CN111929392A - 一种柱前衍生化分析n-(对甲苯磺酰基)-l-丙氨酰氯及其对映异构体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种柱前衍生化HPLC法分析N‑(对甲苯磺酰基)‑L‑丙氨酰氯及其对映异构体的方法，采用多糖衍生物涂覆型手性色谱柱或蛋白质键合型手性色谱柱进行分析检测。该方法能够简单、准确、高效的分析检测N‑(对甲苯磺酰基)‑L‑丙氨酰氯及其对映异构体，有效控制其质量。
Description
技术领域
本发明涉及一种色谱分析方法，尤其是一种通过柱前衍生化分析N-(对甲苯磺酰基)-L- 丙氨酰氯及其对映异构体的手性高效液相色谱法，属于分析化学领域。
技术背景
吡咯酯(化学名：3-(N-对甲苯磺酰基-L-丙氨酰氧基)-5-苯基吡咯)或吲哚酯(化学名3-(N- 对甲苯磺酰基-L-丙氨酰氧基)-吲哚)是测定白细胞的诊断试剂的常用底物，该类底物通常是通过没有旋光性的吡咯酚或吲哚酚与N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯反应后制得，因此，如何分析检测N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体，进而控制吡咯酯或吲哚酯对映异构体杂质含量，显得尤为重要。N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体结构如式(1)所示：
式1中，A：N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯；B：N-(对甲苯磺酰基)-D-丙氨酰氯；
近年来，随着手性色谱填料多样化，运用手性高效液相色谱法分析手性化合物的应用日益广泛。中国专利ZL201810561999.5公开了一种HPLC法分析及制备N-(对甲苯磺酰基) -L-丙氨酸及其对映异构体的方法，由该方法可知，可以将N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯先进行水解生成N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酸，再使用上述方法分析分离。然而，N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯通常是通过N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酸经过酰化反应制得，该化合物在制备或检测过程中，非常容易吸潮或接触水份而发生水解反应，转变为N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酸，因此，应用该方法并不能确定是N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酸没有反应完全，还是N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯的水解产物。所以，N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酸的光学纯度不能反映N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯的光学纯度，该方法不能应用于分析N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体。
在用手性固定相分离N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯过程中，该化合物分子中氯原子活泼，分子较容易发生酰化反应而损伤色谱柱，并且比较容易吸潮水解。因此，如何将N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯进行柱前衍生化，提高化合物分子的稳定性，提高色谱分析的准确性，是目前需要解决的技术问题。
本发明的目的是为了克服现有技术不足，建立一种简单的柱前衍生化分析N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体的手性高效液相色谱法，进而实现对其质量的控制。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的分析N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯的方法，采用柱前衍生的方法，用手性固定相的液相色谱法进行分析检测，进而实现对N-(对甲苯磺酰基)-L- 丙氨酰氯的质量控制。
本发明提供一种柱前衍生化HPLC法分析N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体的方法，其特征在于，采用手性色谱柱并使用烷烃-多元醇或缓冲液-多元醇混合溶剂为流动相进行分析检测，具体步骤为：
衍生化溶液制备方法：
(1)分别将N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体与衍生化试剂按摩尔比小于 1混合配制成确定浓度的混合溶液；
(2)将步骤(1)溶液超声5-10分钟，充分衍生化，得到为N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体的衍生物溶液；
(3)分别将步骤(2)的两个衍生物溶液稀释或否，用微孔滤膜过滤，分别得到浓度为 10mg/ml的对映异构体对照品溶液，将二者按照体积比1:1混合，得到的浓度为5mg/ml外消旋溶液作为供试品溶液。
HPLC分析方法
(1)选用色谱柱，配置相应流动相及流动相比例
(2)设置流动相流速为0.8～1.2ml/min；
(3)设置液相色谱柱温箱温度为25℃；检测波长230nm；进样量为5μL。
进一步地，其中所述的柱前衍生化所使用的衍生化试剂为醇类，优选为甲醇、乙醇、异丙醇中的一种，较优选异丙醇；
