CN111905096A - 用于维持最佳体重和血糖的新的多肽激素的鉴定 - Google Patents

用于维持最佳体重和血糖的新的多肽激素的鉴定 Download PDF

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Abstract

本公开内容的实施方案涉及与在有此需要的个体中增加或降低体重(包括，例如通过增加或降低脂肪量)有关的方法和组合物。此类方法和组合物，特别是实施方案，涉及在脂肪量不足的个体中提供有效量的激素“白色脂肪肽”(asprosin)以增加脂肪量，和在具有肥胖症或糖尿病的个体中提供白色脂肪肽的抗体或抑制剂，例如以降低脂肪量。

Description

用于维持最佳体重和血糖的新的多肽激素的鉴定
本申请是申请日为2014年11月24日、申请号为201480072161.X、发明名称为“用于维持最佳体重和血糖的新的多肽激素的鉴定”的发明专利申请的分案申请。
本申请要求2013年12月2日提交的美国临时申请系列号61/910,498，和2014年6月11日提交的美国临时申请系列号62/010,557，和2014年8月15日提交的美国临时申请系列号62/037,779，和2014年10月31日提交的美国临时申请系列号62/073,501的优先权，所有这些申请通过提及而以其整体合并入本文。
技术领域
本公开内容的实施方案至少包括细胞生物学、分子生物学、内分泌学和医学的领域。
发明背景
美国医学协会(American Medical Association)在2013年将肥胖归类为一种疾病(Morgen&Sorenson,2014)，并且作为世界范围内的一个主要的可预防的死亡原因，对其遗传和分子基础的更清楚的理解从未更加重要过(Morgen&Sorenson，2014；Malik等人,2013)。肥胖症是由能量摄入和输出之间的不平衡而引起的(Spiegelman等人,2001；Spiegelman等人,1996)。由于影响这两个过程的器官的数目和能量内环境稳定的复杂性，肥胖症的研究依然是一项重大的科学挑战(Spiegelman等人,2001)。历史上，极度人类变异的研究一直是用于解决复杂的生物学问题和用于开发针对疾病的治疗靶标的有力工具(Goldstein等人,2009；Friedman等人,2009)。本公开内容将负责脂肪量的维持和相关的血糖控制的新的循环多肽激素的丧失描述为驱动在人类中的称为新生儿早老样综合征(Neonatal Progeroid Syndrome，NPS)的极度消瘦病症的表型的分子机制(Hou等人,2009；O’Neill等人,2007)。
发明概述
本公开内容的实施方案涉及影响个体体重的方法和组合物，其中某些组合物可用于增加个体体重，而某些组合物可用于降低个体体重。虽然体重的减轻或增加可以通过任何合适的手段，但是在特别的实施方案中，体重的减轻或增加是由于相应的脂肪量的丧失或增加而引起的。增加其体重的个体可以至少部分地通过增加其食欲来做此事，虽然在某些实施方案中其体重增加而不增加其食欲。
本公开内容的实施方案包括这样的方法和组合物，其包括原纤蛋白-1(Fibrillin-1)的C-末端片段(在本文中称为“白色脂肪肽”(asprosin))，或者其功能性片段或功能性衍生物。在特别的实施方案中，白色脂肪肽(例如，循环白色脂肪肽)的增加对于增加个体体重来说是有用的，而白色脂肪肽的降低对于降低个体体重来说是有用的。
在特别的实施方案中，向需要增长体重(包括需要增长脂肪量)的个体提供白色脂肪肽或者其功能性片段或功能性衍生物。这样的个体可以由于下述原因而需要增长体重：他们具有阻止他们增长体重或保持体重的医学病况；和/或他们由于其他原因(例如，天生地体重过轻或由于外部原因)而不能或未增长或保持体重。在特别的实施方案中，所述医学病况是由于在所述个体中的一个或多个遗传缺陷而引起的。在某些实施方案中，所述医学病况包括恶病质作为症状。
