CN111929435A - 提高胶乳免疫比浊法稳定性的胶乳微球、制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及高分子微球材料技术领域,具体公开了一种提高胶乳免疫比浊法稳定性的胶乳微球的制备方法,包括将含有氯氧基的对4‑氯甲氧基苯乙烯作为原料混合,通入氮气搅拌预乳化后,加入过硫酸钾,升温,继续搅拌反应,得到所述胶乳微球的悬浮液;滴加氯化锂水溶液破乳,减压抽滤,洗涤,离心得到胶乳微球。在聚合原料选择中添加带有氯甲氧基的苯乙烯衍生物能够提高其聚合转化率,降低胶乳微球的水化直径和表明负电荷,从而提高微球的稳定性。本发明提供的胶乳微球制备的胶乳试剂,在免疫比浊检测时的效果更佳,稳定性更优。
Description
技术领域
本发明涉及高分子微球材料技术领域,具体涉及一种提高胶乳免疫比浊法稳定性的胶乳微球、制备方法及应用。
背景技术
目前,胶乳增强免疫比浊法可广泛应用于特种蛋白、肿瘤标志物等方面的检测,是极具开发前景的新一代实用免疫测定技术。市场上常有的胶乳增强免疫比浊法的体外诊断生化产品主要有CysC、RBP、β2-MG、Lp(a)、hsCRP、ASO、RF等检测试剂盒。
胶乳试剂是液体,它的各项性能指标对其稳定性具有较高的要求,这也是胶乳试剂开发的一个重点和难点。胶乳试剂的稳定性主要包含两个方面,一方面是胶乳微球的稳定性,一方面是连接在胶乳微球上的抗体或抗原的稳定性。胶乳溶液它是一个高度分散的多相体系,有巨大的界面能,因而是热力学不稳定体系,但在一定条件下又能相对稳定地存在相当长的时间;连接在胶乳微球上的抗体或抗原的稳定性,主要包含抗体或抗原本身的稳定性和抗体或抗原能否稳定地连接在胶乳微球上。
对比文件CN110836965A中公开了一种液态芯片的封闭液及其方法,所述的封闭液包括:磷酸缓冲液、蛋白、氨基酸、表活活性剂和防腐剂,可以减少非特异性结合、提高灵敏度和精密度,但是该文献中封闭剂不完全适用于胶乳免疫比浊法;对比文件CN101046473A中公开了一种改进胶乳结合抗原或抗体稳定性的方法,所述的方法是向试剂中加入封闭剂和稳定性,该方法可以让试剂在长期储存中的试剂吸光度值变化小,但是此方法制备的试剂会随着时间的延长,灵敏度、准确度和精密度的性能逐步降低。
发明内容
在现有技术中均未公开对胶乳微球稳定性的改进技术,而胶乳微球的稳定性对于提高整个胶乳试剂稳定性和胶乳免疫比浊检测稳定性均起到决定性作用。为实现上述目的,本发明是通过以下技术方案予以实现的:
一种提高胶乳免疫比浊法稳定性的胶乳微球的制备方法,包括如下步骤:
S1:将十二烷基苯磺酸钠、氢氧化钠、对4-氯甲氧基苯乙烯、苯乙烯和水混合得到料液A,按重量分数计,所述各成份在原材料中的配比为,苯乙烯:对4-氯甲氧基苯乙烯:十二烷基苯磺酸钠:氢氧化钠:水=(15~20):(10~15):(10~15):(55~65);
S2:通入氮气搅拌预乳化30min后,加入过硫酸钾,升温60℃,继续通氮气搅拌反应6~8h,得到所述胶乳微球的悬浮液;
S3:向所述悬浮液中滴加10%的氯化锂水溶液破乳,破乳后的悬浮液减压抽滤,得到的胶乳微球颗粒用蒸馏水和乙醇交替洗涤,离心后得到最终产品的所述胶乳微球。
一种提高胶乳免疫比浊法稳定性的胶乳微球。
一种胶乳微球在提高胶乳免疫比浊法稳定性中的应用。
与现有技术相比,本发明的有益效果包括:
1、在聚合原料选择中添加带有氯甲氧基的苯乙烯衍生物能够提高其聚合转化率,聚合更彻底,微球均一性也得到提高。本发明提供的胶乳微球形成了大量的氯甲氧基支链,负电荷增多,能够提高其与抗体蛋白偶联形成的免疫胶乳的电泳速率,从而提高其稳定性;并且,大量的氯甲氧基支链分布也能减少其产生桥絮凝效应的机会,降低胶乳微球的水化直径,从而提高微球的稳定性。
2、进一步通过将本发明提供的胶乳微球制备胶乳试剂,检测肌红蛋白,结果表明,本发明提供的胶乳微球制备的胶乳试剂,在免疫比浊检测时的效果更佳;本发明提供的胶乳微球制备的胶乳试剂的稳定性更优。
附图说明
图1是本发明实施例提供的胶乳试剂的免疫比浊检测中空白吸光度稳定性图。
图2是本发明实施例提供的胶乳试剂的免疫比浊检测中灵敏度稳定性图。
图3是本发明实施例提供的胶乳试剂的免疫比浊检测中准确度稳定性图。
