CN111926000A - 绞股蓝糖基转移酶及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及绞股蓝糖基转移酶及其应用。本发明首次从绞股蓝中鉴定到糖基转移酶，该糖基转移酶能够催化多种四环三萜类合成具有高附加值和多种重要生理活性四环三萜皂苷类化合物，尤其是该糖基转移酶催化绞股蓝特有的皂苷元2‑OH‑PPD的C3羟基的糖基化。

Description

绞股蓝糖基转移酶及其应用

技术领域

本发明属于生物技术和天然产物药物等领域，具体地涉及绞股蓝糖基转移酶及其应用。

背景技术

人参皂苷与绞股蓝皂苷分别是从人参属植物(如人参、三七、西洋参等)和绞股蓝中分离到的皂苷的总称，它们属于三萜类皂苷，分别是人参属植物和绞股蓝中的主要有效成份。目前，已经从人参属植物和绞股蓝中分离出了150种以上皂苷，其中一些皂苷被证实具有广泛的生理功能和药用价值，包括抗肿瘤、免疫调节、抗疲劳、护心和护肝等功能。

从结构上来看，人参皂苷与绞股蓝皂苷都是三萜皂苷元通过糖基化修饰后形成的糖苷类化合物。人参皂苷与绞股蓝皂苷的皂苷元只有有限的几种，其中最主要的是以原人参二醇(PPD)、原人参三醇(PPT)及2-羟基原人参二醇(2-OH-PPD)为代表的达玛烷型四环三萜皂苷元。其中2-羟基原人参二醇(2-OH-PPD)是绞股蓝特有的皂苷元。

皂苷元通过糖基化后，可以显著提高其水溶性和稳定性，继而产生出不同的生理活性。不同的糖基修饰种类、修饰位点、糖链组成和长度使人参皂苷与绞股蓝皂苷在生理功能和药用价值上产生极大的差异。例如，人参皂苷Rb1、Rd和Rc都是以原人参二醇为皂苷元的皂苷，它们之间的差别只是糖基修饰上的差别，但它们之间的生理功能就有很多的差别。Rb1有稳定中心神经元系统的功能，而Rc的功能却是抑制中心神经元系统的功能，Rb1的生理功能非常广泛，而Rd却只有非常有限的几种功能。

人参皂苷与绞股蓝皂苷的皂苷元的糖基化修饰一般发生与C3、C6和C20位羟基，其中C3羟基的糖基化修饰不仅是三萜皂苷最普遍的一种修饰，而且也是许多具有重要生理活性的皂苷例如人参皂苷Rh2、Rg3等具有的糖基化修饰，因此研究皂苷元C3羟基的糖基化修饰具有重要意义。虽然目前已有从人参中分离到催化原人参二醇合成稀有人参皂苷Rh2的糖基转移酶(Jung et al Plant cell physiology 2014；Wang et al Metabolicengineering 2015)的文献报道，但是绞股蓝中催化皂苷元C3羟基的糖基化修饰的糖基转移酶至今仍未有报道。更重要的是能够催化绞股蓝特有的皂苷元2-OH-PPD的C3羟基的糖基化的糖基转移酶仍未鉴定，因此克隆与鉴定绞股蓝来源的糖基转移酶，获得能够催化2-OH-PPD等皂苷元C3羟基糖基化修饰的糖基转移酶是本领域亟需解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种绞股蓝来源的糖基转移酶及其应用。

具体而言，本发明提供一种分离的多肽，所述分离的多肽选自：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的多肽；

(b)将SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的且具有糖基转移酶活性的由(a)衍生的多肽；

(c)与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列有至少85％序列同一性、且具有糖基转移酶活性的由(a)衍生的多肽；和

(d)序列中含有(a)、(b)或(c)所述多肽的衍生多肽。

本发明还提供一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子选自：

(1)权利要求1所述分离的多肽的编码序列；

(2)第(1)项所述的编码序列的互补序列；

(3)与第(1)项或第(2)项所述序列具有至少90％同一性的序列；和

(4)第(1)项、第(2)项和第(3)项所述的序列的长至少15个碱基的片段或能与第(1)项、第(2)项和第(3)项所述的序列杂交的长至少15个碱基的片段。

在一些实施方案中，所述编码序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明还提供一种核酸构建物，所述核酸构建物含有本文所述的核酸分子。

在一些实施方案中，所述核酸构建物是载体，包括克隆载体和表达载体。

本发明还提供一种宿主细胞，所述细胞含有本文所述的核酸分子或核酸构建物。

在一些实施方案中，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞，包括大肠杆菌、枯草杆菌、真菌细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞和植物细胞。

本发明还提供本文所述的分离的多肽、分离的核酸分子、核酸构建物或宿主细胞在合成四环三萜类化合物中的应用，或在制备合成四环三萜类化合物用的试剂中的应用。

在一些实施方案中，所述应用为将来自糖基供体的糖基转移到四环三萜类化合物的C-3位羟基上。

在一些实施方案中，所述四环三萜类化合物为C-3位羟基糖基化的四环三萜类化合物；优选为S构型或R构型的达玛烷型、羊毛脂烷型、甘遂烷型、环阿屯烷型、apotirucallane型、葫芦烷和楝烷型的四环三萜类化合物。

在一些实施方案中，所述应用为合成C-3位羟基被糖基化的2-羟基原人参二醇、原人参二醇、原人参三醇、达玛烯二醇、人参皂苷F1和/或人参皂苷CK；或制备用于合成C-3位羟基被糖基化的2-羟基原人参二醇、原人参二醇、原人参三醇、达玛烯二醇、人参皂苷F1和/或CK的试剂。

本发明还提供一种酶制品，其含有本文所述的分离的多肽，或为本文所述宿主细胞的裂解液的上清液或其浓缩物。

在一些实施方案中，所述酶制品中还含有缓冲液。

本发明还提供一种体外糖基化方法，所述方法包括：混合糖基供体、四环三萜类化合物和本文所述的多肽或酶制剂，在允许所述多肽将糖基供体的糖基转移到四环三萜类化合物的C-3位羟基的条件下进行反应。