在某些实施方案中，个体需要减轻体重，并因此向其提供有效量的在所述个体中的天然的白色脂肪肽的抑制剂。所述抑制剂可以是任何类型的，但是在特别的实施方案中，所述抑制剂为抗体或小分子，包括例如靶向在白色脂肪肽的N-末端、白色脂肪肽的C–末端或白色脂肪肽的内部区域上的表位的小分子。
在本公开内容的实施方案中，个体需要改善葡萄糖控制，并因此向其提供有效量的在所述个体中的天然的白色脂肪肽的抑制剂。所述抑制剂可以是任何类型的，但是在特别的实施方案中，所述抑制剂为抗体或小分子，包括例如靶向在白色脂肪肽的N-末端、白色脂肪肽的C–末端或白色脂肪肽的内部区域上的表位的小分子。这样的个体可以是任何类型的，但是在特别的实施方案中，所述个体是糖尿病患者、前驱糖尿病患者(其中的任一个可以通过空腹血浆葡萄糖测试、口服葡萄糖耐量测试和/或血红蛋白A1C测试来测定)、胰岛素抵抗性患者等。在特别的实施方案中，向血糖过多和胰岛素抵抗性的个体提供有效量的一种或多种白色脂肪肽抑制剂。在某些实施方案中，当个体需要改善血糖控制时，向所述个体提供有效量的白色脂肪肽抑制剂，并且所述白色脂肪肽抑制剂是特别地为了这样的改善而给予所述个体的。
本公开内容的实施方案包括食欲刺激药，其包含白色脂肪肽或者其功能性片段或功能性衍生物。本公开内容的实施方案还包括食欲遏抑药，其包含一种或多种白色脂肪肽抑制剂。
在一个实施方案中，存在重组的白色脂肪肽多肽或者其功能性衍生物或功能性片段。在一个特别的实施方案中，所述白色脂肪肽多肽包含SEQ ID NO:1的序列。在特别的实施方案中，所述多肽被包含在药学上可接受的载体中。在特别的实施方案中，所述其功能性衍生物或片段相比于SEQ ID NO:1而言包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个或者更多个氨基酸改变。在特别的实施方案中，所述其功能性衍生物或功能性片段可以包含SEQ ID NO:1的N-末端截短，并且在某些实施方案中，所述截短可以不多于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个氨基酸，或者所述截短为至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个氨基酸。在某些实施方案中，所述其功能性衍生物或功能性片段包含SEQ ID NO:1的C-末端截短，例如，其中所述截短不多于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个氨基酸，或者所述截短为至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个氨基酸。在一些实施方案中，所述其功能性衍生物或功能性片段包含在SEQ ID NO:1中的内部缺失，例如，不多于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个氨基酸或者为至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个氨基酸的内部缺失。在一些情况下，所述白色脂肪肽的其功能性衍生物或片段可以包含与SEQ IDNO:1至少70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一的序列。在特别的实施方案中，所述多肽是经标记的。
