：无色针状晶体；
Figure BDA0002642476140000062
UV(MeOH)λmax(logε)291(3.76),227(3.95),200(4.09)nm；ECD(0.20mg/mL,MeOH)λmax(Δε)257(-0.39),201(+5.24)；IR(film)νmax3365,1716,1683,1653,1616,1558,1541,1506,1456,1417,1205cm-1；HR-ESIMSm/z407.1968[M+H]+(calcdforC23H32ClO4,407.1989)
实施例4壳二孢氯素类化合物acremochlorin A的肿瘤细胞增殖抑制活性
实验细胞株：采用MDA-MB-231(人乳腺癌细胞)、MDA-MB-468(人乳腺癌细胞)、MGC-803(人胃癌细胞)、AGS(人胃腺癌细胞)、C4-2B(人前列腺癌细胞)、143B(人骨肉瘤细胞)和HL60(人早幼粒急性白血病细胞)等作为实验细胞株。
实验方法：肿瘤细胞增殖抑制实验方法参考文献(J.Nat.Prod.2018,81,(4),934-941.)。
实验组别：以同类型天然产物壳二孢呋喃酮(ascofuranone)和壳二孢氯素(ascochlorin)作为阳性对照。
实验结果：化合物acremochlorin A对以上肿瘤细胞增殖的半抑制浓度为0.29–6.15μM(见表2)。
表2.化合物acremochlorinA对人源肿瘤细胞增殖的抑制活性(IC50:μM)
Figure BDA0002642476140000071
结果讨论：研究发现化合物acremochlorin A对肿瘤细胞增殖抑制活性显著强于化合物ascofuranone和ascochlorin，尤其是对MDA-MB-231、MDA-MB-468和HL60细胞。且化合物acremochlorinA对上述肿瘤细胞抑制活性的IC50值均小于3μM(C4-2B细胞除外)，可以作为抗肿瘤药物先导化合物开发，因此提示其能够被改构用于制备抗肿瘤新药。
实施例5壳二孢氯素类化合物acremochlorin A的二氢乳清酸脱氢酶抑制活性测定
实验方法：二氢乳清酸脱氢酶抑制活性测试方法参考文献(European Journal ofPharmacology 2016,791,205–212.)。采用改进的Ellman法测试化合物acremochlorin A对二氢乳清酸脱氢酶的抑制活性。
实验组别：以二氢乳清酸脱氢酶抑制剂药物特立氟胺(teriflunomide)和同类型天然产物ascofuranone和ascochlorin为阳性对照。
实验结果：化合物acremochlorinA对二氢乳清酸脱氢酶(DHODH)抑制活性见表3。
表3.化合物acremochlorin A及阳性对照对二氢乳清酸脱氢酶(DHODH)抑制活性(IC50:μM)
Figure BDA0002642476140000081
结果讨论：化合物acremochlorin A对二氢乳清酸脱氢酶的抑制活性IC50值为73.7nM，活性强于阳性药特立氟胺(IC50＝1.10μM)的近15倍，强于壳二孢呋喃酮(IC50＝5.45μM)的近74倍，强于壳二孢氯素(IC50＝1.346μM)的近18倍。可以作为抗二氢乳清酸脱氢酶化合物开发，因此提示其能够被改构用于制备抗二氢乳清酸脱氢酶新药。
实施例6壳二孢氯素类化合物acremochlorin A抗乳腺癌的作用机制研究
运用AUTODOCK对接与PyMOL观测程序对acremochlorin A与DHODH(PDB code:5ZF4)进行了分子对接，结果如图4所示。分子对接研究表明，在DHODH的复合体中，acremochlorin A的2位羟基与DHODH活性口袋里的Gln47，Arg136等氨基酸残基通过氢键作用结合，另外倍半萜片段通过疏水作用与Phe62，Leu359，Leu46，Leu58等氨基酸残基结合，对接能为–9.14Kcal/Kj。上述分析提示acremochlorin A是一种良好的二氢乳清酸脱氢酶抑制剂。
二氢乳清酸脱氢酶是嘧啶核苷酸从头合成的关键酶。化合物acremochlorin A和ascofuranone均能显著抑制MDA-MB-231和MDA-MB-468乳腺癌细胞增殖，通过在含化合物acremochlorin A和ascofuranone的MDA-MB-231和MDA-MB-468乳腺癌细胞培养液中，回补添加尿苷(Uridine)发现乳腺癌细胞基本能正常生长，说明化合物acremochlorin A和ascofuranone通过抑制二氢乳清酸脱氢酶活性，从而抑制乳腺癌细胞的增殖。化合物acremochlorinA和ascofuranone对乳腺癌细胞MDA-MB-231和MDA-MB-468的细胞活力及添加200μMUridine的细胞活力图如图5。
实施例7壳二孢氯素类化合物acremochlorinA小鼠乳腺肿瘤生长的抑制