在该体外糖基化方法的一些实施方案中，所述四环三萜类化合物选自S构型或R构型的达玛烷型、羊毛脂烷型、甘遂烷型、环阿屯烷型、apotirucallane型、葫芦烷和楝烷型的四环三萜类化合物。

在该体外糖基化方法的一些实施方案中，所述四环三萜类化合物选自2-羟基原人参二醇、原人参二醇、原人参三醇、达玛烯二醇、人参皂苷F1和人参皂苷CK。

在一些实施方案中，本发明提供其C-3位羟基糖基化的2-羟基原人参二醇的制备方法，所述方法包括以本文所述的多肽为糖基转移酶催化糖基供体的糖基转移到2-羟基原人参二醇的C-3位羟基上，从而制备得到C-3位羟基糖基化的2-羟基原人参二醇。

本发明还提供本文所述多肽的制备方法，所述方法包括：

(a)在适合表达的条件下，培养本文所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出所述多肽。

本发明还提供一种产生转基因植物的方法，所述方法包括将表达本文所述多肽、或含有本文所述核酸分子、或含有本文所述核酸构建物的载体遗传工程化的植物细胞再生为植株的步骤。

附图说明

图1为糖基转移酶GpUGT1琼脂糖凝胶电泳图：1kb DNA分子量标准(M)是上海翊圣生物科技有限公司的产品，control为阴性对照，PCR模板为ddH2O,电泳图显示在目标条带1371bp无条带；GpUGT1的PCR模板为PMDT-GpUGT1，电泳图显示在目标条带1371bp有条带。

图2为糖基转移酶GpUGT1western blot图；蛋白分子量标准(M)是北京康润诚业生物科技有限公司(GenStar BioSolutions)的彩色预染蛋白分子量标准(10-180kDa)，control为BL21-pET28a获取的蛋白粗酶液，GpUGT1为BL21-pET28a-GpUGT1获取的蛋白粗酶液，western blot图显示GpUGT1的目标条带，而control无目标条带。

图3为糖基转移酶GpUGT1催化四环三萜类化合物的TLC检测图。

图4为糖基转移酶Pn50、UGTPg45和GpUGT1催化2-OH-PPDTLC检测图。

具体实施方式

为使本领域技术人员可了解本发明的特点及效果，以下谨就说明书及权利要求书中提及的术语及用语进行一般性的说明及定义。除非另有指明，否则文中使用的所有技术及科学上的字词，均为本领域技术人员对于本发明所了解的通常意义，当有冲突情形时，应以本说明书的定义为准。

本文中，当描述实施方案、实施例或实例时，应理解，其并非用来将本发明限定于这些实施方案、实施例或实例。相反地，本发明所描述的方法及材料的所有的替代物、改良物及均等物，均可涵盖于权利要求书所限定的范围内。本领域技术人员将可确认许多可用于实施本发明的类似于或相当于本文中所描述的方法及材料。

本文中，为使描述简洁，未对各个实施方案、实施例或实例中的各个技术特征的所有可能的组合都进行描述。因此，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，各个实施方案、实施例或实例中的各个技术特征可以进行任意的组合，所有可能的组合都应当认为是本说明书记载的范围。

本发明通过对绞股蓝的基因组和转录组数据进行数据挖掘分析，从中获得糖基转移酶的核苷酸候选序列GpUGT1。通过在大肠杆菌中表达该序列，制备含有该序列表达产物的粗酶液，以UDP-葡萄糖为糖基供体，通过体外催化检测其对四环三萜类化合物的催化活性。本发明发现GpUGT1表达产物能够催化多种四环三萜类合成具有高附加值和多种重要生理活性四环三萜皂苷类化合物，由此完成本发明。

因此，本发明提供一类分离的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。该分离的多肽具有糖基转移酶活性。

本文中，“分离”的多肽是指所述多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化所述多肽。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。多肽的纯度还可以用氨基酸序列进行进一步分析。

本文中，糖基转移酶活性是指以将来自糖基供体的糖基转移到四环三萜类化合物C-3位的羟基以替换所述羟基的H的活性。示例性的反应可如下所示：

式中，R₁为H或羟基；R₂为H或OH；R₃为H或OH；R4为H或糖基；R为糖基。

本文中，四环三萜类化合物包括本领域周知的各种四环三萜类化合物，包括S构型或R构型的达玛烷型、羊毛脂烷型、甘遂烷型、环阿屯烷(环阿尔廷烷)型、apotirucallane型、葫芦烷和楝烷型等四环三萜类化合物。具体的四环三萜类化合物包括但不限于2-羟基原人参二醇(2-OH-PPD)、原人参二醇(PPD)、原人参三醇(PPT)、达玛烯二醇、人参皂苷F1和CK等。

本文所述的糖基供体包括能提供本领域周知的皂苷中通常所含的各类糖基的糖基供体，为核苷二磷酸糖，可选自：UDP-葡萄糖，ADP-葡萄糖，TDP-葡萄糖，CDP-葡萄糖，GDP-葡萄糖，UDP-乙酰基葡萄糖，ADP-乙酰基葡萄糖，TDP-乙酰基葡萄糖，CDP-乙酰基葡萄糖，GDP-乙酰基葡萄糖，UDP-木糖，ADP-木糖，TDP-木糖，CDP-木糖，UDP-木糖，GDP-木糖，UDP-半乳糖醛酸，ADP-半乳糖醛酸，TDP-半乳糖醛酸，CDP-半乳糖醛酸，GDP-半乳糖醛酸，UDP-半乳糖，ADP-半乳糖，TDP-半乳糖，CDP-半乳糖，GDP-半乳糖，UDP-阿拉伯糖，ADP-阿拉伯糖，TDP-阿拉伯糖，CDP-阿拉伯糖，GDP-阿拉伯糖，UDP-鼠李糖，ADP-鼠李糖，TDP-鼠李糖，CDP-鼠李糖，GDP-鼠李糖，或其他核苷二磷酸己糖或核苷二磷酸戊糖，或其组合。在一些实施方案中，糖基供体优选是尿苷二磷酸糖，可选自下组：UDP-葡萄糖，UDP-木糖，UDP-鼠李糖，UDP-半乳糖醛酸，UDP-半乳糖，UDP-阿拉伯糖，或其他尿苷二磷酸己糖或尿苷二磷酸戊糖，或其组合。