在一个实施方案中，存在调节个体体重的方法，所述方法包括调节所述个体中天然的白色脂肪肽的水平的步骤。在一个特别的实施方案中，当所述个体的体重不足时，增加天然的白色脂肪肽的水平。在一个特别的实施方案中，当所述个体的体重过量时，降低天然的白色脂肪肽的水平。在特别的情况下，天然的白色脂肪肽的水平通过调节白色脂肪肽的转录来进行调节，和/或通过调节白色脂肪肽的翻译来进行调节。在特别的实施方案中，天然的白色脂肪肽的水平通过调节白色脂肪肽从细胞中的分泌来进行调节，和/或通过调节白色脂肪肽的稳定性来进行调节。
在一个实施方案中，存在增加个体体重的方法，所述方法包括向所述个体提供有效量的任何在本文中所考虑的多肽的步骤。在一个特别的实施方案中，所述个体的食欲水平得到增加。
在一个实施方案中，存在降低个体体重的方法，所述方法包括向所述个体提供有效量的白色脂肪肽的抑制剂的步骤。在一个特别的实施方案中，所述抑制剂为抗体，虽然它可以是小分子。
在一个实施方案中，存在降低个体的血液中的葡萄糖水平的方法，所述方法包括向所述个体提供有效量的白色脂肪肽的抑制剂的步骤。
在一个实施方案中，存在增加个体的血液中的葡萄糖水平的方法，所述方法包括向所述个体提供有效量的任何在本文中所考虑的多肽的步骤。
在一个实施方案中，存在包含任何在本文中所考虑的多肽的试剂盒，其中所述多肽储藏在合适的容器中。
在一个实施方案中，存在刺激个体食欲的方法，所述方法包括向所述个体提供有效量的任何在本文中所考虑的多肽的步骤。
在某一个实施方案中，存在任何在本文中所考虑的多肽的抑制剂。
前述内容相当宽泛地概述了本发明的特征和技术优点，以便可以更好地理解随后的对于本发明的详细描述。本发明的额外的特征和优点将会在下文中进行描述，其构成了本发明的权利要求的主题。本领域技术人员应当意识到，所公开的概念和具体的实施方案可以容易地用作用于改进或设计用于实现本发明的相同目的的其他结构的基础。本领域技术人员还应当认识到，此类等价的构架没有背离在所附的权利要求书中所示的本发明的精神和范围。被认为对于本发明来说特征性的新的特征(关于其组织和操作方法这两方面)与进一步的目标和优点一起将会从下面的描述中更好地得到理解，当连同所附随的图一起进行考虑时。然而，清楚地理解，所述图中的每一个仅仅是为了举例说明和描述的目的而提供的，而并不意欲作为本发明的界限的限定。
附图简述
图1A-1D：新生儿早老样综合征产生自在FBN1的3’末端处的从新的、杂合的、截短性的突变。a，两名显示出相关的脂肪营养不良的NPS患者的代表性图像，所述脂肪营养不良主要影响脸和四肢，而放过了臀部区域。b，两名NPS患者的FBN1突变、体重指数(BMI)和家族谱系。c，在本公开内容的两名NPS患者和来自发表的病例报告的五名NPS患者中的3’FBN1突变。患者#2还具有在FBN1中的杂合的错义突变(c.8222T>C)，其被预测为良性的并且为了清楚目的而未在该图中指出。d，所有七个NPS突变簇集在弗林蛋白酶切割位点(以红色显示的RGRKRR基元)周围并且被预测导致所有的或大多数的C-末端多肽(其在RGRKRR基元之后以黑色显示)的杂合切除。由于移码而添加上的非天然氨基酸以蓝色显示。野生型(WT)序列作为参照而给出。
图2A-2C：FBN1在白色脂肪组织中高度和动态地表达。a，通过定量聚合酶链式反应，在小鼠的白色脂肪组织、褐色脂肪组织和骨骼肌(每组中，n＝5)中测量FBN1表达。b，通过定量聚合酶链式反应，在经历了持续7天的脂肪形成性分化的人的前脂肪细胞中测量FBN1表达。作为脂肪形成性分化的标志物，显示了CEBPα表达。c，通过定量聚合酶链式反应，在来自经历正常食物或10周高脂肪饮食的雄性WT小鼠的腹股沟白色脂肪组织中测量FBN1表达(每组中，n＝5)。数据呈现为平均值±SEM。使用非成对Student’s t检验来评价统计学显著性。＊P<0.05，＊＊P<0.01，和＊＊＊P<0.001。