实验样品：将每只小鼠大腿两侧皮下分别移植1mm3PDX肿瘤组织块(购自Jackson公司)，当肿瘤体积达到50mm3时，将16只小鼠随机分成2组，每组8只。肿瘤体积的计算公式为长径
Figure BDA0002642476140000082
实验组别及给药设置：对照组，每天腹腔注射100μL的安慰剂；给药组，每天腹腔注射100μL的化合物acremochlorin A溶液，剂量为5mg/kg。每3天记录肿瘤体积大小，及小鼠体重。待对照组小鼠肿瘤体积超过1000mm3，将小鼠给予安乐死，进行后续实验。
实验方法：乳腺癌细胞凋亡实验方法参考文献(J.Nat.Prod.2018,81,(4),934-941.)。
实验结果：通过实验发现化合物acremochlorin A通过抑制二氢乳清酸脱氢酶，提高MDA-MB-231和MDA-MB-468等人乳腺癌细胞中凋亡相关蛋白PARP1和caspase7的水平，诱导MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞凋亡，同时显著抑制PDX模型小鼠乳腺肿瘤的生长，因此可望开发成为机制新颖的抗乳腺癌新药。化合物acremochlorin A诱导MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞凋亡图见图6，其Western Blot图见图7，抑制PDX模型小鼠乳腺肿瘤生长图见图8。
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围。凡本发明所提示的技术构思下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。

Claims (10)

1.一种壳二孢氯素类化合物，其特征在于，其结构式如式(Ⅰ)所示：
Figure FDA0002642476130000011
2.一种用于制备权利要求1所述的壳二孢氯素类化合物的菌核生枝顶孢霉(Acremonium sclerotigenum)GXIMD 02501，保藏编号为：GDMCC No.60670。
3.一种如权利要求1所述的壳二孢氯素类化合物的制备方法，其特征在于，所述壳二孢氯素类化合物是从菌核生枝顶孢霉(Acremonium sclerotigenum)GXIMD 02501的发酵培养物中制备分离得到的。
4.根据权利要求3所述的壳二孢氯素类化合物的制备方法，包括以下步骤：
S1.制备菌核生枝顶孢霉(Acremonium sclerotigenum)GXIMD 02501的发酵培养物，用乙酸乙酯浸泡发酵培养物，将发酵物切成小块，超声提取15min，用布氏漏斗过滤，滤液经蒸馏浓缩后得到浸膏A；滤渣继续用乙酸乙酯提取3遍，经蒸馏浓缩后得到浸膏B；
S2.将浸膏A和浸膏B合并的粗提物经中压正相液相色谱，用石油醚/二氯甲烷作为洗脱剂，从体积比(100：0)～(0：100)进行梯度洗脱，收集石油醚/二氯甲烷体积比70：30梯度洗脱下来的流份，继续过中压反相C18柱色谱，用甲醇/水作为洗脱剂，从体积比(10：90)～(100：0)进行梯度洗脱，收集甲醇/水体积比85：15梯度洗脱下来的流份，收集流份再经纯化后得到该壳二孢氯素类化合物。
5.根据权利要求4所述的壳二孢氯素类化合物的制备方法，其特征在于，所述的步骤S1的制备菌核生枝顶孢霉(Acremonium sclerotigenum)GXIMD 02501的发酵培养物是将活化的菌核生枝顶孢霉(Acremonium sclerotigenum)GXIMD 02501接入种子培养基中，25℃，180rpm，培养72h制得种子液，将种子液以5％的接种量接入到发酵培养基中，25℃，静态培养30天制得发酵培养物。
6.根据权利要求5所述的壳二孢氯素类化合物的制备方法，其特征在于，所述的种子培养基配方为每1L培养基中含有：麦芽提取粉15g，粗海盐20g，余量为水，pH 7.5；所述的发酵培养基的配方为每1L三角瓶培养基中含有：大米120g，细菌学蛋白胨1.5g，粗海盐3g，水150mL，pH 7.5。
7.权利要求1所述的壳二孢氯素类化合物在制备抗肿瘤药物或二氢乳清酸脱氢酶抑制剂药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物或二氢乳清酸脱氢酶抑制剂药物，包括有效量的壳二孢氯素类化合物或其药用盐，和药学上可以接受的载体。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物为抗人乳腺癌、人胃癌、人胃腺癌、人前列腺癌、人骨肉瘤癌或人早幼粒急性白血病的药物。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物为抗人乳腺癌、人胃癌、人胃腺癌或人早幼粒急性白血病的药物。
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