本领域普通技术人员不难知晓，在多肽的某些区域，例如非重要区域改变少数氨基酸残基基本上不会改变生物活性，例如，适当替换某些氨基酸得到的序列并不会影响其活性(可参见Watson等，Molecular Biology of The Gene，第四版，1987，The Benjamin/Cummings Pub.Co.P224)。本领域普通技术人员能够实施这种替换并且确保所得分子仍具有所需生物活性。因此，本发明提供的多肽还包括在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的基础上经过一个或多个(优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-3个)氨基酸残基的突变(包括取代、缺失或添加)而形成的，具有本文所述糖基转移酶活性的由SEQ ID NO:1衍生的多肽，以及与SEQ ID NO:1具有至少85％，优选至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，且具有本文所述糖基转移酶活性的由SEQ IDNO:1衍生的多肽。

本领域周知，用具有相似或相近理化性质的氨基酸进行替换，所得序列通常仍会保持原有的生物学功能。具体而言，氨基酸一般被分成四类：(1)酸性氨基酸，包括天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性氨基酸，包括赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性氨基酸，包括丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；(4)无电荷的极性氨基酸，包括甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。有时将苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸归为芳族氨基酸。有理由预测：单独用异亮氨酸或缬氨酸取代亮氨酸、用谷氨酸取代天冬氨酸、用丝氨酸取代苏氨酸，或者用结构上相关的氨基酸取代类似的保守的氨基酸，这样的取代将不会对生物活性有重要影响。因此，感兴趣的多肽可包括多达约5-10个保守的或不保守的氨基酸取代，甚至多达约15-25个保守的或不保守的氨基酸取代，或2-25之间任何整数，只要该分子的所需功能仍维持完整。本领域的熟练技术人员可结合本领域熟知的Hopp/Woods和Kyte-Doolittle曲线图，容易地测定感兴趣的分子中可耐受改变的区域。因此，在一些实施方案中，多肽上存在的突变是取代突变，优选是保守取代。

可采用本领域普通技术人员公知的测定序列同一性的方法来确定两条或多条序列之间的序列同一性。示例性的方法包括计算机程序方法包括但不限于：GCG程序包、BLASTP、BLASTN和FASTA等。公众可从NCBI和其它来源得到BLASTX程序。熟知的SmithWaterman算法也可用于测定序列同一性。

本发明还包括含有SEQ ID NO:1或其突变体(如前文所述的具有一个或多个氨基酸突变或具有至少85％序列同一性的多肽)的衍生多肽。这类衍生多肽包括含有所述SEQID NO:1或其突变体的融合蛋白(如与其它糖基转移酶形成的融合蛋白)，以及为表达、纯化等目的尔在SEQ ID NO:1、其突变体或其融合蛋白的氨基端和/或羧基端设计的多个或多个作为蛋白标签的多肽片段。任何合适的标签都可以用于本发明。例如，所述的标签可以是FLAG、HA、HA1、c-Myc、Poly–His、Poly-Arg、Strep-TagII、AU1、EE、T7、4A6、ε、B、gE和Ty1等。这些标签可用于对蛋白进行纯化。表1列出了其中的一些标签及其序列。除此之外，为了使翻译的蛋白分泌表达(如分泌到细胞外)，还可在SEQ ID NO:1、其突变体或其融合蛋白的氨基酸氨基末端添加上信号肽序列，如pelB信号肽等。这类多肽都属于本文所述的衍生多肽。

本发明的活性多肽可以是重组多肽、天然多肽或合成多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、植物)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括所述多肽的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持所述多肽相同的生物学功能或活性的多肽。

本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

本发明包括核酸分子，其为本发明分离的多肽的编码序列或该编码序列的互补序列。本发明的核酸分子可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。本文中，“编码序列”可以是编码感兴趣多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述核酸分子的变异体。此类变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。

本发明的核酸分子还包括与所述编码序列或其互补序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％同一性的多核苷酸序列。本发明特别涉及在严格条件(或严紧条件)下与本发明所述核酸分子可杂交的多核苷酸序列。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的同一性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸序列编码的多肽与SEQ ID NO:1所示的多肽具有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及本文所述核酸分子的核酸片段，以及与本文所述核酸分子杂交的核酸片段。本文中，“核酸片段”指核酸分子的一部分，长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。本文所述的核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码本文所述多肽或其衍生多肽的多核苷酸序列。

本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

本发明的多肽或其衍生多肽的编码序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明多肽(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明的多肽序列中。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的核酸分子的核酸构建物。本文中，核酸构建物是指能指导本文核酸分子表达的装配，通常包括本文所述的核酸分子和一个或数个调控序列。调控序列可以是合适的启动子序列。启动子序列通常与待表达核酸分子操作性连接。启动子可以是在所选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合启动子，并且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。调控序列也可以是合适的转录终止子序列，由宿主细胞识别以终止转录的序列。终止子序列与编码该多肽的核苷酸序列的3’末端操作性连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本文。在一些实施方案中，该核酸构建物为一表达盒。

在一些实施方案中，该核酸构建物为载体。载体可以是克隆载体，也可以是表达载体，或者是同源重组载体。可将本文所述的核酸分子克隆入许多类型的载体，包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。克隆载体可用于提供本文所述的核酸分子。表达载体用于在宿主细胞内表达本发明的多肽。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用，包括细菌质粒、噬菌体、酵母质粒和病毒(如腺病毒、逆转录病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒)等。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。同源重组载体用于将本文所述的表达盒整合到宿主基因组中。

可采用本领域熟知的方法构建本文所述核酸分子和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的核酸分子可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

在高等真核细胞中表达本发明的核酸分子时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。

增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。因此，在一些实施方案中，本发明的表达载体中还含有增强子。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。在一些实施方案中，宿主细胞还可以是植物细胞，尤其是来自绞股蓝的细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的核酸分子表达或生产重组的多肽。一般来说有以下步骤：

(1)用本发明的核酸分子或含有该核酸分子的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2)在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明多肽或糖基转移酶的用途包括但不限于：特异和高效地将来自糖基供体的糖基转移到四环三萜类化合物的C-3位羟基上。

