CN111926077A - 线粒体来源mc-COX2作为潜在标志物在CLL中的应用 - Google Patents

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李建勇
金晖
伍紫娟
孙汉东
王露桥
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Abstract

本发明提供了一种诊断CLL的分子标志物mc‑COX2，检测mc‑COX2在慢性淋巴细胞白血病患者中的表达水平的试剂，试剂盒，以及诊断及评估CLL的工具。mc‑COX2在CLL患者高表达，并且与TP53表达水平密切相关，mc‑COX2高表达患者总体存活率明显低于低表达者，中为存活期分别为157个月以及74个月，通过试剂，试剂盒以及诊断及评估CLL的工具检测CLL患者中的mc‑COX2表达能够实现CLL患者的预后评估，从而给予相应的积极应对治疗策略，具有重要的临床价值和应用前景。

Description

线粒体来源mc-COX2作为潜在标志物在CLL中的应用
技术领域
本发明涉及生物医学领域，具体的说是线粒体来源环状RNA：mc-COX2作为潜在生物标志物在慢性淋巴细胞白血病中的应用。
背景技术
慢性淋巴细胞白血病(CLL)是西方国家最常见的不可治愈的B细胞肿瘤，临床转归多变且鉴别诊断困难。在我国，随着人口老龄化、生活方式西方化和临床诊断能力的提高，CLL的发病率呈上升趋势。CLL异质性差，部分患者可以无进展生存，但其他伴随高危因素的患者预后较差。因为CLL临床转归多变且鉴别诊断困难，为了提高CLL的诊断和预后评估，迫切需要了解其潜在的分子机制并确定新的、有效的新的生物标记物。
发明内容
为了解决上述技术问题，课题组对CLL发生以及预后的生物标志物进行了研究。
研究发现，环状RNA（circRNA）是一类非编码RNA，其特征是共价闭环结构，既没有5'至3'极性，也没有聚腺苷酸化的尾巴。它们是由前体mRNA反向剪接产生的，具有高度保守性、稳定性和组织特异性，在哺乳动物中广泛表达。既往证据表明，核基因组来源的circRNA与多种疾病包括CLL至关重要，然而对于线粒体基因组来源的circRNA及其可能在CLL中发挥的作用却仍未知。线粒体是维持癌细胞生物能量、生物合成和代谢需求的重要燃料，被认为是癌症治疗的主要靶点。CLL细胞常伴有线粒体质量和数量异常，线粒体代谢可参与CLL的氧化应激。因此，CLL中线粒体circRNA可能具有不同的表达水平，并作为CLL发生以及预后的生物标志物。
为此，本发明提出线粒体来源环状RNA：mc-COX2作为潜在生物标志物在慢性淋巴细胞白血病中的应用。
进一步的，所述环状RNA：mc-COX2为hsa_circ_0089762。
进一步的，通过检测线粒体来源circRNA表达水平实现慢性淋巴细胞白血病的诊断与预后评估的应用。
进一步的，本发明提出检测mc-COX2在慢性淋巴细胞白血病患者中的表达水平的试剂在诊断慢性淋巴细胞白血病，和或慢性淋巴细胞白血病患者预后评估的应用。
所述试剂包括利用SYBR Green检测mc-COX2所使用的特异性引物。
所述检测mc-COX2所使用的特异性引物为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的PCR扩增引物；
SEQ ID NO.2上游引物序列：5'- CATGTGCCATGTCGCCTG -3'；
SEQ ID NO.3下游引物序列：5'- CGCCATCATCCTAGTCCTCA -3'。
本发明还提出一种慢性淋巴细胞白血病的预后判断试剂盒，包括检测mc-COX2所使用的特异性引物，所述检测mc-COX2所使用的特异性引物为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的PCR扩增引物；
SEQ ID NO.2上游引物序列：5'- CATGTGCCATGTCGCCTG -3'；
SEQ ID NO.3下游引物序列：5'- CGCCATCATCCTAGTCCTCA -3'。
本发明还提出一种诊断及评估CLL的工具，其特征在于：所述工具包括能够检测mc-COX2的表达水平。
有益效果：本发明提供了一种诊断CLL的分子标志物mc-COX2，检测mc-COX2在慢性淋巴细胞白血病患者中的表达水平的试剂，试剂盒，以及诊断及评估CLL的工具。mc-COX2在CLL患者高表达，并且与TP53表达水平密切相关，mc-COX2高表达患者总体存活率明显低于低表达者，中为存活期分别为157个月以及74个月，通过试剂，或试剂盒，或诊断及评估CLL的工具，检测CLL患者中的mc-COX2表达能够实现CLL患者的预后评估，从而给予相应的积极应对治疗策略，具有重要的临床价值和应用前景。
附图说明
图1为mc-COX2在CLL患者的血浆与健康人群的血浆的表达情况；
图2为mc-COX2的表达量与CLL患者TP53基因缺失的相关性；
图3为生存曲线分析mc-COX2表达水平与慢淋患者生存率的相关性。
具体实施方式
实施例1：
本发明提出线粒体来源环状RNA：mc-COX2作为潜在生物标志物在慢性淋巴细胞白血病中的应用。
进一步的，所述环状RNA：mc-COX2为hsa_circ_0089762。
进一步的，通过检测线粒体来源circRNA表达水平实现慢性淋巴细胞白血病的诊断与预后评估的应用。
实施例2：
本发明提出检测mc-COX2在慢性淋巴细胞白血病患者中的表达水平的试剂在诊断慢性淋巴细胞白血病，和或慢性淋巴细胞白血病患者预后评估的应用。
所述试剂包括利用SYBR Green检测mc-COX2所使用的特异性引物。
所述检测mc-COX2所使用的特异性引物为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的PCR扩增引物；
SEQ ID NO.2上游引物序列：5'- CATGTGCCATGTCGCCTG -3'；
SEQ ID NO.3下游引物序列：5'- CGCCATCATCCTAGTCCTCA -3'。
实施例3：
本发明还提出一种慢性淋巴细胞白血病的预后判断试剂盒，包括检测mc-COX2所使用的特异性引物，所述检测mc-COX2所使用的特异性引物为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的PCR扩增引物；
SEQ ID NO.2上游引物序列：5'- CATGTGCCATGTCGCCTG -3'；
SEQ ID NO.3下游引物序列：5'- CGCCATCATCCTAGTCCTCA -3'。
实施例4：
本发明还提出一种诊断及评估CLL的工具，其特征在于：所述工具包括能够检测mc-COX2的表达水平。
本发明实验方法及实验数据如下：
1、样本收集及RNA提取
收集江苏省人民医院血液科54例CLL患者和40例年龄、性别相匹配的健康人群血浆样本进行实验。
TIANamp Virus RNA Kit ( TIANGEN, Cat.# DP315-R )提取血浆总RNA。
2、逆转录PCR
20 µL逆转录反应体系：
成分 体积
5×Goldenstar<sup>TM </sup>Buffer 4 µL
dNTP Mix 1 µL
Goldenstar<sup>TM</sup>Oligo (dT)<sub>17</sub> 1 µL
DTT 1 µL
Goldenstar<sup>TM</sup>RT6 1 µL
RNA 1 µg
RNase-free water 补足到20 µL
逆转录程序为：25ºC，10 min；50ºC，15 min；85ºC，5 min。
、实时荧光定量PCR（qRT-PCR）
10 µL qRT-PCR反应体系：
成分 体积
SYBR Green Master Mix 5 µL
RNase-free water 2 µL
上游引物 1 µL
下游引物 1 µL
逆转录产物 1 µL
反应程序：预变性95℃ 5 min，变性95℃ 10 s，退火/延伸60℃ 30 s。
4、对PCR扩增产物进行测序，结果比对后为目的片段，该目的片段包含COX2基因环化位点，为mc-COX2特异性片段。荧光定量PCR的结果表明：与健康人群相比，mc-COX2在CLL患者中表达水平明显上调，且差异具有统计学意义(P<0.005)（图1），说明mc-COX2能够作为CLL的诊断指标。
5、图2为对CLL患者TP53基因缺失情况进行分析，可以看出mc-COX2的表达量与CLL患者TP53基因缺失情况相关。
6、对54例患者预后生存曲线进行分析，图3为生存曲线分析mc-COX2表达量与患者生存率的相关性。mc-COX2高表达的病人生存期明显缩短，提示该circRNA指标与CLL临床分期及生存期高度相关。进一步说明mc-COX2可以作为CLL患者诊断及预后评估的标志物。
序列表
<110> 江苏省人民医院（南京医科大学第一附属医院）
<120> 线粒体来源mc-COX2作为潜在标志物在CLL中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 396
<212> RNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 1
gucgccuggu ucuaggaaua augggggaag uauguaggag uugaagauua guccgccgua 60
gucgguguac ucguagguuc aguaccauug guggccaauu gauuugaugg uaagggaggg 120
aucguugacc ucgucuguua uguaaaggau gcguagggau gggagggcga ugaggacuag 180
gaugauggcg ggcaggauag uucagacggu uucuauuucc ugagcgucug agauguuagu 240
auuaguuagu uuuguuguga guguuaggaa aagggcauac aggacuagga agcagauaag 300
gaaaaugauu augagggcgu gaucaugaaa ggugauaagc ucuucuauga uaggggaagu 360
agcgucuugu agaccuacuu gcgcugcaug ugccau 396