图3A-3D：白色脂肪肽是原纤蛋白-1的高度保守的、循环性的C-末端切割产物。a，通过使用UCSC基因组浏览器描绘了人FBN1基因及其进化保守性。白色脂肪肽编码区加有框。b，通过使用UCSC基因组浏览器描绘了外显子65和66的放大视图，所述外显子65和66为白色脂肪肽编码区做出贡献。c，在来自经历正常食物或8周高脂肪饮食的14周龄WT小鼠或者来自对于自发的瘦蛋白突变(称为ob)来说杂合或纯合的8周龄雄性小鼠的血浆上进行针对白色脂肪肽的Western印迹分析。d，在来自肥胖的人或正常体重的对照受试者的血浆上进行针对白色脂肪肽的Western印迹分析。
图4A-4H：白色脂肪肽在体外挽救与NPS相关的脂肪形成性分化缺陷。a，通过定量聚合酶链式反应，在来自经历了持续7天的脂肪形成性分化的NPS患者(突变体)或未患病对照受试者(WT)的人真皮成纤维细胞中测量数种脂肪形成的早期和晚期标志物的表达。b，表达WT原纤蛋白-1(WT FBN1)、没有信号肽的白色脂肪肽(FBN1 CT)和附着有信号肽的白色脂肪肽(FBN1 CTSP)的表达构建体的动画描绘，所有都在CMV启动子的控制之下。具有27个氨基酸的天然原纤蛋白-1信号肽以红色显示。c，在来自WT人真皮成纤维细胞的细胞培养基上进行针对白色脂肪肽的Western印迹分析，所述WT人真皮成纤维细胞暴露于持续7天的脂肪形成性诱导并且同时暴露于驱动WT原纤蛋白-1(WT FBN1)、没有信号肽的白色脂肪肽(FBN1CT)和附着有信号肽的白色脂肪肽(FBN1 CTSP)或者作为对照的绿色荧光蛋白(GFP)的表达构建体。d，通过定量聚合酶链式反应，在来自经历了持续7天的脂肪形成性分化而同时暴露于驱动WT原纤蛋白-1(WT FBN1)或GFP的表达构建体的NPS患者(突变体)或未患病对照受试者(WT)的人真皮成纤维细胞中测量脂肪形成的早期标志物(CEBPα)和晚期标志物(AP2)的表达。显示了在“突变体+GFP”组和“突变体+WT FBN1”组之间的统计学比较。e，通过定量聚合酶链式反应，在来自经历了持续7天的脂肪形成性分化而同时暴露于驱动没有信号肽的白色脂肪肽(FBN1 CT)或GFP的表达构建体的NPS患者(突变体)或未患病对照受试者(WT)的人真皮成纤维细胞中测量脂肪形成的早期标志物(CEBPα)和晚期标志物(AP2)的表达。显示了在“突变体+GFP”组和“突变体+FBN1 CT”组之间的统计学比较。f，通过定量聚合酶链式反应，在来自经历了持续7天的脂肪形成性分化而同时暴露于驱动附着有信号肽的白色脂肪肽(FBN1 CTSP)或GFP的表达构建体的NPS患者(突变体)或未患病对照受试者(WT)的人真皮成纤维细胞中测量脂肪形成的早期标志物(CEBPα)和晚期标志物(AP2)的表达。显示了在“突变体+GFP”组和“突变体+FBN1 CTSP”组之间的统计学比较。g，通过定量聚合酶链式反应，在来自经历了持续7天的脂肪形成性分化而同时暴露于60nM重组的白色脂肪肽或GFP的未患病对照受试者(WT)的人真皮成纤维细胞中测量数种脂肪形成的早期和晚期标志物的表达。用一系列的从30nM至625nM的白色脂肪肽剂量，观察到CEBPα表达的诱导。h，通过定量聚合酶链式反应，在来自经历了持续7天的脂肪形成性分化而同时暴露于60nM重组的白色脂肪肽或GFP的NPS患者(突变体)或未患病对照受试者(WT)的人真皮成纤维细胞中测量脂肪形成的早期标志物(CEBPα)和晚期标志物(AP2)的表达。数据呈现为平均值±SEM。使用非成对Student’s t检验来评价统计学显著性。＊P<0.05，＊＊P<0.01，和＊＊＊P<0.001。