图4是本发明实施例提供的胶乳试剂的免疫比浊检测中精密度稳定性图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
主要试剂:苯乙烯(分析纯,购自国药集团化学试剂有限公司);对4-氯甲氧基苯乙烯(分析纯,美国ACROS公司);十二烷基苯磺酸钠(分析纯,国药集团化学试剂有限公司)、氢氧化钠(分析纯,国药集团化学试剂有限公司)、过硫酸钾(分析纯,国药集团化学试剂有限公司)、氯化锂(分析纯,国药集团化学试剂有限公司)。
胶乳微球的制备
本发明提供一种提高胶乳免疫比浊法稳定性的胶乳微球的制备方法,包括如下步骤:
S1:将十二烷基苯磺酸钠、氢氧化钠、对4-氯甲氧基苯乙烯、苯乙烯和水混合得到料液A,按重量分数计,所述各成份在原材料中的配比为,苯乙烯:对4-氯甲氧基苯乙烯:十二烷基苯磺酸钠:氢氧化钠:水=(15~20):(10~15):(10~15):(55~65);
S2:通入氮气搅拌预乳化30min后,加入过硫酸钾,升温60℃,继续通氮气搅拌反应6~8h,得到所述胶乳微球的悬浮液;
S3:向所述悬浮液中滴加10%的氯化锂水溶液破乳,破乳后的悬浮液减压抽滤,得到的胶乳微球颗粒用蒸馏水和乙醇交替洗涤,离心后得到最终产品的所述胶乳微球。
本发明提供的胶乳微球的制备原料中,对4-氯甲氧基苯乙烯聚功能基团氯甲氧基,为胶乳微球自身带来高均一性,降低其聚集成团的可能,为微球粒径控制和提高其制备过程中的转化率;还能为胶乳微球表面带来氯原子、氧原子,使其能够更易于与抗原或抗体的活性基团形成稳定的共价键或氢键,进而提高其应用于免疫比浊检测中的稳定性和特异性灵敏度。
具体的实施方式中,S1步骤中,先将十二烷基苯磺酸钠和氢氧化钠溶于水并混合均匀后,再加入苯乙烯和对4-氯甲氧基苯乙烯。
具体的实施方式中,所述各成份在原材料中的配比为,苯乙烯:对4-氯甲氧基苯乙烯:十二烷基苯磺酸钠:氢氧化钠:水=(15~20):(10~15):(10~15):(55~65),可在此范围中选取,举例如15:10:15:65、18:12:12:65、20:15:10:65、18:10:12:60、18:12:10:60、18:12:10:60、20:10:15:55、20:12:12:55或20:15:10:55。
具体的实施方式中,S2步骤中,过硫酸钾加入的质量占所述料液A的体积的百分数为1~5%,可在此范围内任意选取,举例可为1%、1.5%、2%、3%、4%或5%。
具体的实施方式中,S3步骤中,10%的氯化锂水溶液加入的体积占所述悬浮液的体积的百分数为10~15%,可在此范围内任意选取,举例可为10%、11%、12%、13%、13.3%、13.6%、13.7%、14%或15%。
为对胶乳微球的制备过程进行研究,需考察其制备过程中原料的加入顺序(记为A,其中,苯乙烯和对4-氯甲氧基苯乙烯与其他原料共同加入记为A1,后加入记为A2),苯乙烯:对4-氯甲氧基苯乙烯:十二烷基苯磺酸钠:氢氧化钠:水的质量配比(记为B),过硫酸钾加入量(记为C),10%的氯化锂水溶液加入量(记为D),具体的各指标考察数值列入表1,包括实施例1-25和对比例1-2。对比例1为原料仅采用苯乙烯,制备步骤及其他条件均同实施例25。对比例2将实施例25原料中的4-氯甲氧基苯乙烯替换成甲基苯乙烯,制备步骤及其他条件均同实施例25。对比例3将实施例25原料中的4-氯甲氧基苯乙烯替换成对氯甲基苯乙烯,制备步骤及其他条件均同实施例25。对比例2为胶乳微球为纳微公司产品。
表1
胶乳微球的制备分析
为对上述实施例的胶乳微球制备过程进行分析和测试,下方的实施例提供聚合转化率、结构和形态测定,具体考察了聚合过程的转化率、微球的PDI、微球DLS稳定性分析和Zeta电位分析。
聚合过程的转化率的测定方法如下:
共聚微球的转化率通过称重法计算,定时从反应体系中取出2g左右乳液置于已称重的干燥培养皿中,120℃真空干燥至质量恒定。转化率=[(M2/M1)-M3]/M4。其中,M1为乳液质量,M2为烘干物质量,M3为原料配方中不挥发组分的质量百分数,M4为原料配方中单体质量百分数。所有质量均采用精密度为0.01mg的电子分析天平精确称量。
微球DLS稳定性分析:在Malvern公司的Zatasizer Nano ZS仪器上完成。用0.01mol/L PBS将胶乳微球浓度调整至0.02mg/mL。