进一步地，所得的衍生化产物为N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰甲醇酯A1及其对映异构体A2，或N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰乙醇酯B1及其对映异构体B2，或N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰异丙醇酯C1及其对映异构体C2，化学结构见下面。
进一步地，其中所述的的手性色谱柱为多糖衍生物涂覆型手性色谱柱或蛋白质键合型手性色谱柱。多糖衍生物类手性色谱柱填料为硅胶表面涂覆直链淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)(简写AD-H)或硅胶表面涂覆纤维素-三(3,5-二甲基苯基甲酸酯)(简写OD-H)；蛋白质键合型手性色谱柱填料为硅胶表面共价键合有α1-酸性糖蛋白(简写AGP)。
进一步地，其中所述的烷烃-多元醇混合溶剂优选为正己烷-异丙醇混合溶剂或正庚烷-乙醇混合溶剂，所述的缓冲液-多元醇混合溶剂为乙酸铵缓冲溶液-异丙醇混合溶剂。
进一步地，其中所述的色谱柱AD-H或OD-H，所用流动相为体积比例为95:5～90:10的烷烃-多元醇混合溶剂；其中所述的色谱柱AGP，所用流动相为体积比例为98:2～95:5的10～20mM乙酸铵缓冲溶液-异丙醇混合溶液。
与以往技术相比，本发明的有益效果如下：
(1)本发明采用的柱前衍生化，所得的N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体的衍生物分子稳定性提高，避免化合物分子损伤手性色谱柱或因不稳定而水解，提高了测试结果的准确性。
(2)本发明采用的柱前衍生化，所得的N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体的衍生物分子延长了分子链，提高紫外吸收强度，增加了紫外波长处的可检测性和灵敏度。
(3)采用较优选的手性色谱柱，采用较优选的流动相，选用较优的进样量，选用较优的波长，从而确保了衍生物的稳定性，提高了色谱峰的对称性，并且有较好的分离效果；
(4)本发明能够使N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体适用于手性固定相的液相色谱法分析，进而实现对N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯的质量控制。
可见，本发明克服了现有技术的不足，解决了N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体的分析问题，能够快速、准确和高效分析N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体，有效控制其质量。
因此，本发明开发的柱前衍生化分析N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体的方法是十分必要的。
附图说明
图1：N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体的甲醇酯衍生物HPLC图，色谱条件：色谱柱：AD-H(250×4.6mm,5.0μm)；流动相：正己烷-异丙醇(90:10)。
图2：N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体的乙醇酯衍生物HPLC图，色谱条件：色谱柱：AD-H(250×4.6mm,5.0μm)；流动相：正己烷-异丙醇(95:5)
图3：N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体的异丙醇酯衍生物HPLC图，色谱条件：色谱柱：AD-H(250×4.6mm,5.0μm)；流动相：正己烷-异丙醇(95:5)
图4：N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体的异丙醇酯衍生物HPLC图，色谱条件：色谱柱：OD-H(250×4.6mm,5.0μm)；流动相：正庚烷-无水乙醇(90:10)
图5：N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体的异丙醇酯衍生物HPLC图，色谱条件：色谱柱：AGP(150×4.0mm,5.0μm)；流动相：20mM乙酸铵缓冲液-异丙醇(95:5)
具体实施方式
本发明提供一种柱前衍生化HPLC法分析N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体的方法，其特征在于，采用手性色谱柱并使用烷烃-多元醇混合溶剂或为流动相进行分析检测,具体包括以下步骤：
衍生化溶液制备方法：
(1)分别将N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体与衍生化试剂按摩尔比小于 1混合配制成确定浓度的混合溶液；
(2)将步骤(1)溶液超声5-10分钟，充分衍生化，得到为N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体的衍生物溶液；
(3)分别将步骤(2)的两个衍生物溶液稀释或否，用微孔滤膜过滤，分别得到浓度为 10mg/ml的对映异构体对照品溶液，将二者按照体积比1:1混合，得到的浓度为5mg/ml外消旋溶液作为供试品溶液。
HPLC分析方法
(1)选用色谱柱，配置相应流动相及流动相比例
(2)设置流动相流速为0.8～1.2ml/min；
(3)设置液相色谱柱温箱温度为25℃；检测波长230nm；进样量为5μL。进一步地，柱前衍生化所使用的衍生化试剂为醇类，优选为甲醇、乙醇、异丙醇中的一种，较优选为异丙醇；衍生化制得的衍生物分别为：N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰甲醇酯(A1)及N-(对甲苯磺酰基)-D-丙氨酰甲醇酯(A2)、N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰乙醇酯(B1)及N-(对甲苯磺酰基)-D-丙氨酰乙醇酯(B2)或N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰异丙醇酯(C1)及N-(对甲苯磺酰基)-D-丙氨酰异丙醇酯(C2).