图5A-5J：高的循环白色脂肪肽是致肥胖的和致糖尿病的。a、b、c，在经历了一次性尾静脉注射1011个携带关于FBN1或GFP的cDNA(在CMV启动子的控制之下)的腺病毒病毒颗粒的WT小鼠(每个组中，n＝6)中，使用磁共振成像(MRI)来测量脂肪量和瘦肉量，和测量总体重。在所示的那些天进行测量。d、e、f，在经历了于10天期间每天皮下注射2.6μM重组的白色脂肪肽或GFP的WT小鼠(每个组中，n＝6)中，使用磁共振成像(MRI)来测量脂肪量和瘦肉量，和测量总体重。在所示的那些天进行测量。g、i，在经历了一次性尾静脉注射1011个携带关于FBN1或GFP的cDNA(在CMV启动子的控制之下)的腺病毒病毒颗粒的禁食WT小鼠(每个组中，n＝6)上进行葡萄糖耐量测试和胰岛素耐量测试。在腺病毒注射后10天进行测量。h、j，在经历了于10天期间每天皮下注射2.6μM重组的白色脂肪肽或GFP的禁食WT小鼠(每个组中，n＝6)上进行葡萄糖耐量测试和胰岛素耐量测试。在最初的注射后10天进行测量。值得注意的是，在GFP小鼠上的胰岛素耐量(腺病毒和肽介导的递送两者)由于在60分钟标记处的严重低血糖症(表现为在葡萄糖计量仪上的“过低而无法测量”的值)而复杂化。不得不给那些小鼠注射外源的葡萄糖以防止致命的低血糖症。然而，注射了FBN1腺病毒和白色脂肪肽的小鼠维持其血糖水平，如在该图中所指明的那样。数据呈现为平均值±SEM。对于评价统计学显著性，当比较两个组时，使用非成对Student’s t检验；或当比较多于两个组时，使用ANOVA。＊P<0.05，＊＊P<0.01，和＊＊＊P<0.001。
图6A-6D：截短的原纤蛋白原的显性负调控效应。a，在来自NPS患者和未患病对照受试者(WT)的血浆上进行针对白色脂肪肽的Western印迹分析。b，在来自人真皮成纤维细胞的细胞培养基上进行针对白色脂肪肽的Western印迹分析，所述人真皮成纤维细胞来自暴露于持续7天的脂肪形成性诱导并且同时暴露于载料(vehicle)或莫能菌素(用于阻断分泌途径)的NPS患者(NPS)或未患病对照受试者(WT)。c，表达WT原纤蛋白-1(WT FBN1)的表达构建体或者表达携带诱导移码和C-末端截短的c.8207_8208Ins1bp突变的突变型原纤蛋白原(FBN1 NTΔ)的表达构建体的动画描绘。d，在来自人真皮成纤维细胞的细胞培养基上进行针对白色脂肪肽的Western印迹分析，所述人真皮成纤维细胞来自暴露于持续7天的脂肪形成性诱导并且同时暴露于驱动GFP或突变型的截短的原纤蛋白原(FBN1 NTΔ)的表达构建体以及载料或莫能菌素(用于阻断分泌途径)的未患病对照受试者(WT)。
图7A-7B：FBN1腺病毒或白色脂肪肽注射增加循环白色脂肪肽的量。a，在来自经历了一次性尾静脉注射1011个携带关于FBN1或GFP的cDNA(在CMV启动子的控制之下)的腺病毒病毒颗粒的WT小鼠的血浆上进行针对白色脂肪肽的Western印迹分析。在腺病毒注射后10天进行测量。b，在来自经历了于10天期间每天皮下注射2.6μM重组的白色脂肪肽或GFP的WT小鼠的血浆上进行针对白色脂肪肽的Western印迹分析。在最初的注射后10天进行测量。
图8A-8B：更高的循环白色脂肪肽导致增加的脂肪细胞大小。a，将经福尔马林固定的腹股沟白色脂肪组织切片用苏木精和伊红进行染色，所述切片来自经历了一次性尾静脉注射1011个携带关于FBN1或GFP的cDNA(在CMV启动子的控制之下)的腺病毒病毒颗粒的、禁食4小时的WT小鼠。在腺病毒注射后10天获取切片。b，将经福尔马林固定的腹股沟白色脂肪组织切片用苏木精和伊红进行染色，所述切片来自经历了于10天期间每天皮下注射2.6μM重组的白色脂肪肽或GFP的、禁食4小时的WT小鼠。在腺病毒注射后10天获取切片。