本发明提供一种制备C-3位羟基被糖基化的四环三萜类化合物的方法，包括：使用本发明的多肽作为糖基转移酶，将糖基供体的糖基转移到四环三萜类化合物的C-3位羟基上，获得该位置上具有糖基的四环三萜类化合物。在一些实施方案中，该方法为体外反应，反应体系中通常含有本发明的多肽、糖基供体以及C-3位为羟基的四环三萜类化合物。反应体系中还可含有合适的缓冲液。通常，反应体系的pH为pH4.0-10.0，优选pH6.0-pH8.5，更优选7.4。反应条件可为10℃-105℃，优选25℃-38℃，更优选35℃。在一些实施方案中，该方法可以发生在离体动物细胞内或微生物细胞内，或者发生在植物细胞内或植株中。例如，可改造相应的细胞，使其表达本发明的糖基转移酶以及本领域周知的四环三萜类化合物合成代谢途径相关的基因，构建相应的遗传工程菌或细胞，从而尤其制备得到感兴趣的四环三萜类化合物。在使用植物细胞的情况下，还可将植物细胞再生成植株，从而制备得到高表达感兴趣四环三萜类化合物的植株。适用于该制备方法的多肽、糖基供体以及四环三萜类化合物可如前文任一实施方案所述。在一些实施方案中，本文所述的C-3位羟基被糖基化的四环三萜类化合物包括但不限于Rh2、3-O-糖基-PPT、F2、3-O-糖基-2-OH-PPD、3-O-糖基-F1和3-O-糖基-DM。在优选的实施方案中，该方法可用来制备C-3位羟基的H被糖基取代的2-OH-PPD，尤其是C-3位羟基的H被葡萄糖基取代的2-OH-PPD，如3-O-β-(D-吡喃葡萄糖基)-2-OH-PPD。

本发明还提供了一种组合物，它含有有效量的本发明的多肽，以及工业上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括但并不限于水、缓冲液、甘油、乙醇、及其组合。合适的缓冲液可以是磷酸盐缓冲液。所述的组合物中还可添加有调节本发明多肽的糖基转移酶活性的物质。任何具有提高酶活性功能的物质均是可用的。较佳地，所述的提高本发明的糖基转移酶活性的物质选自巯基乙醇。此外，很多物质可以降低酶活性，包括但不限于：Ca²⁺、Co²⁺、Mn^{2 +}、Ba²⁺、Al³⁺、Ni²⁺、Zn²⁺和Fe²⁺；或在添加至底物后可水解形成Ca²⁺、Co²⁺、Mn²⁺、Ba²⁺、Al³⁺、Ni²⁺、Zn²⁺和Fe²⁺的物质。在一些实施方案中，所述组合物是酶制剂，该酶制剂含有本发明多肽，或者可以是表达本发明多肽的宿主细胞裂解液的上清液或该上清液的浓缩物。酶制剂中还可含有本领域周知的用于酶制剂的载体或赋形剂。

本发明还提供本文所述的分离的多肽、分离的核酸分子、核酸构建物或宿主细胞在合成四环三萜类化合物中的应用，或在制备合成四环三萜类化合物用的试剂中的应用。尤其是，所述应用为将来自糖基供体的糖基转移到四环三萜类化合物的C-3位羟基上。适用于该应用的四环三萜类化合物可如前文任一实施方案所述，优选为C-3位羟基中的H被糖基取代的四环三萜类化合物，包括但不限于Rh2、3-O-糖基-PPT、F2、3-O-糖基-2-OH-PPD、3-O-糖基-F1和3-O-糖基-DM。优选地，所述应用为制备C-3位羟基的H被糖基，如葡萄糖基，取代的2-OH-PPD，如3-O-β-(D-吡喃葡萄糖基)-2-OH-PPD。

本发明还提供一种产生转基因植物的方法，所述方法包括将表达本文所述多肽、或含有本文所述核酸分子、或含有本文所述核酸构建物的载体遗传工程化的植物细胞再生为植株的步骤。将植物细胞再生为植株的方法为本领域所周知。优选地，与非由本申请的遗传工程化植物细胞再生而成的对照植株相比，所述转基因植物中C-3位羟基的H被糖基，如葡萄糖基，取代的2-OH-PPD的含量更高。在一些实施方案中，所述植物细胞为绞股蓝细胞、人参细胞、西洋参细胞和三七细胞，所述转基因植株为绞股蓝、人参、西洋参和三七。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1.糖基转移酶GpUGT1的克隆及其在大肠杆菌中表达

合成如序列表中SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的两条引物，以从绞股蓝中提取的RNA反转录获得的cDNA为模板，利用如上引物进行PCR。DNA聚合酶选用宝生物工程有限公司的高保真的KOD DNA聚合酶。PCR扩增程序为：94℃ 2min；94℃ 15s，58℃ 30s，68℃ 2min，共35个循环；68℃10min降至10℃。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果如附图1。

在紫外下照射，切下目标DNA条带。然后采用Axygen Gel Extraction Kit(AEYGEN公司)从琼脂糖凝胶中回收DNA，即为扩增出的糖基转移酶基因的DNA片段。利用宝生物工程(大连)有限公司(Takara)的PMD18-T克隆试剂盒，将回收的PCR产物克隆到PMDT载体，所构建的载体命名为PMDT-GpUGT1。经测序获得GpUGT1的基因序列。

GpUGT1基因具有SEQ ID NO:2的核苷酸序列。自SEQ ID NO:2的5’端第1-1371位核苷酸为GpUGT1的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)，自SEQ ID NO:2的5’端的第1-3位核苷酸为GpUGT1基因的起始密码子ATG，自SEQ ID NO:2的5’端的第1369-1371位核苷酸为GpUGT1基因的终止密码子TAG。糖基转移酶GpUGT1编码一个含有456个氨基酸的蛋白质GpUGT1，具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸残基序列，用软件预测到该蛋白质的理论分子量大小为51.5kDa，等电点pI为4.85。