进一步地，手性色谱柱为为多糖衍生物涂覆型手性色谱柱或蛋白质键合型手性色谱柱。其中多糖衍生物涂覆型手性色谱柱填料为硅胶表面涂覆直链淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)(简写AD-H)或硅胶表面涂覆纤维素-三(3,5-二甲基苯基甲酸酯)(简写OD-H)，所用的流动相为流动相比例为95:5～90:10的正己烷-异丙醇混合溶剂或正庚烷-乙醇混合溶剂；其中蛋白质键合性手性色柱填料为硅胶表面共价键合有α1-酸性糖蛋白(简写AGP)，所用的流动相为体积比例为98:2～95:5的10～20mM乙酸铵缓冲溶液-异丙醇混合溶液
实验结果表明：用甲醇、乙醇或异丙醇衍生的N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体，使用本发明所述的HPLC分析检测方法，衍生物分离度均大于2.5，能够有效分离。
可见，本法明能够克服了现有技术的不足，本发明对于N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体的分析问题具有十分有益的结果。
因此，本发明开发的柱前衍生化分析N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体的方法，对于快速、准确和高效分析N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体，有效控制其质量，是十分必要的。
以下通过具体实施方式的描述并参照附图对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不局限于具体实施例。
实施例1
N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体的甲醇酯衍生化溶液的制备方法：
(1)分别将N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及N-(对甲苯磺酰基)-D-丙氨酰氯与甲醇质量体积比1:100进行混合溶解；
(2)将步骤(1)放置到超声清洗机中超声10min,充分衍生化，即可得到N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰甲醇酯溶液及N-(对甲苯磺酰基)-D-丙氨酰甲醇酯溶液，
(3)分别将步骤(2)的两个衍生物溶液稀释，用液相色谱用微孔滤膜过滤，分别得到浓度为0.01g/ml的对映异构体对照品溶液，将二者按照体积比1:1混合，得到的浓度为5mg/ml 外消旋溶液作为供试品溶液。
实施例2
N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体的甲醇酯HPLC分析检测方法
仪器与条件
色谱柱：AD-H(250×4.6mm,5.0μm)
流动相：正己烷-异丙醇(90:10)
柱温：25℃
流速：1.0mL/min
检测波长：230nm
分别精密称取上述对照品溶液和供试品溶液各5μL进入液相色谱仪，记录色谱图。
实验结果：用甲醇衍生的N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体用上述HPLC 分析检测方法能够有效分离，分离度为2.7.见图1.
实施例3
N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体的甲醇酯HPLC分析检测方法
仪器与条件
色谱柱：AD-H(250×4.6mm,5.0μm)
流动相：正己烷-异丙醇(95:5)
柱温：25℃
流速：0.8mL/min
检测波长：230nm
分别精密称取上述对照品溶液和供试品溶液各5μL进入液相色谱仪，记录色谱图。
实验结果：用甲醇衍生的N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体用上述HPLC 分析检测方法能够有效分离，分离度为2.9.
实施例4
N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体的甲醇酯HPLC分析检测方法
仪器与条件
色谱柱：AD-H(250×4.6mm,5.0μm)
流动相：正庚烷-无水乙醇(95:5)
柱温：25℃
流速：0.8mL/min
检测波长：230nm
分别精密称取上述对照品溶液和供试品溶液各5μL进入液相色谱仪，记录色谱图。
实验结果：用甲醇衍生的N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体用上述HPLC 分析检测方法能够有效分离，分离度为2.6.