Zeta电位分析:在Malvern公司的Zatasizer Nano ZS仪器上完成。用HCl或NaOH溶液调整体系pH值范围为3.0~9.0,用0.01mol/L PBS胶乳微球浓度调整为0.02mg/mL。
结果列入表2。
表2
由表2可知:
1、实施例1-4,其在聚合过程的转化率高于对比例1-3,其微球的PDI值小于对比例1-4,其微球DLS稳定性分析的微球的水化直径小于对比例1-4,其Zeta电位小于对比例1-4。这说明,在聚合原料选择中添加带有氯甲氧基的苯乙烯衍生物能够提高其聚合转化率,聚合更彻底,微球均一性也得到提高。胶乳微球的稳定性与其水化直径有关,水化直径越小,胶乳微球越稳定,其絮凝聚集可能性越低;另外,胶乳微球表面的聚合支链分布越多,也能减少其产生桥絮凝效应的机会,从而提高微球的稳定性。由此说明,实施例1-4微球的稳定性效果均优于对比例1-4。实施例1-4的Zeta电位均小于对比例1-4,说明其微球表面的负电荷分布较多,这也是尤其表面分布大量的聚合支链造成的,如其微球表面形成了大量的氯甲氧基支链,而负电荷增多,能够提高其与抗体蛋白偶联形成的免疫胶乳的电泳速率,从而提高其稳定性。
2、实施例5-9相对于实施例1-4,其转化率提高,其水化直径和Zeta电位降低,说明实施例5-9聚合原料的配比更合理;对比实施例10-13,可知当苯乙烯相对于4-氯甲氧基苯乙烯在原料中的配比提高时,其能够提高最终转化率,并降低水化直径和Zeta电位。
3、实施例16相对于实施例5-9,其原料中用水量加大,使得其水化直径减小。而实施例17相对于实施例16,在原料加料顺序过程中发生变化,使得其转化率进一步提升,其水花直径进一步减小。
4、实施例18-20相对于实施例17,进一步优化了制备过程中加入过硫酸钾的比例,其制备的胶乳微球转化率有提升,而其水化直径显著降低。
5、实施例21-24相对于实施例17,进一步优化了制备过程中加入10%氯化锂的量,其制备的胶乳微球的水化直径和Zeta电位均有降低。
6、而实施例25相对实施例1-24,其聚合过程的转化率、微球PDI、微球的水化直径和Zeta电位均达到最优。
胶乳微球在提高胶乳免疫比浊法稳定性中的应用
1、试剂配制
(1)溶液配制:
a.活化缓冲液:0.01M-0.2M的MES或者HEPES或者硼酸,调节pH至5.0-7.0。
b.偶联缓冲液:0.01M-0.2M的MES或者HEPES或者硼酸,调节pH至7.0-8.0。
c.封闭液:0.1M-2M的缓冲液(TRIS或者甘氨酸),10%-20%的BSA,0.1-5%的表面活性剂(Triton X-100或者吐温-20),调节pH至7.0-8.5;
d.保存液:25-50mM的HEPES,0.5g/L的EDTA-2NA,5%蔗糖,0.1%PC-300,调节pH至7.0-7.5。
2、胶乳试剂标记工艺
a.取150nm-200nm粒径的胶乳微球10mL与活化缓冲液(溶液a)按体积比1:3进行混合后混匀;
b.向a步骤中加入10-20mg的活化剂EDC,混匀,温度控制在:30-37℃,活化反应时间:20-30min;
c.用偶联缓冲液(溶液b)把抗原/抗体稀释至1mg/mL,向b步骤中加入30mg的稀释后肌红蛋白抗体,混匀,温度控制在:30-37℃,偶联反应时间:2-3h;
d.向c步骤中加入10mL的封闭液(溶液c),混匀,温度控制在:30-37℃,封闭反应时间:0.5-1h。
e.封闭完成后,于高速冷冻离心机中离心,去上清,然后加入250mL-300mL的保存液(溶液d),混匀,备用。
上述步骤中采用的胶乳微球分别采用实例施4、实施例9、实施例17、实施例19、实施例23、实施例25、对比例1、对比例2、对比例3和对比例4制备得微球。
3、评价实施方案
实验仪器:HITACHI7180/7100
肌红试剂实验参数:
性能评价方法:
分别对以上对照组和实施例进行如下测试:
(1)R2试剂性状:应为乳白色悬浊溶液,无沉淀;
(2)试剂空白吸光度:测试剂在对应波长处、10mm光径下的吸光度值;
(3)灵敏度:肌红蛋白测试200μg/L被测物时的吸光度与空白试剂测试时的差值(ΔA);