合成如序列表中SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的两条引物，在合成的引物两端分别添加20bp pET28a载体(Invitrogen公司)连接同源臂序列，以质粒PMDT-GpUGT1为模板进行PCR。PCR扩增程序同上。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离，回收后的PCR产物利用Vazyme公司的One-step mutis clone kit连入经BamH I和Xho I双酶切的pET28a载体中。所获得的重组质粒命名为pET28a-GpUGT1。

将重组质粒pET28a-GpUGT1及空载体pET28a转化大肠杆菌BL21(DE3)中构建重组大肠杆菌BL21-pET28a-GpUGT1和BL21-pET28a。

分别接种BL21-pET28a-GpUGT1和BL21-pET28a到LB培养基中，37℃200rpm培养至OD600约0.6-0.8，使菌液降温至4℃，加入终浓度为50μM的IPTG，18℃，200rpm诱导表达15h。4℃离心收集菌体，加入裂解缓冲液(50mM磷酸盐缓冲液、1mM EDTA、1mM DTT，pH 7.4)重悬菌体，超声破碎细胞，4℃、12000g离心收集细胞裂解液上清，取样品进行SDS-PAGE电泳和Western blot分析，结果如附图2。

类似的，采用相同的方法分别构建三七来源的糖基转移酶Pn50的大肠杆菌表达菌株BL21-pET28a-Pn50、人参来源的糖基转移酶UGTPg45的大肠杆菌表达菌株BL21-pET28a-UGTPg45。糖基转移酶Pn50具有序列表中SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列，编码具有SEQ IDNO:8所示氨基酸序列；糖基转移酶UGTPg45具有序列表中SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列，编码具有SEQ ID NO:10所示氨基酸序列。

实施例2.糖基转移酶GpUGT1催化四环三萜类化合物糖基化反应

以实施例1获得BL21-pET28a-GpUGT1和BL21-pET28a裂解液上清为粗酶液，配置如下反应体系(100μL)：

在35℃水浴下反应过夜。反应结束后加入等体积的正丁醇抽提，取上层正丁醇相，经真空浓缩后，反应产物溶解于10μL无水乙醇中，结果用TLC检测，结果如图3所示。

从图3A中结果可以看出，以PPD为底物时，含有糖基转移酶GpUGT1的大肠杆菌粗酶液BL21-pET28a-GpUGT1可以催化PPD形成一种新的产物，该产物在TLC的位置与Rh2标准品一致，而对照组含有空载体pET28a的大肠杆菌粗酶液BL21-pET28a催化PPD则没有该产物生成。以PPT为底物时，含有糖基转移酶GpUGT1的大肠杆菌粗酶液BL21-pET28a-GpUGT1可以催化PPT形成一种新的产物，即3-O-β-(D-吡喃葡萄糖基)-PPT，其在TLC的位置如图所示，而含有空载体pET28a的大肠杆菌粗酶液BL21-pET28a(control，对照组)催化PPT则没有该产物生成。

从图3B中结果可以看出，以CK(人参皂苷Compound K)为底物时，含有糖基转移酶GpUGT1的大肠杆菌粗酶液BL21-pET28a-GpUGT1可以催化CK形成一种新的产物，其在TLC的位置与F2标准品一致，而含有空载体pET28a的大肠杆菌粗酶液BL21-pET28a催化CK则没有该产物生成。以2-OH-PPD为底物时，含有糖基转移酶GpUGT1的大肠杆菌粗酶液BL21-pET28a-GpUGT1可以催化2-OH-PPD形成一种新的产物，即3-O-β-(D-吡喃葡萄糖基)-2-OH-PPD，其在TLC的位置如图所示，而含有空载体pET28a的大肠杆菌粗酶液BL21-pET28a催化2-OH-PPD则没有该产物生成。

从图3C中结果可以看出，以人参皂苷F1为底物时，含有糖基转移酶GpUGT1的大肠杆菌粗酶液BL21-pET28a-GpUGT1可以催化F1形成一种新的产物，其为一种人参皂苷，在TLC的位置与La标准品一致，而含有空载体pET28a的大肠杆菌粗酶液BL21-pET28a催化F1则没有该产物生成。

从图3D中结果可以看出，以达玛烯二醇(DM)为底物时，含有糖基转移酶GpUGT1的大肠杆菌粗酶液BL21-pET28a-GpUGT1可以催化DM形成一种新的产物，即3-O-β-(D-吡喃葡萄糖基)-DM，其在TLC的位置如图所示，而含有空载体pET28a的大肠杆菌粗酶液BL21-pET28a催化DM则没有该产物生成。

上述结果表明，本发明中发现的糖基转移酶GpUGT1能催化四环三萜类化合物PPD、PPT、CK、2-OH-PPD、F1和DM的C3位糖基化反应分别合成Rh2、3-O-Glc-PPT、F2、3-O-Glc-2-OH-PPD、3-O-Glc-F1和3-O-Glc-DM。

实施例3.人参和三七糖基转移酶催化2-OH-PPD糖基化反应

以实施例1获取蛋白粗酶液的方法分别获得BL21-pET28a-Pn50、BL21-pET28a-UGTPg45、BL21-pET28a-GpUGT1和BL21-pET28a裂解液上清为粗酶液，配置如下反应体系(50μL)：

在35℃水浴下反应过夜。反应结束后加入等体积的正丁醇抽提，取上层正丁醇相，经真空浓缩后，反应产物溶解于10μL无水乙醇中，结果用TLC检测，结果如附图4所示。

从图4中结果可以看出，含有糖基转移酶Pn50的大肠杆菌粗酶液BL21-pET28a-Pn50、含有糖基转移酶UGTPg45的大肠杆菌粗酶液BL21-pET28a-UGTPg45以及含有空载体pET28a的大肠杆菌粗酶液BL21-pET28a分别与2-OH-PPD的反应后，在TLC板上没有检测出新的产物，而含有糖基转移酶GpUGT1的大肠杆菌粗酶液BL21-pET28a-GpUGT1可以催化2-OH-PPD形成一种新的产物，即3-O-β-(D-吡喃葡萄糖基)-2-OH-PPD，其在TLC的位置如图所示。