实施例5
N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体的甲醇酯HPLC分析检测方法
仪器与条件
色谱柱：AD-H(250×4.6mm,5.0μm)
流动相：正庚烷-无水乙醇(90:10)
柱温：25℃
流速：1.0mL/min
检测波长：230nm
分别精密称取上述对照品溶液和供试品溶液各5μL进入液相色谱仪，记录色谱图。
实验结果：用甲醇衍生的N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体用上述HPLC 分析检测方法能够有效分离，分离度为2.0.
实施例6
N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体的甲醇酯HPLC分析检测方法
仪器与条件
色谱柱：OD-H(250×4.6mm,5.0μm)
流动相：正己烷-异丙醇(95:5)
柱温：25℃
流速：0.8mL/min
检测波长：230nm
分别精密称取上述对照品溶液和供试品溶液各5μL进入液相色谱仪，记录色谱图。
实验结果：用甲醇衍生的N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体用上述HPLC 分析检测方法能够有效分离，分离度为2.5.
实施例7
N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体的甲醇酯HPLC分析检测方法
仪器与条件
色谱柱：OD-H(250×4.6mm,5.0μm)
流动相：正己烷-异丙醇(90:10)
柱温：25℃
流速：0.8mL/min
检测波长：230nm
分别精密称取上述对照品溶液和供试品溶液各5μL进入液相色谱仪，记录色谱图。
实验结果：用甲醇衍生的N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体用上述HPLC 分析检测方法能够有效分离，分离度为2.8.
实施例8
N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体的甲醇酯HPLC分析检测方法
仪器与条件
色谱柱：OD-H(250×4.6mm,5.0μm)
流动相：正庚烷-无水乙醇(90:10)
柱温：25℃
流速：0.8mL/min
检测波长：230nm
分别精密称取上述对照品溶液和供试品溶液各5μL进入液相色谱仪，记录色谱图。
实验结果：用甲醇衍生的N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体能够用上述 HPLC分析检测方法有效分离，分离度为2.6.
实施例9
N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体的甲醇酯HPLC分析检测方法
仪器与条件
色谱柱：OD-H(250×4.6mm,5.0μm)
流动相：正庚烷-无水乙醇(95:5)
柱温：25℃
流速：1.0mL/min
检测波长：230nm
分别精密称取上述对照品溶液和供试品溶液各5μL进入液相色谱仪，记录色谱图。
实验结果：用甲醇衍生的N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体能够用上述 HPLC分析检测方法有效分离，分离度为2.9.
实施例10
N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体的甲醇酯HPLC分析检测方法
仪器与条件
色谱柱：AGP(150×4.0mm,5.0μm)
流动相：10mM乙酸铵缓冲液-异丙醇(98:2)
柱温：25℃
流速：0.8mL/min
检测波长：230nm
分别精密称取上述对照品溶液和供试品溶液各5μL进入液相色谱仪，记录色谱图。
实验结果：用甲醇衍生的N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体能够用上述 HPLC分析检测方法有效分离，分离度为4.6.
实施例11
N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体的甲醇酯HPLC分析检测方法
仪器与条件
色谱柱：AGP(150×4.0mm,5.0μm)
流动相：20mM乙酸铵缓冲液-异丙醇(95:5)
柱温：25℃
流速：1.0mL/min
检测波长：230nm
分别精密称取上述对照品溶液和供试品溶液各5μL进入液相色谱仪，记录色谱图。
实验结果：用甲醇衍生的N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体能够用上述 HPLC分析检测方法有效分离，分离度为4.3.
