CN111918641A - 包括中和步骤的制备具有透明质酸基的填充剂的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有透明质酸的填充剂的制备方法，所述具有透明质酸的填充剂具有随着时间推移改善的化学物理稳定性和对于皮肤注射最佳的粘度特性。特别地，所述方法包括，透明质酸被交联的第一步和用于中和及水合交联透明质酸的后续步骤。

Description

包括中和步骤的制备具有透明质酸基的填充剂的方法

技术领域

本文所述的实施例涉及一种制备具有透明质酸基的填充剂的方法，所述具有透明质酸的填充剂具有随着时间推移改善的化学和物理稳定性以及经皮肤注射的最佳粘弹性。

特别地，根据本文描述的实施例的方法涉及一种制备具有透明质酸基(HA)的填充剂的方法，该方法包括：使透明质酸发生交联的第一步，以及用于中和并水合该交联的透明质酸的随后步骤。

背景技术

众所周知，透明质酸是人类和其他哺乳动物结缔组织的基本成分之一。它是人体表皮、上皮和神经组织中广泛存在的一种物质。

透明质酸赋予皮肤独特的抵抗力和保形性。缺乏透明质酸会导致皮肤衰弱，促进皱纹和瑕疵的形成。

随着年龄的增长，人体组织中透明质酸的浓度趋于降低，从而削弱了其组织修复功能。随着逐渐衰老并反复暴露于紫外线下，表皮细胞减少了透明质酸的产生，并且衰老速度增加。同时，皮肤失去胶原蛋白，胶原蛋白是维持皮肤年轻、富有弹性的形式所必需的另一种天然物质。随着时间的流逝，表皮组织中透明质酸和胶原蛋白的丢失会导致褶皱和皱纹的形成。

从化学角度来看，透明质酸(HA)是高分子化合物，可定义为具有未分支的多糖链的糖胺聚糖，是由数千个二糖单元缩合产生的，而二糖单元又由葡萄糖醛酸和M-乙酰氨基葡萄糖的残基形成。

由于其在水中的高度溶解性，与透明质酸相对应的盐分子，即透明质酸盐，能够与许多水分子络合，从而达到高度水合的程度。

此外，通过使用特定的交联剂和合适的操作工艺条件(温度、pH等)，透明质酸分子的极长长度及其高度水合度使分子能够自我组织以形成网格状的结构(交联透明质酸)，以创建分子骨架以维持表皮组织的形状和硬度。

近年来，已开发出多种基于透明质酸的制剂用于美容应用，以填充皱纹、褶皱和疤痕，总体上改善脸部外观或填充嘴唇。

因此，从工业研究的观点来看，这些制剂正在持续发展，从商业的观点来看是非常有吸引力的。人体天然含有的透明质酸是一种被表皮组织良好耐受的填充剂。由于这个原因，基于HA的制剂今天仍然被认为是市场上最好的表皮填充剂，因为它们没有皮肤过敏反应的风险。

最初，基于透明质酸的第一种制剂以悬浮在凝胶中的颗粒或微球形式制备。然而，这些基于胶凝微球的填充剂具有随时间推移稳定性差的缺点，在注入皮肤后数月趋于化学降解。因此，随着时间的推移，需要频繁地重新注入填充剂，以维持修复和表皮生长的恒定。

近来已经发现通过使用特定的交联剂使透明质酸经历合适的交联步骤的优点，因此基于交联透明质酸的填充剂被用于面部的美容治疗中。在这种情况下，透明质酸的聚合物链彼此连接以构成网格。

作为最常用的交联剂的例子，我们可以举出1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)、1,2-乙二醇二缩水甘油醚(EDDE)、二环氧辛烷和二乙烯基砜。交联步骤允许获得水凝胶聚合物网格，其与基于非交联的透明质酸的制剂相比，水凝胶聚合物网格在水中的溶解度较小并且对降解的抵抗力更强，从而不需要频繁的皮肤注射。

然而，在使透明质酸与化学中和溶液接触的步骤中，使用所述交联剂形成交联的HA水凝胶，其具有过度的网格溶胀水平。

此外，由现有技术中交联操作条件引起的重要缺点在于，基于交联HA的填充剂的形成，其聚合物网格内部的化学-物理参数(温度、粘度、密度等)的分布均匀性差。从某种意义上说，结构的均匀性被空气微气泡和材料团块(即增厚材料的狭窄区域)的有害存在所阻碍。