上述结果表明，目前已知的人参和三七来源的C3位糖基转移酶均无法催化2-OH-PPD糖基化，而本发明中发现的糖基转移酶GpUGT1能有效的催化2-OH-PPD的C3位糖基化合成3-O-Glc-2-OH-PPD。因此GpUGT1是首次被发现的能以2-OH-PPD为底物催化C3糖基化修饰的糖基转移酶。

序列表

<110> 中国科学院上海生命科学研究院

<120> 绞股蓝糖基转移酶及其应用

<130> 193862

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 456

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Glu Lys Asn Val Ala Asn Ile Leu Val Phe Pro Phe Pro Ser Gln

1 5 10 15

Gly His Ile Asn Pro Leu Leu Gln Phe Ser Lys Arg Leu Ile Ala Lys

20 25 30

Gly Ile Lys Val Thr Leu Leu Thr Thr Leu His Val Ser Asn His Leu

35 40 45

Gln Leu Gln Gly Leu Ser Ser Asn Ser Val Lys Ile Glu Val Ile Ser

50 55 60

Asp Gly Ser Glu Asp Arg Gln Asp Thr Asp Thr Leu Ser Ile Thr Met

65 70 75 80

Asp Arg Phe Arg Gln Lys Met Thr Gln Asn Leu Lys Asp Phe Met Glu

85 90 95

Lys Ala Met Val Ser Gln Asn Pro Pro Lys Phe Phe Ile Tyr Asp Ser

100 105 110

Thr Met Pro Trp Ala Leu Asp Val Ala Lys Glu Phe Gly Leu Glu Arg

115 120 125

Ala Pro Ile Tyr Thr Gln Ser Cys Ala Leu Asn Ser Ile Asn Tyr His

130 135 140

Val Leu His Gly Lys Leu Lys Phe Pro Pro Glu Thr Ser Thr Ile Ser

145 150 155 160

Leu Pro Ser Met Pro Leu Leu Leu Pro Ser Asp Leu Pro Ala Tyr Asp

165 170 175

Phe Asp Pro Ser Ser Thr Glu Thr Val Ile Glu Leu Leu Thr Ser Gln

180 185 190

Tyr Ser Asn Ile Glu Asp Ala Thr Leu Leu Leu Leu Asn Thr Phe Asp

195 200 205

Lys Leu Glu Asp Gly Ile Ile Gln Trp Met Glu Ser Leu Gly Arg Pro

210 215 220

Val Lys Thr Ile Gly Pro Ile Ile Pro Ser Ala Tyr Leu Asp Gln Arg

225 230 235 240

Leu Lys Asp Asp Lys His Tyr Gly Leu Ser Leu Phe Glu Pro Lys Glu

245 250 255

Asp Ala Cys Leu Lys Trp Leu Asp Thr Lys Pro Asp Gly Ser Val Ile

260 265 270

Tyr Val Ser Tyr Gly Ser Ile Val Val Met Gly Glu Glu His Ile Lys

275 280 285

Glu Leu Ala Leu Gly Ile Lys Glu Ser Gly Lys Phe Phe Leu Trp Val

290 295 300

Val Arg Asp Thr Glu Ala Glu Lys Leu Pro Pro Asn Phe Val Glu Ser

305 310 315 320

Val Ser Glu Gln Glu Gln Gly Leu Val Val Ser Trp Cys Ser Gln Leu

325 330 335

Glu Val Leu Ala His Lys Ser Ile Ser Cys Phe Ile Thr His Cys Gly

340 345 350

Trp Asn Ser Thr Leu Glu Ala Leu Cys Leu Gly Ile Pro Met Ile Gly

355 360 365

Ile Pro Gln Trp Ala Asp Gln Ile Thr Asn Ala Lys Phe Ile Gln Asp

370 375 380

Val Trp Lys Ile Gly Ile Arg Val Lys Leu Asn Asp Gln Arg Met Ala

385 390 395 400

Thr Lys Glu Glu Ile Ser Lys Cys Ile Gly Glu Ile Met Glu Gly Glu

405 410 415

Arg Ala Glu Glu Ile Arg Lys Asn Ser Phe Glu Trp Lys Asn Arg Ala

420 425 430

Lys Glu Ala Val Asp Glu Gly Gly Ser Ser Asp Lys Asn Ile Glu Glu

435 440 445

Phe Ile Thr Met Ile Thr Gln Thr

450 455

<210> 2

<211> 1371

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggagaaaa atgttgcaaa cattctggta tttccattcc catcacaagg ccacattaac 60

cctcttcttc aattctcaaa acgtctcatc gcaaaaggaa tcaaggtaac tttgctcaca 120

actttacatg taagtaacca cttacaattg caaggtcttt cttccaattc tgttaaaatt 180

gaagttattt ccgacggctc cgaagatcgt caagataccg atactctttc gataacgatg 240

gatcgttttc gacaaaaaat gactcaaaac ttgaaagatt tcatggaaaa ggcaatggtt 300

tctcaaaatc caccaaaatt ctttatctat gattcaacaa tgccttgggc tttggatgtg 360

gctaaggaat ttggacttga aagagctcct atatacactc aatcttgtgc attaaatagt 420

ataaattatc atgttcttca tgggaaattg aagtttcctc ctgaaacttc aactatttca 480

ttgccttcta tgcctttgct tttgcctagt gatttgccag cttatgattt tgatccttct 540

tcaactgaga ctgtaattga gcttcttact agtcaatatt ccaatattga agatgcaact 600

cttctcttac tcaacacttt tgacaagttg gaggatggga taatacaatg gatggagagc 660

ctgggccgcc cagtcaaaac cataggacca attatcccat cagcatattt agaccaaagg 720

ctgaaggatg acaaacacta tggcctgagt ctattcgaac ccaaggagga tgcttgcttg 780

aaatggctag acaccaagcc agatggttca gtcatttacg tctcgtatgg tagcattgtg 840

gtgatgggag aagagcatat aaaagaacta gctttgggaa taaaagaaag tgggaaattc 900

ttcttgtggg tagtaagaga cacagaggca gaaaaacttc ctccaaactt tgtggaaagt 960

gtgagtgaac aagaacaagg gcttgtggtg agctggtgct cacagctgga agtgttggct 1020

cataaatcca tcagctgttt cattactcat tgtggttgga actcaactct tgaggcattg 1080

tgcttgggaa ttcctatgat tggaatccca caatgggctg atcaaattac caatgctaaa 1140

tttattcaag atgtttggaa aattgggata agggtgaagt tgaatgatca aagaatggct 1200

actaaagaag aaataagcaa atgcattggg gaaatcatgg agggagagag ggcggaagag 1260

attcggaaga actcattcga gtggaagaat cgggcaaaag aagccgtcga tgaaggcggc 1320

agctcggata agaacatcga ggaatttatc accatgatta ctcaaacttg a 1371

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggagaaaa atgttgcaaa ca 22

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcaagtttga gtaatcatgg tgata 25