实施例12
N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体的乙醇酯衍生物溶液的制备方法：
(1)分别将N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及N-(对甲苯磺酰基)-D-丙氨酰氯与乙醇质量体积比1:100进行混合溶解；
(2)将步骤(1)放置到超声清洗机中超声10min,充分衍生化，即可得到N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰乙醇酯溶液及N-(对甲苯磺酰基)-D-丙氨酰乙醇酯溶液，
(3)分别将步骤(2)的两个衍生物溶液，用液相色谱用微孔滤膜过滤，分别得到浓度为0.01g/ml的对映异构体对照品溶液，将二者按照体积比1:1混合，得到的外消旋溶液作为供试品溶液。
实施例13
N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体的乙醇酯HPLC分析检测方法
仪器与条件
色谱柱：AD-H(250×4.6mm,5.0μm)
流动相：正己烷-异丙醇(95:5)
柱温：25℃
流速：0.8mL/min
检测波长：230nm
分别精密称取上述对照品溶液和供试品溶液各5μL进入液相色谱仪，记录色谱图。
实验结果：用乙醇衍生的N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体用上述HPLC 分析检测方法能够有效分离，分离度为3.6。见图2。
实施例14
N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体的乙醇酯HPLC分析检测方法
仪器与条件
色谱柱：AD-H(250×4.6mm,5.0μm)
流动相：正己烷-异丙醇(90:10)
柱温：25℃
流速：0.8mL/min
检测波长：230nm
分别精密称取上述对照品溶液和供试品溶液各5μL进入液相色谱仪，记录色谱图。
实验结果：用乙醇衍生的N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体用上述HPLC 分析检测方法能够有效分离，分离度为3.0。
实施例15
N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体的乙醇酯HPLC分析检测方法
仪器与条件
色谱柱：AD-H(250×4.6mm,5.0μm)
流动相：正庚烷-无水乙醇(90:10)
柱温：25℃
流速：1.0mL/min
检测波长：205nm
分别精密称取上述对照品溶液和供试品溶液各5μL进入液相色谱仪，记录色谱图。
实验结果：用乙醇衍生的N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体用上述HPLC 分析检测方法能够有效分离，分离度为2.9
实施例16
N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体的乙醇酯HPLC分析检测方法
仪器与条件
色谱柱：AD-H(250×4.6mm,5.0μm)
流动相：正庚烷-无水乙醇(95:5)
柱温：25℃
流速：1.0mL/min
检测波长：230nm
分别精密称取上述对照品溶液和供试品溶液各5μL进入液相色谱仪，记录色谱图。
实验结果：用乙醇衍生的N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体用上述HPLC 分析检测方法能够有效分离，分离度为2.6
实施例17
N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体的乙醇酯HPLC分析检测方法
仪器与条件
色谱柱：OD-H(250×4.6mm,5.0μm)
流动相：正己烷-异丙醇(95:5)
柱温：25℃
流速：0.8mL/min
检测波长：230nm
分别精密称取上述对照品溶液和供试品溶液各5μL进入液相色谱仪，记录色谱图。
实验结果：用乙醇衍生的N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体用上述HPLC 分析检测方法能够有效分离，分离度为3.0.实施例18
N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体的乙醇酯HPLC分析检测方法
仪器与条件
色谱柱：OD-H(250×4.6mm,5.0μm)
流动相：正己烷-异丙醇(90:10)
柱温：25℃
流速：1.0mL/min
检测波长：230nm
分别精密称取上述对照品溶液和供试品溶液各5μL进入液相色谱仪，记录色谱图。
实验结果：用乙醇衍生的N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体用上述HPLC分析检测方法能够有效分离，分离度为2.4.
实施例19
N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体的乙醇酯HPLC分析检测方法
仪器与条件
色谱柱：OD-H(250×4.6mm,5.0μm)
流动相：正庚烷-无水乙醇(95:5)
柱温：25℃
流速：0.8mL/min
检测波长：230nm
分别精密称取上述对照品溶液和供试品溶液各5μL进入液相色谱仪，记录色谱图。
实验结果：用乙醇衍生的N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体用上述HPLC 分析检测方法能够有效分离，分离度为3.3.
实施例20
N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体的乙醇酯HPLC分析检测方法
仪器与条件
色谱柱：OD-H(250×4.6mm,5.0μm)
流动相：正庚烷-无水乙醇(90:10)
柱温：25℃
流速：1.0mL/min
检测波长：230nm
分别精密称取上述对照品溶液和供试品溶液各5μL进入液相色谱仪，记录色谱图。
实验结果：用乙醇衍生的N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体用上述HPLC 分析检测方法能够有效分离，分离度为2.8.