HA网格内部化学物理参数缺乏均一性会对所制备的填充剂的化学物理稳定性产生负面影响，因此其有效性随时间推移不尽人意，因此必须相当频繁地向皮肤重新注入填充剂。

由于这些缺点，需要在美容医学领域，提供一种新颖的制备具有透明质酸基的填充剂的方法，该方法能够随着修复行为时间推移，而增加其化学物理稳定性和持续时间。

因此，需要对制备具有透明质酸基的填充剂的方法进行完善，使得该方法可以克服现有技术的缺点。

特别地，本发明的主要目的在于提供一种基于具有更好的不同化学物理参数的均匀性/均一性的透明质酸的制剂，从而在该制剂被用作美容填充剂后，随着时间的推移增加其稳定性。

根据本发明方法的第二个目的是通过控制限定透明质酸交联及随后的水合步骤的参数，获得具有在所需范围内粘弹性可调节的交联HA的填充剂。

本发明的另一个目的是通过在中和步骤中选择创新的操作条件，来提高在透明质酸交联之后的化学中和步骤中中和溶液的渗透效率。

申请人已经设计、测试和实施了本发明，以克服现有技术的缺点并实现这些以及其他目的和优点。

发明内容

在独立权利要求中阐述和表征了本发明，而从属权利要求描述了本发明的其他特征或主要发明构思的变型。

本文所述的实施方案涉及一种制备透明质酸(HA)基填充剂的方法，该方法包括使透明质酸交联的步骤，以及用于中和和水合交联透明质酸的随后步骤。

所要求保护方法的主要优点是所使用的操作条件允许获得具有透明质酸基制剂，该制剂具有关于内部不同化学物理参数(组成、温度、粘度等)的均一性和均匀性的创新性和改进性。上述优点将在下文中详细描述。因此，在皮肤注射后，其随时间的化学-物理稳定性大大提高。

本发明的第一方面涉及一种制备具有透明质酸基填充剂的方法，该方法包括通过以下步骤使透明质酸交联：

A₁)在配备有混合器的反应室中混合以下成分：水、透明质酸(HA)、选自聚乙二醇(PEG)类的交联剂和碱金属氢氧化物溶液；

A₂)将由此获得的混合物分成n个部分，将所述部分转移到n个的容器系列中，以对其进行超声处理，部分和容器的数量n在4-32之间，优选在8-20之间；

A₃)将包含这些部分混合物的n个容器在培养箱中放置4-8小时的时间，以终止透明质酸的交联并促进交联透明质酸凝胶的形成。

在上述步骤A₁)、A₂)及A₃)中采用的特定操作条件，特别是使用选自聚乙二醇的交联剂以及将反应混合物分为n个部分(步骤A₂)使得以凝胶形式的透明质酸HA网格的形成，相对于现有技术而言，具有创新性。实际上，在随后的中和和水合步骤中，这种透明质酸网格的溶胀程度要低得多。

本发明的实施方案还涉及在从上述交联步骤中获得的透明质酸凝胶的化学中和过程中限定最佳操作条件。

因此，制备透明质酸基填充剂的方法是本发明的第二方面，其包括以下步骤：

A)通过在反应室中混合以下成分来使透明质酸交联：水、透明质酸(HA)、选自聚乙二醇(PEG)类的交联剂及碱金属氢氧化物溶液，混合时间为10-40分钟；

B)步骤A)中获得的交联HA凝胶的化学中和步骤，包括：

B₁)通过混合以下成分来制备中和溶液：水、盐酸HCl、缓冲剂、任选的利多卡因或其衍生物；

B₂)将由此获得的混合物分成n个部分，将这些部分转移到包含从步骤A)获得的交联HA凝胶的n个容器内，其中n是在4-32之间的整数，优选在8-20之间；

B₃)通过旋转装置使n个容器混合，使它们绕旋转装置的轴线旋转，以促进中和溶液渗透到透明质酸凝胶内部，得到水凝胶形式的交联透明质酸填充剂。

在中和步骤B)中采用的特定操作条件，特别是将中和溶液分成n个部分(步骤B2)，以及随后在步骤B3)中对n个容器进行的缓慢旋转,提高中和溶液在交联HA凝胶内部的渗透效率。因此，获得的填充剂内部的化学物理参数的均匀性和均一性得到改善。