<210> 5

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

actttaagaa ggagatatac catggagaaa aatgttgcaa aca 43

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tggtggtggt ggtgctcgag agtttgagta atcatggtga ta 42

<210> 7

<211> 1368

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atggagagag aaatgttgag caaaactcac attatgttca tcccattccc agctcaaggc 60

cacatgagcc caatgatgca attcgtcaag cgtttagcct ggaaaggcgt gcgaatcacg 120

atagttcttc cggctgagat tcgagattct atgcaaataa acaactcatt gatcaacact 180

gagtgcatct cctttgattt tgataaagat gatgagatgc catacagcat gcgggcttat 240

atgggagttg taaagctcaa ggtcacaaat aaactgagtg acctactcga gaagcaaaaa 300

acaaatggct accctgttaa tttgctagtg gtcgattcat tatatccatc tcgggtagaa 360

atgtgccacc aacttggggt aaaaggagct ccatttttca ctcactcttg tgctgttggt 420

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tctgtttcat tgccttcaat tccattgttg gggagaaatg atttgccaat tattaggact 540

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gattggatct ttttcaatac ttttgataag cttgaaaatg aggaagcaaa atggctatct 660

agccaatggc caattacatc catcggacca ttaatccctt caatgtactt agacaaacaa 720

ttaccaaatg acaaagacaa tgacattaat ttctacaagg cagacgtcgg atcgtgcatc 780

aagtggctag acgccaaaga ccctggctcg gtagtctacg cctcattcgg gagcgtgaag 840

cacaacctcg gcgatgacta catggacgaa gtagcatggg gcttgttaca cagcaaatat 900

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tctgataaga atattgatga gttcatttca aagcttgttt cctcctga 1368

<210> 8

<211> 455

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

Met Gly Val Val Lys Leu Lys Val Thr Asn Lys Leu Ser Asp Leu Leu

85 90 95

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130 135 140

Asn Ala Arg Leu Gly Lys Leu Lys Ile Pro Pro Glu Glu Gly Leu Thr

145 150 155 160

Ser Val Ser Leu Pro Ser Ile Pro Leu Leu Gly Arg Asn Asp Leu Pro

165 170 175

Ile Ile Arg Thr Gly Thr Phe Pro Asp Leu Phe Glu His Leu Gly Asn

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195 200 205

Asp Lys Leu Glu Asn Glu Glu Ala Lys Trp Leu Ser Ser Gln Trp Pro

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Tyr Ala Ser Phe Gly Ser Val Lys His Asn Leu Gly Asp Asp Tyr Met

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tctgtttcat tgccttcaat tccattgttg gggagagatg atttgccaat tattaggact 540

ggcacctttc ctgatctctt tgagcatttg gggaatcagt tttcagatct tgataaagcg 600

gattggatct ttttcaatac ttttgataag cttgaaaatg aggaagcaaa atggctatct 660

agccaatggc caattacatc catcggacca ttaatccctt caatgtactt agacaaacaa 720

ttaccaaatg acaaagacaa tggcattaat ttctacaagg cagacgtcgg atcgtgcatc 780

aagtggctag acgccaaaga ccctggctcg gtagtctacg cctcattcgg gagcgtgaag 840

cacaacctcg gcgatgacta catggacgaa gtagcatggg gcttgttaca tagcaaatat 900

cacttcatat gggttgttat agaatccgaa cgtacaaagc tctctagcga tttcttggca 960

gaggcagagg cagaggaaaa aggcctaata gtgagttggt gccctcaact ccaagttttg 1020

tcacataaat ctatagggag ttttatgact cattgtggtt ggaactcgac ggttgaggca 1080

ttgagtttgg gcgtgccaat ggtggcactg ccacaacagt ttgatcagcc tgctaatgcc 1140

aagtatatcg tggatgtatg gcaaattggg gttcgggttc cgattggtga agagggggtt 1200

gttttgaggg gagaagttgc taactgtata aaggatgtta tggaggggga aataggggat 1260

gagcttagag ggaatgcttt gaaatggaag gggttggctg tggaggcaat ggagaaaggg 1320

ggtagctctg ataagaatat tgatgagttc atttcaaagc ttgtttcctc ctga 1374

<210> 10

<211> 457

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Met Glu Arg Glu Met Leu Ser Lys Thr His Ile Met Phe Ile Pro Phe

1 5 10 15

Pro Ala Gln Gly His Met Ser Pro Met Met Gln Phe Ala Lys Arg Leu

20 25 30

Ala Trp Lys Gly Leu Arg Ile Thr Ile Val Leu Pro Ala Gln Ile Arg

35 40 45

Asp Phe Met Gln Ile Thr Asn Pro Leu Ile Asn Thr Glu Cys Ile Ser

50 55 60

Phe Asp Phe Asp Lys Asp Asp Gly Met Pro Tyr Ser Met Gln Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gly Val Val Lys Leu Lys Val Thr Asn Lys Leu Ser Asp Leu Leu