实施例21
N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体的乙醇酯HPLC分析检测方法
仪器与条件
色谱柱：AGP(150×4.0mm,5.0μm)
流动相：10mM乙酸铵缓冲液-异丙醇(95:5)
柱温：25℃
流速：1.0mL/min
检测波长：230nm
分别精密称取上述对照品溶液和供试品溶液各5μL进入液相色谱仪，记录色谱图。
实验结果：用乙醇衍生的N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体用上述HPLC 分析检测方法能够有效分离，分离度为4.8.
实施例22
N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体的乙醇酯HPLC分析检测方法
仪器与条件
色谱柱：AGP(150×4.0mm,5.0μm)
流动相：10mM乙酸铵缓冲液-异丙醇(92:8)
柱温：25℃
流速：1.0mL/min
检测波长：230nm
分别精密称取上述对照品溶液和供试品溶液各5μL进入液相色谱仪，记录色谱图。
实验结果：用乙醇衍生的N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体用上述HPLC 分析检测方法能够有效分离，分离度为4.5.
实施例23N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体的异丙醇酯衍生物溶液的制备方法：
(1)分别将N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及N-(对甲苯磺酰基)-D-丙氨酰氯与异丙醇质量体积比1:100进行混合溶解；
(2)将步骤(1)放置到超声清洗机中超声10min,充分衍生化，即可得到N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰异丙醇酯溶液及N-(对甲苯磺酰基)-D-丙氨酰异丙醇酯溶液，
(3)分别将步骤(2)的两个衍生物溶液，用液相色谱用微孔滤膜过滤，分别得到浓度为0.01g/ml的对映异构体对照品溶液，将二者按照体积比1:1混合，得到的外消旋溶液作为供试品溶液。
实施例24
N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体的异丙醇酯HPLC分析检测方法
仪器与条件
色谱柱：AD-H(250×4.6mm,5.0μm)
流动相：正己烷-异丙醇(90:10)
柱温：25℃
流速：0.8mL/min
检测波长：230nm
分别精密称取上述对照品溶液和供试品溶液各5μL进入液相色谱仪，记录色谱图。
实验结果：用异丙醇衍生的N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构用上述HPLC 分析检测方法体能够有效分离，分离度为3.6。
实施例25
N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体的异丙醇酯HPLC分析检测方法
仪器与条件
色谱柱：AD-H(250×4.6mm,5.0μm)
流动相：正己烷-异丙醇(95:5)
柱温：25℃
流速：1.2mL/min
检测波长：230nm
分别精密称取上述对照品溶液和供试品溶液各5μL进入液相色谱仪，记录色谱图。
实验结果：用异丙醇衍生的N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构用上述HPLC 分析检测方法体能够有效分离，分离度为3.8。见图3.
实施例26
N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体的异丙醇酯HPLC分析检测方法
仪器与条件
色谱柱：AD-H(250×4.6mm,5.0μm)
流动相：正己烷-异丙醇(93:7)
柱温：25℃
流速：1.0mL/min
检测波长：230nm
分别精密称取上述对照品溶液和供试品溶液各5μL进入液相色谱仪，记录色谱图。
实验结果：用异丙醇衍生的N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体用上述HPLC 分析检测方法能够有效分离，分离度为3.5。
实施例27
N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体的异丙醇酯HPLC分析检测方法
仪器与条件
色谱柱：AD-H(250×4.6mm,5.0μm)
流动相：正庚烷-无水乙醇(90:10)
柱温：25℃
流速：1.0mL/min
检测波长：230nm
分别精密称取上述对照品溶液和供试品溶液各5μL进入液相色谱仪，记录色谱图。
实验结果：用异丙醇衍生的N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体用上述HPLC 分析检测方法能够有效分离，分离度为3.7。
实施例28
N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体的异丙醇酯HPLC分析检测方法
仪器与条件
色谱柱：AD-H(250×4.6mm,5.0μm)
流动相：正庚烷-无水乙醇(95:5)
柱温：25℃
流速：0.8mL/min
检测波长：230nm
分别精密称取上述对照品溶液和供试品溶液各5μL进入液相色谱仪，记录色谱图。
实验结果：用异丙醇衍生的N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体用上述HPLC 分析检测方法能够有效分离，分离度为4.1。