本发明的第三方面还涉及制备透明质酸基填充剂方法的具体实施方式，该方法包括：

A)透明质酸的交联步骤，包括以下步骤：

A₁)在反应室中将以下成分(w/w)混合10-40分钟：

25-60％的水；

6-18％的透明质酸；

25-6％的碱金属氢氧化物溶液；

0.5-4％的选自聚乙二醇类的交联剂；

A₂)将由此获得的混合物分成n个部分，将所述部分转移至n个容器的系列中，以对其进行超声处理，部分和容器的数目n在4-32之间；

A₃)将包含这些部分混合物的n个容器放入培养箱中4-8小时；

B)步骤A)中获得的交联HA凝胶的化学中和步骤，包括以下步骤：

B₁)通过混合以下成分(w/w)来制备中和溶液：

78-98％的水；

4-25％的盐酸；

0.1-1.5％的缓冲剂；

高达1.5％的利多卡因或其衍生物；

B₂)将由此获得的所述中和溶液分成n个部分，并将所述部分转移到包含步骤A)获得的所述交联HA凝胶的所述n个容器内，其中n是4-32之间的整数；

B₃)通过旋转装置使所述n个容器发生混合，使它们绕旋转装置的轴线旋转，以促进所述中和溶液渗透到所述透明质酸凝胶内部，得到水凝胶形式的交联透明质酸填充剂。

除了其内部不同化学物理参数(组成、粘度等)的均一/均匀程度相关的优点以及随之而来的其化学物理稳定性的暂时提高外，根据此处所述实施例的方法允许适当地调节所制备填充剂的最终粘弹性。

实际上，从热力学观点来看，控制交联参数和随后的凝胶水合步骤使产物稳定，从而也调节并保持了产物的流变性。在非常粘稠的填充剂的情况下，对透明质酸填充剂的最终粘弹性的调节使得能够选择最适合粘性流体的注射器类型，从而可以进行皮肤注射而没有与高粘度相关的特殊缺点。

本发明的实施方案还涉及在透明质酸凝胶化学中和步骤中利多卡因或其衍生物作为麻醉剂的应用。

因此，本发明的另一方面是一种用透明质酸基制备填充剂的方法，该方法包括以下步骤：

A)通过在反应室中混合以下成分使透明质酸交联：水，透明质酸(HA)，碱金属氢氧化物溶液，选自聚乙二醇二缩水甘油醚(PEGDE)，聚丙二醇二缩水甘油醚(PPGDE)和聚丁二醇二缩水甘油醚的交联剂，混合时间为10-40分钟；

B)中和步骤，其中使由交联步骤A)获得的交联HA凝胶与中和溶液接触。中和溶液包含流动成分：水、盐酸HCl、缓冲剂、利多卡因或其起麻醉剂作用的衍生物。

参考以下描述、附图和所附权利要求，将更好地理解本公开的这些和其他方面的特征和优点。被整合并构成本说明书一部分的附图示出了本发明的实施方式的某些形式，其与说明书一起，旨在描述本公开的原理。

在可能的情况下，本说明书中描述的各个方面和特征可以单独应用。这些单独的方面，例如所附从属权利要求中描述的方面和特征，可以是分案申请的对象。

可以理解，在专利申请过程中发现的任何已知方面或特征都不应主张，应作为免责声明的对象。

具体实施方式

现在我们将详细参考用于制备透明质酸基(HA)填充剂方法的具体实施方案，该方法提供了交联A)和中和B)的步骤。

每个实施例都是通过举例说明本发明的方式提供的，不应理解为对本发明的限制。

在描述这些实施例之前，我们必须澄清这里使用的措词和术语仅出于描述的目的，不能被认为是限制性的。

除非另有说明，否则所有指示的百分数和比例均涉及总组合物的重量(w/w)。除非另有说明，否则此处报告的所有百分比间隔均相对于规定的总组合物的总和为100％。

除非另有说明，否则报告的所有间隔都应理解为包括极限值，包括显示两个值之间间隔的极限值。

除非另有说明，否则本说明书还包括源自将所描述的两个或更多个间隔合并或重叠的间隔。

除非另有说明，否则本说明书还包括在不同点选取的两个或更多个值的组合得出的间隔。

这里描述的实施方案涉及具有透明质酸基的填充剂的制备，该透明质酸基的填充剂可以用于脸部的美容处理，特别是用于填充皱纹、褶皱和疤痕，通常改善脸部的外观。

如我们所说，交联步骤A)是通过选自聚乙二醇(PEG)的交联剂进行的。特别地，交联步骤A)包括一系列至少三个步骤A₁)、A₂)和A₃)。

子步骤A₁)涉及在反应室中混合以下成分：水、透明质酸(HA)、选自聚乙二醇类(PEG)的交联剂和碱金属氢氧化物溶液。

上述成分的混合步骤A₁)在10℃-30℃之间，优选在15℃-25℃之间的温度下进行，混合时间方便地在10-40分钟之间，优选在15-25分钟之间。

关于混合物的具体组成，各个成分相对于混合物总重量的重量百分比(w/w)可以如下：

25-60％的水；

6-18％透明质酸(HA)，

25-60％的碱金属氢氧化物溶液，

0.5-4％的选自聚乙二醇(PEG)类型的交联剂。

优选但非必须地，所示成分的混合步骤A₁)可以在两个连续的步骤中进行。在第一步中，我们将水、过量提供的透明质酸(HA)和聚乙二醇进行初步混合，混合时间保持在2-6分钟之间。