85 90 95

Glu Lys Gln Arg Thr Asn Gly Tyr Pro Val Asn Leu Leu Val Val Asp

100 105 110

Ser Leu Tyr Pro Ser Arg Val Glu Met Cys His Gln Leu Gly Val Lys

115 120 125

Gly Ala Pro Phe Phe Thr His Ser Cys Ala Val Gly Ala Ile Tyr Tyr

130 135 140

Asn Ala Arg Leu Gly Lys Leu Lys Ile Pro Pro Glu Glu Gly Leu Thr

145 150 155 160

Ser Val Ser Leu Pro Ser Ile Pro Leu Leu Gly Arg Asp Asp Leu Pro

165 170 175

Ile Ile Arg Thr Gly Thr Phe Pro Asp Leu Phe Glu His Leu Gly Asn

180 185 190

Gln Phe Ser Asp Leu Asp Lys Ala Asp Trp Ile Phe Phe Asn Thr Phe

195 200 205

Asp Lys Leu Glu Asn Glu Glu Ala Lys Trp Leu Ser Ser Gln Trp Pro

210 215 220

Ile Thr Ser Ile Gly Pro Leu Ile Pro Ser Met Tyr Leu Asp Lys Gln

225 230 235 240

Leu Pro Asn Asp Lys Asp Asn Gly Ile Asn Phe Tyr Lys Ala Asp Val

245 250 255

Gly Ser Cys Ile Lys Trp Leu Asp Ala Lys Asp Pro Gly Ser Val Val

260 265 270

Tyr Ala Ser Phe Gly Ser Val Lys His Asn Leu Gly Asp Asp Tyr Met

275 280 285

Asp Glu Val Ala Trp Gly Leu Leu His Ser Lys Tyr His Phe Ile Trp

290 295 300

Val Val Ile Glu Ser Glu Arg Thr Lys Leu Ser Ser Asp Phe Leu Ala

305 310 315 320

Glu Ala Glu Ala Glu Glu Lys Gly Leu Ile Val Ser Trp Cys Pro Gln

325 330 335

Leu Gln Val Leu Ser His Lys Ser Ile Gly Ser Phe Met Thr His Cys

340 345 350

Gly Trp Asn Ser Thr Val Glu Ala Leu Ser Leu Gly Val Pro Met Val

355 360 365

Ala Leu Pro Gln Gln Phe Asp Gln Pro Ala Asn Ala Lys Tyr Ile Val

370 375 380

Asp Val Trp Gln Ile Gly Val Arg Val Pro Ile Gly Glu Glu Gly Val

385 390 395 400

Val Leu Arg Gly Glu Val Ala Asn Cys Ile Lys Asp Val Met Glu Gly

405 410 415

Glu Ile Gly Asp Glu Leu Arg Gly Asn Ala Leu Lys Trp Lys Gly Leu

420 425 430

Ala Val Glu Ala Met Glu Lys Gly Gly Ser Ser Asp Lys Asn Ile Asp

435 440 445

Glu Phe Ile Ser Lys Leu Val Ser Ser

450 455

Claims (10)

1.一种分离的多肽，其特征在于，所述分离的多肽选自：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的多肽；

(b)将SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的且具有糖基转移酶活性的由(a)衍生的多肽；

(c)与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列有至少85％序列同一性、且具有糖基转移酶活性的由(a)衍生的多肽；和

(d)序列中含有(a)、(b)或(c)所述多肽的衍生多肽。

2.一种分离的核酸分子，其特征在于，所述分离的核酸分子选自：

(1)权利要求1所述分离的多肽的编码序列；

(2)第(1)项所述的编码序列的互补序列；

(3)与第(1)项或第(2)项所述序列具有至少90％同一性的序列；和

(4)第(1)项、第(2)项和第(3)项所述的序列的长至少15个碱基的片段或能与第(1)项、第(2)项和第(3)项所述的序列杂交的长至少15个碱基的片段；

优选地，所述编码序列如SEQ ID NO:2所示。

3.一种核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物含有权利要求2所述的核酸分子；优选地，所述核酸构建物是载体，包括克隆载体和表达载体。

4.一种宿主细胞，其特征在于，所述细胞含有权利要求2所述的核酸分子，或含有权利要求3所述的核酸构建物。

5.如权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞，包括大肠杆菌、枯草杆菌、真菌细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞和植物细胞；优选地，所述植物细胞选自绞股蓝细胞、人参细胞、西洋参细胞和三七细胞。

6.权利要求1所述的分离的多肽、权利要求2所述的分离的核酸分子、权利要求3所述的核酸构建物或权利要求4或5所述的宿主细胞在合成四环三萜类化合物中的应用，或在制备合成四环三萜类化合物用的试剂中的应用；优选地，所述四环三萜类化合物为C-3位羟基糖基化的四环三萜类化合物；优选为C-3位羟基糖基化的S构型或R构型的达玛烷型、羊毛脂烷型、甘遂烷型、环阿屯烷型、apotirucallane型、葫芦烷和楝烷型的四环三萜类化合物，更优选为选自C-3位羟基糖基化的2-羟基原人参二醇、原人参二醇、原人参三醇、达玛烯二醇、人参皂苷F1和人参皂苷CK的四环三萜类化合物。

7.一种酶制品，其含有权利要求1所述的分离的多肽，或为权利要求4或5所述宿主细胞的裂解液的上清液或其浓缩物。

8.一种体外糖基化方法，其特征在于，所述方法包括：混合糖基供体、四环三萜类化合物和权利要求1所述的多肽或权利要求7所述的酶制剂，在允许所述多肽将糖基供体的糖基转移到四环三萜类化合物的C-3位羟基的条件下进行反应；优选地，所述四环三萜类化合物选自S构型或R构型的达玛烷型、羊毛脂烷型、甘遂烷型、环阿屯烷型、apotirucallane型、葫芦烷和楝烷型的四环三萜类化合物；更优选地，所述四环三萜类化合物选自2-羟基原人参二醇、原人参二醇、原人参三醇、达玛烯二醇、人参皂苷F1和人参皂苷CK。

9.权利要求1所述多肽的制备方法，其特征在于，所述方法包括：

(a)在适合表达的条件下，培养权利要求4或5所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出所述多肽。

10.一种产生转基因植物的方法，其特征在于，所述方法包括将表达权利要求1所述多肽、或含有权利要求2所述核酸分子、或含有权利要求3所述核酸构建物的载体遗传工程化的植物细胞再生为植株的步骤；优选地，所述植物细胞为绞股蓝细胞、人参细胞、西洋参细胞和三七细胞，所述植株为绞股蓝、人参、西洋参和三七。

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