实施例29
N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体的异丙醇酯HPLC分析检测方法
仪器与条件
色谱柱：AD-H(250×4.6mm,5.0μm)
流动相：正庚烷-无水乙醇(91:9)
柱温：25℃
流速：0.8mL/min
检测波长：230nm
分别精密称取上述对照品溶液和供试品溶液各5μL进入液相色谱仪，记录色谱图。
实验结果：用异丙醇衍生的N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体用上述HPLC 分析检测方法能够有效分离，分离度为3.7。
实施例30
N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体的异丙醇酯HPLC分析检测方法
仪器与条件
色谱柱：OD-H(250×4.6mm,5.0μm)
流动相：正己烷-异丙醇(92:8)
柱温：25℃
流速：0.8mL/min
检测波长：230nm
分别精密称取上述对照品溶液和供试品溶液各5μL进入液相色谱仪，记录色谱图。
实验结果：用异丙醇衍生的N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体用上述HPLC 分析检测方法能够有效分离，分离度为3.4。
实施例31
N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体的异丙醇酯HPLC分析检测方法
仪器与条件
色谱柱：OD-H(250×4.6mm,5.0μm)
流动相：正己烷-异丙醇(90:10)
柱温：25℃
流速：0.8mL/min
检测波长：230nm
分别精密称取上述对照品溶液和供试品溶液各5μL进入液相色谱仪，记录色谱图。
实验结果：用异丙醇衍生的N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体用上述HPLC 分析检测方法能够有效分离，分离度为3.2。
实施例32
N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体的异丙醇酯HPLC分析检测方法
仪器与条件
色谱柱：OD-H(250×4.6mm,5.0μm)
流动相：正己烷-异丙醇(95:5)
柱温：25℃
流速：1.0mL/min
检测波长：230nm
分别精密称取上述对照品溶液和供试品溶液各5μL进入液相色谱仪，记录色谱图。
实验结果：用异丙醇衍生的N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体用上述HPLC 分析检测方法能够有效分离，分离度为3.9。
实施例33
N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体的异丙醇酯HPLC分析检测方法
仪器与条件
色谱柱：OD-H(250×4.6mm,5.0μm)
流动相：正庚烷-无水乙醇(90:10)
柱温：25℃
流速：0.8mL/min
检测波长：230nm
分别精密称取上述对照品溶液和供试品溶液各5μL进入液相色谱仪，记录色谱图。
实验结果：用异丙醇衍生的N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体用上述HPLC 分析检测方法能够有效分离，分离度为3.5。见图4。
实施例34
N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体的异丙醇酯HPLC分析检测方法
仪器与条件
色谱柱：OD-H(250×4.6mm,5.0μm)
流动相：正庚烷-无水乙醇(95:5)
柱温：25℃
流速：1.0mL/min
检测波长：230nm
分别精密称取上述对照品溶液和供试品溶液各5μL进入液相色谱仪，记录色谱图。
实验结果：用异丙醇衍生的N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体用上述HPLC 分析检测方法能够有效分离，分离度为4.0。
实施例35
N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体的异丙醇酯HPLC分析检测方法
仪器与条件
色谱柱：OD-H(250×4.6mm,5.0μm)
流动相：正庚烷-无水乙醇(94:6)
柱温：25℃
流速：1.0mL/min
检测波长：230nm
分别精密称取上述对照品溶液和供试品溶液各5μL进入液相色谱仪，记录色谱图。
实验结果：用异丙醇衍生的N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体用上述HPLC 分析检测方法能够有效分离，分离度为3.8。
实施例36
N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体的异丙醇酯HPLC分析检测方法
仪器与条件
色谱柱：AGP(150×4.0mm,5.0μm)
流动相：20mM乙酸铵缓冲液-异丙醇(92:8)
柱温：25℃
流速：1.0mL/min
检测波长：230nm
分别精密称取上述对照品溶液和供试品溶液各5μL进入液相色谱仪，记录色谱图。
实验结果：用异丙醇衍生的N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体用上述HPLC 分析检测方法能够有效分离，分离度为5.2。
实施例37
N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体的异丙醇酯HPLC分析检测方法
仪器与条件