在这段时间之后，将碱金属氢氧化物，优选氢氧化钠NaOH的溶液添加到所获得的混合物中，并且成分的混合持续进行8-25分钟，优选地10-20分钟的时间。

在各种PEG类化合物中，已经注意到，就制备的HA填充剂的粘弹性而言，通过使用在聚合物链末端具有两个环氧基的双官能团PEG作为交联剂可获得最佳结果。其中我们可以列举，例如聚乙二醇二缩水甘油醚(PEGDE)、聚丙二醇二缩水甘油醚(PPGDE)和聚丁二醇二缩水甘油醚。

在随后的步骤A₂)中，将获得的混合物分成n个部分，其中n是4-32之间，优选8-20之间的整数。将这些部分的混合物转移并加入至n个容器的系列中，对它们进行超声处理。

n个容器的超声处理是通过频率在40-60kHz之间的声波进行的。

此外，超声处理的步骤A₂)通常在20℃-30℃的温度下持续进行5-15分钟。

具有上述操作条件的超声处理被证明对于从混合物中分离和去除在混合步骤中可能形成的空气微气泡特别有效。空气微泡代表所获得的制剂内部材料的不连续区域，因此，它们的存在会损害所制备填充剂的最终粘弹性。

在超声处理之后，将包括n个部分混合物的n个容器放置在培养箱内，以完成透明质酸和聚乙二醇之间的交联反应，即，进行根据本说明书方法的步骤A₃)。将温度设定为介于25℃-35℃之间的恒定值，将n个容器在培养箱内放置4-8小时，优选5-7小时的时间。在这段时间之后，可以将透明质酸的交联定义为完成，以便在每个容器内获得交联的透明质酸凝胶。

交联步骤A)由于存在强碱例如氢氧化钠而在碱性环境中进行：因此，在交联结束时，获得pH值为10-14的凝胶形式的透明质酸。

具有这些基本特性，所获得的胶凝制剂绝对不能用于美容治疗，因为它不仅会引起热力学不稳定，还会引起皮肤肿胀和灼伤。实际上，在pH值高于8时，很可能发生水解现象，这会导致透明质酸水凝胶化学结构的降解。

因此，需要在后续步骤B)中使用强酸如盐酸中和HA凝胶。

如前所述，中和步骤B)还包括一系列子步骤B₁)、B₂)和B₃)。

在步骤B₁)中，通过混合以下成分来制备中和溶液：水、盐酸HCl和缓冲剂。各个成分相对于中和溶液总重量的重量百分比(w/w)如下：

78-98wt.％的水；

4-25wt.％的盐酸；

0.1-1.5wt.％的缓冲剂。

作为步骤B1)中的缓冲剂，可以使用磷酸、磷酸钾、磷酸钠。优选地，使用磷酸。

根据一个优选的实施方案，中和溶液还可以任选地包含少量的利多卡因或其衍生物，优选地使用盐酸利多卡因。这类化合物因其局部麻醉作用而闻名，因此它们具有在皮下注射HA填充剂期间减少皮肤瘙痒或灼伤的优点。在这种情况下，相对于溶液的总重量，利多卡因或其衍生物的重量百分比(w/w)通常保持在1.5％以下。

根据另一个优选的实施方案，中和溶液还可任选地包含少量的甘氨酸和/或脯氨酸。这两种氨基酸的存在已被证明是有利的，因为它们具有充当溶液的热力学稳定剂以及作为形成胶原前体的双重功能，从而提高了制备填充剂修复组织的效率。

同样在这种情况下，脯氨酸和/或甘氨酸的总重量百分比(w/w)相对于中和溶液的重量通常保持在1％以下。

根据本发明，便于以与步骤A2)中相同的方式将中和溶液分成(步骤B₂)n个部分，n是4-32之间的整数，优选在8-20之间。

然后将中和溶液的部分n转移到包含从步骤A)获得的交联HA凝胶的n个容器中。

然后，我们进行到步骤B₃)，该步骤包括使用旋转设备混合n个容器中的反应物：将n个容器绕旋转设备的轴线缓慢旋转140-200小时。

在混合步骤B3)期间，将温度保持在20℃-30℃之间，将n个容器围绕旋转装置轴线的旋转速度保持在相当低的值，通常在40-60rpm之间。

上述特定的混合方法，在有限质量的内部中，促进了中和溶液在n个容器中所含交联透明质酸凝胶内部的均匀渗透。

在盐酸作用下进行化学中和的同时，水分子也有效渗入了凝胶化的透明质酸网格的网孔内：因此，交联HA凝胶发生了明显的水合作用，结果形成了水凝胶。实际上，HA网格的网孔由于水分子的渗透而溶胀，网格的溶胀程度由术语“溶胀”表示。