图9A-9D：增加的循环白色脂肪肽导致更高的脂肪源性激素的血浆水平。a、b，在来自经历了一次性尾静脉注射1011个携带关于FBN1或GFP的cDNA(在CMV启动子的控制之下)的腺病毒病毒颗粒的、禁食4小时的WT小鼠(每个组中，n＝6)的血浆中测量瘦蛋白和脂连蛋白。在腺病毒注射后10天进行测量。c、d，在来自经历了于10天期间每天皮下注射2.6μM重组的白色脂肪肽或GFP的、禁食4小时的WT小鼠(每个组中，n＝6)的血浆中测量瘦蛋白和脂连蛋白。在最初的注射后10天进行测量。
图10A-10D：增加的循环白色脂肪肽导致更低的血浆脂质。a、b，在来自经历了一次性尾静脉注射1011个携带关于FBN1或GFP的cDNA(在CMV启动子的控制之下)的腺病毒病毒颗粒的、禁食4小时的WT小鼠(每个组中，n＝6)的血浆中测量甘油三酯和游离脂肪酸。在腺病毒注射后10天进行测量。c、d，在来自经历了于10天期间每天皮下注射2.6μM重组的白色脂肪肽或GFP的、禁食4小时的WT小鼠(每个组中，n＝6)的血浆中测量甘油三酯和游离脂肪酸。在最初的注射后10天进行测量。
图11A-11D：增加的循环白色脂肪肽导致高血糖症和高胰岛素血症。a、b，在来自经历了一次性尾静脉注射1011个携带关于FBN1或GFP的cDNA(在CMV启动子的控制之下)的腺病毒病毒颗粒的、禁食4小时的WT小鼠(每个组中，n＝6)的血浆中测量葡萄糖和胰岛素。在腺病毒注射后10天进行测量。c、d，在来自经历了于10天期间每天皮下注射2.6μM重组的白色脂肪肽或GFP的、禁食4小时的WT小鼠(每个组中，n＝6)的血浆中测量葡萄糖和胰岛素。在最初的注射后10天进行测量。
图12A-12B：更高的循环白色脂肪肽导致增加的肝脂质积累。a，将经福尔马林固定的肝脏切片用苏木精和伊红进行染色，和对于中性脂质用油红O染色剂进行染色，所述切片来自经历了一次性尾静脉注射1011个携带关于FBN1或GFP的cDNA(在CMV启动子的控制之下)的腺病毒病毒颗粒的、禁食4小时的WT小鼠。在腺病毒注射后10天获取切片。b，将经福尔马林固定的肝脏切片用苏木精和伊红进行染色，和对于中性脂质用油红O染色剂进行染色，所述切片来自经历了于10天期间每天皮下注射2.6μM重组的白色脂肪肽或GFP的、禁食4小时的WT小鼠。在腺病毒注射后10天获取切片。
图13：截短的原纤蛋白原对于原纤蛋白-1分泌的显性负调控效应。在来自人真皮成纤维细胞的细胞培养基上进行针对原纤蛋白-1的Western印迹分析，所述人真皮成纤维细胞来自暴露于持续7天的脂肪形成性诱导并且同时暴露于驱动GFP或突变型的截短的原纤蛋白原(FBN1 NTΔ)的表达构建体以及载料或莫能菌素(用于阻断分泌途径)的未患病对照受试者(WT)。
图14：通过采用暴露于脂肪形成性培养基7天来使来自未患病的人(WT)和具有NPS的患者(突变体)的真皮成纤维细胞分化为成熟的脂肪细胞，随后进行基因表达分析。同时，使细胞暴露于不携带cDNA插入片段的腺病毒或者携带关于与信号肽相融合的原纤蛋白-1C-末端多肽(其在本文中也称为“白色脂肪肽”)的cDNA插入片段的腺病毒7天。AP2、CEBPα、瘦蛋白和脂连蛋白是脂肪形成的标志物基因。CXCL1、CCL1、CCL3和TLR2是炎症形成的标志物基因。为了清楚目的，在该图中仅指出了在“Mut+空载体”组和“Mut+CT多肽”组之间的统计学比较。使用非成对Student’s t检验来进行统计学分析。一个星号指明p<0.05，两个星号指明p<0.01，和三个星号指明p<0.001。