色谱柱：AGP(150×4.0mm,5.0μm)
流动相：20mM乙酸铵缓冲液-异丙醇(95:5)
柱温：25℃
流速：1.0mL/min
检测波长：230nm
分别精密称取上述对照品溶液和供试品溶液各5μL进入液相色谱仪，记录色谱图。
实验结果：用异丙醇衍生的N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体用上述HPLC 分析检测方法能够有效分离，分离度为5.6。见图5。
Claims (9)
1.一种柱前衍生化HPLC法分析N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体的方法，其特征在于，采用手性色谱柱并使用烷烃-多元醇或缓冲液-多元醇混合溶剂为流动相进行分析检测,具体包括以下步骤：
衍生化溶液制备方法：
(1)分别将N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体与衍生化试剂按摩尔比小于1混合配制成确定浓度的混合溶液；
(2)将步骤(1)溶液超声5-10分钟，充分衍生化，得到为N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体的衍生物溶液；
(3)分别将步骤(2)的两个衍生物溶液稀释或否，用微孔滤膜过滤，分别得到浓度为10mg/ml的对映异构体对照品溶液，将二者按照体积比1:1混合，得到的浓度为5mg/ml外消旋溶液作为供试品溶液。
HPLC分析方法
(1)选用色谱柱，配置相应流动相及流动相比例
(2)设置流动相流速为0.8～1.2ml/min；
(3)设置液相色谱柱温箱温度为25℃；检测波长230nm；进样量为5μL。
2.根据权利要求1所述的一种柱前衍生化HPLC法分析N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体的方法，其特征在于，所述的柱前衍生化所用的衍生化试剂为醇类。
3.根据权利要求1所述的一种柱前衍生化HPLC法分析N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体的方法，其特征在于，所述的柱前衍生化所用的衍生化试剂为甲醇、乙醇或异丙醇。
4.根据权利要求1所述的一种柱前衍生化HPLC法分析N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体的方法，其特征在于，所述的柱前衍生化所用的衍生化试剂为异丙醇。
5.根据权利要求1所述的一种柱前衍生化HPLC法分析N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体的方法，其特征在于，所述的衍生化制得的衍生物为N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰甲醇酯A1及其对映异构体A2，或N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰乙醇酯B1及其对映异构体B2，或N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰异丙醇酯C1及其对映异构体C2，化学结构见式(1)。
式(1)中A1:：N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰甲醇酯；A2:N-(对甲苯磺酰基)-D-丙氨酰甲醇酯；B1:N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰乙醇酯；B2:N-(对甲苯磺酰基)-D-丙氨酰乙醇酯；C1:N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰异丙醇酯；C2:N-(对甲苯磺酰基)-D-丙氨酰异丙醇酯。
6.根据权利要求1所述的一种柱前衍生化HPLC法分析N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体的方法，其特征在于，所述的的手性色谱柱为多糖衍生物涂覆型手性色谱柱或蛋白质键合型手性色谱柱。
7.根据权利要求1所述的一种柱前衍生化HPLC法分析N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体的方法，其特征在于，手性色谱柱填料为硅胶表面涂覆直链淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)(AD-H)，或硅胶表面涂覆纤维素-三(3,5-二甲基苯基甲酸酯)(OD-H)，或硅胶表面共价键合有α1-酸性糖蛋白(AGP)。
8.根据权利要求1所述的一种柱前衍生化HPLC法分析N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体的方法，其特征在于，所述的烷烃-多元醇混合溶剂为正己烷-异丙醇混合溶剂或正庚烷-无水乙醇混合溶剂，所述的缓冲液-多元醇混合溶剂为乙酸铵缓冲溶液-异丙醇混合溶剂。
9.根据权利要求1所述的一种柱前衍生化HPLC法分析N-(对甲苯磺酰基)-L-丙氨酰氯及其对映异构体的方法，其特征在于，所述的HPLC分析方法步骤(1)中选用色谱柱，配制相应流动相及流动相比例，具体为色谱柱AD-H或OD-H，所用流动相为体积比例为95:5～90:10的烷烃-多元醇混合溶剂；色谱柱AGP，所用流动相为体积比例为98:2～95:5的10～20mM乙酸铵缓冲溶液-异丙醇混合溶液。
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