Claims (7)

1.线粒体来源环状RNA：mc-COX2作为潜在生物标志物在检测和诊断慢性淋巴细胞白血病中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述环状RNA：mc-COX2为hsa_circ_0089762。
3.检测mc-COX2在慢性淋巴细胞白血病患者中的表达水平的试剂在诊断慢性淋巴细胞白血病，和或慢性淋巴细胞白血病患者预后评估的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述试剂包括利用SYBR Green检测mc-COX2所使用的特异性引物。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述检测mc-COX2所使用的特异性引物为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的PCR扩增引物；
SEQ ID NO.2上游引物序列：5'- CATGTGCCATGTCGCCTG -3'；
SEQ ID NO.3下游引物序列：5'- CGCCATCATCCTAGTCCTCA -3'。
6.一种慢性淋巴细胞白血病的预后判断试剂盒，其特征在于：包括检测mc-COX2所使用的特异性引物，所述检测mc-COX2所使用的特异性引物为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的PCR扩增引物；
SEQ ID NO.2上游引物序列：5'- CATGTGCCATGTCGCCTG -3'；
SEQ ID NO.3下游引物序列：5'- CGCCATCATCCTAGTCCTCA -3'。
7.一种诊断及评估CLL的工具，其特征在于：所述工具包括能够检测mc-COX2的表达水平。
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