实验已经证明，如根据本说明书方法所述，使用选自聚乙二醇交联剂使得在凝胶中和和水合步骤B)中凝胶HA网格的溶胀度较低。

由步骤B)获得的交联透明质酸水凝胶填充剂的复数粘度可以在15-45Pa*s之间(通过Kinexus流变仪在25℃下测量)。

然后对步骤B)中获得的水凝胶形式的HA填充剂进行pH控制，以验证已发生的化学中和的有效性。因此，n个容器内的pH值必须为中性，即在6.5～7.5的范围内。

最后，在pH控制测试之后，通过本文所述方法制备的交联HA水凝胶填充剂适合被插入注射器的药筒内。

在使用之前，填充剂存储药筒必须在高压釜中进行灭菌。高压釜灭菌在121℃的温度下进行16分钟。

综上所述，与常规的基于交联透明质酸制剂的制备方法相比，根据本文所述的实施方案的方法允许制备具有以下优点的交联HA填充剂：

1)关于填充剂内部不同化学物理参数(组成、温度、粘度等)的均匀性和均一性的创新和改进特性。因此，在皮肤注射后，其随时间的化学-物理稳定性显著提高。

2)通过选择方法步骤A)和B)中适当的操作条件来调节填充剂的最终粘弹性。以此方式，获得了填充剂期望的流变性能，从而可以根据要注入的填充剂的粘度选择最合适的用于皮下注射的注射器的类型。

3)使用根据本说明书选自聚乙二醇的交联剂涉及在凝胶的中和和水合步骤B)中HA凝胶状网格较低程度的溶胀。较低程度的网格溶胀是期望的，因为它可以控制和限制皮下注射步骤中的过度溶胀。

4)在中和步骤B)中采用的特定操作条件提高了中和溶液渗透到交联HA凝胶内部的效率。该方面也有助于改善所获得的填充剂内部化学物理参数的均匀性和均一性。

同样显而易见的是，尽管已经参照如上所述的交联步骤A)和中和步骤B)的实施例描述了根据本发明的方法，但是本领域技术人员当然应当能够实现许多具有权利要求书中所述特征的方法的其他等效形式，因此上述等效形式均落入所定义的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种制备具有透明质酸基的填充剂的方法，包括以下步骤：

A)通过在反应室中混合以下成分使透明质酸交联：水，透明质酸(HA)，碱金属氢氧化物溶液，选自聚乙二醇二缩水甘油醚(PEG DE)、聚丙二醇二缩水甘油醚(PPG DE)和聚丁二醇二缩水甘油醚，混合时间为10至40分钟；

B)中和步骤，在所述中和步骤中，使从所述交联步骤A)获得的所述交联HA的凝胶与包含以下成分的中和溶液接触：水，盐酸HCl，缓冲剂，以及作为麻醉剂的利多卡因或其衍生物。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述交联步骤A)中，对所述反应混合物进行5至15分钟的超声处理。

3.如前述权利要求中的任一项所述的方法，其特征在于，步骤A)中的所述超声处理是通过频率在40-60kHz之间的声波进行的。

4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，在所述交联步骤A)结束时，以pH为10至14的凝胶形式获得透明质酸。

5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，在所述步骤B)中，各个成分相对于所述中和溶液的总重量的重量百分比(w/w)如下：

78-98％的水；

4-25％的盐酸；

0.1-1.5％的缓冲剂；

高达1.5wt.％的利多卡因或其衍生物。

6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，在所述中和步骤B)中使用的所述麻醉剂是盐酸利多卡因。

7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，步骤B)中的所述缓冲剂选自磷酸、磷酸钾、磷酸钠。

8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，步骤B)中的所述中和溶液还包含：相对于所述溶液重量的总重量百分比(w/w)为小于1％的甘氨酸和/或脯氨酸。

9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，对步骤B)中获得的所述交联HA的水凝胶填充剂进行pH控制，以检查其值是否在6.5至7.5之间。

10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，在检查pH后，将所述透明质酸的水凝胶填充剂插入注射器的药筒内，所述药筒在121℃的高压釜中灭菌16分钟。