(4)准确度:测第三方质控品(血清基质),计算测定平均值与靶值的偏差,一般应<10%;
(5)精密度:重复测定同一样本10次,计算变异系数CV一般应<8%;
(6)稳定性:将试剂在2-8℃放置24个月,每6个月评价一次全性能,评价指标:R2试剂性状、试剂空白吸光度、灵敏度(%)、准确度(%)和精密度(%);
试验数据列入表3(0个月),并将各实施例在0个月、6个月、12个月、18个月和24个月上述指标的变化趋势,列入图1-图4(试剂空白吸光度、灵敏度、准确度和精密度,实施例和对比例在存放过程中均未出现沉淀)。
表3
实施项目 | R2试剂性状 | 试剂空白吸光度 | 灵敏度(%) | 准确度(%) | 精密度(%) |
实例施4 | 无沉淀 | 0.8835 | 0.1782 | 1.92 | 1.85 |
实施例9 | 无沉淀 | 0.8715 | 0.1820 | 1.9 | 1.74 |
实施例17 | 无沉淀 | 0.7153 | 0.2012 | 1.86 | 1.68 |
实施例19 | 无沉淀 | 0.6821 | 0.1923 | 1.76 | 1.65 |
实施例23 | 无沉淀 | 0.6574 | 0.2114 | 1.57 | 1.54 |
实施例25 | 无沉淀 | 0.6012 | 0.2354 | 1.46 | 1.47 |
对比例1 | 无沉淀 | 0.9211 | 0.1552 | 1.95 | 2.33 |
对比例2 | 无沉淀 | 0.9362 | 0.1521 | 2.04 | 2.36 |
对比例3 | 无沉淀 | 0.9425 | 0.1507 | 2.1 | 2.37 |
对比例4 | 无沉淀 | 0.9361 | 0.1532 | 2.04 | 2.26 |
由表3可知,几个实施例和对比例的R2试剂均在保存过程中均未出现沉淀。实施例的试剂空白吸光度至均小于对比例,说明实施例在检测时的空白干扰小于对比例。实施例的灵敏度值高于对比例,准确度值和紧密度值均低于对比例,这说明本发明提供的胶乳微球制备的胶乳试剂,在免疫比浊检测时的效果更佳。
由图1-4可知,实施例4、实施例9、实施例17、实施例19、实施例23和实施例25分别对应的胶乳试剂的稳定性均优于对比例1、对比例2、对比例3和对比例4分别对应的胶乳试剂的稳定性,说明本发明提供的胶乳微球制备的胶乳试剂的稳定性更优。
以上所述本发明的具体实施方式,并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所做出的各种其他相应的改变与变形,均应包含在本发明权利要求的保护范围内。
Claims (6)
1.一种提高胶乳免疫比浊法稳定性的胶乳微球的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
S1:将十二烷基苯磺酸钠、氢氧化钠、对4-氯甲氧基苯乙烯、苯乙烯和水混合得到料液A,按重量分数计,所述各成份在原材料中的配比为,苯乙烯:对4-氯甲氧基苯乙烯:十二烷基苯磺酸钠:氢氧化钠:水=(15~20):(10~15):(10~15):(55~65);
S2:通入氮气搅拌预乳化30min后,加入过硫酸钾,升温60℃,继续通氮气搅拌反应6~8h,得到所述胶乳微球的悬浮液;
S3:向所述悬浮液中滴加10%的氯化锂水溶液破乳,破乳后的悬浮液减压抽滤,得到的胶乳微球颗粒用蒸馏水和乙醇交替洗涤,离心后得到最终产品的所述胶乳微球。
2.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述S1步骤中,先将十二烷基苯磺酸钠和氢氧化钠溶于水并混合均匀后,再加入苯乙烯和对4-氯甲氧基苯乙烯。
3.如权利要求1或2所述的制备方法,其特征在于,所述S2步骤中,过硫酸钾加入的质量占所述料液A的体积的百分数为1~5%。
4.如权利要求1或2所述的制备方法,其特征在于,所述S3步骤中,10%的氯化锂水溶液加入的体积占所述悬浮液的体积的百分数为10~15%。
5.一种如权利要求1-4任一项所述的制备方法得到的胶乳微球。
6.一种如权利要求5所述的胶乳微球在提高胶乳免疫比浊法稳定性中的应用。
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