图15：通过采用暴露于脂肪形成性培养基7天来使来自未患病的人(WT)和具有NPS的患者(突变体)的真皮成纤维细胞分化为成熟的脂肪细胞，随后进行基因表达分析。同时，使细胞暴露于载料或10ug原纤蛋白-1C-末端多肽7天。AP2、CEBPα、瘦蛋白和脂连蛋白是脂肪形成的标志物基因。CXCL1、CCL1、CCL3和TLR2是炎症形成的标志物基因。为了清楚目的，在该图中仅指出了在“Mut+载料”组和“Mut+CT多肽”组之间的统计学比较。使用非成对Student’st检验来进行统计学分析。一个星号指明p<0.05，两个星号指明p<0.01，和三个星号指明p<0.001。
图16：在来自用正常饮食或高脂肪饮食进行饲喂的C57/Bl6小鼠的血浆上，使用特异性地检测原纤蛋白-1C-末端的小鼠单克隆抗体来进行Western印迹分析。16kd的条带相应于原纤蛋白-1C-末端的血浆级分。
图17：在已经用白色脂肪肽进行注射的小鼠中，增加的血浆CT多肽(白色脂肪肽)的量导致饮食过多。
发明详述
与长期存在的专利法公约相一致，单词“a”和“an”，当在本说明书(包括权利要求书)中与单词“包含”相呼应地使用时，表示“一个(种)或多个(种)”。本发明的某些实施方案可以由或基本上由本发明的一个或多个要素、方法步骤和/或方法构成。可以设想，任何在本文中所描述的方法或组合物可以关于任何被公开并且仍然获得相像或相似结果的在本文中所描述的其他方法或组合物实施方案来实施，而不背离本发明的精神和范围。
I.白色脂肪肽
本公开内容的实施方案包括与白色脂肪肽有关的方法和组合物，所述白色脂肪肽是原纤蛋白-1的C-末端切割片段。天然的人白色脂肪肽的序列(原纤蛋白-1的氨基酸2732-2871；SEQ ID NO:1)如下：STNETDASNIEDQSETEANVSLASWDVEKTAIFAFNISHVSNKVRILELLPALTTLTNHNRYLIESGNEDGFFKINQKEGISYLHFTKKKPVAGTYSLQISSTPLYKKKELNQLEDKYDKDYLSGELGDNLKMKIQVLLH。白色脂肪肽可以从人细胞中分离，并因此不再存在于自然界中，或者它可以是重组的，在某些实施方案中。如在本文中所提及的，当通过重组手段来产生SEQ ID NO:1的天然序列时，所得到的多肽可以称为重组的白色脂肪肽。重组的白色脂肪肽的另一个例子的序列包括标记物或标签。作为例子，附着在N-末端处的His标签连同为了包括用于在大肠杆菌(E.coli)中进行翻译的起始密码子的甲硫氨酸一起(SEQ ID NO:2)如下：
MHHHHHHSTNETDASNIEDQSETEANVSLASWDVEKTAIFAFNISHVSNKVRILELLPALTTLTNHNRYLIESGNEDGFFKINQKEGISYLHFTKKKPVAGTYSLQISSTPLYKKKELNQLEDKYDKDYLSGELGDNLKMKIQVLLH。白色脂肪肽的实施方案包括其功能性衍生物或功能性片段，并且如果当以有效量进行提供时，所述衍生物或片段具有使哺乳动物个体增加食欲和/或增长体重的能力，那么可以认为它是功能性的。这样的活性可以通过任何合适的手段来测量，包括例如用于评估脂肪量的增加的MRI扫描和使用体重秤的体重测量。在特别的实施方案中，可以例如通过在体外对于脂肪细胞分化的促进进行检定来评估功能活性。在特别的实施方案中，所述白色脂肪肽或者功能性片段或功能性衍生物是可溶的。所述白色脂肪肽或者功能性片段或功能性衍生物可以包含在融合蛋白中。
白色脂肪肽蛋白质组合物可以通过本领域技术人员已知的任何技术来制备，包括通过标准的分子生物学技术来进行的蛋白质、多肽或肽的表达，蛋白质化合物从天然来源中的分离，或者蛋白质材料的化学合成。可以通过使用在本文中所公开的或本领域普通技术人员已知的技术来扩增和/或表达白色脂肪肽编码区(例如，在原纤蛋白-1之内，虽然它可以与原纤蛋白-1相分开)。备选地，蛋白质、多肽或肽的各种商业制剂是本领域技术人员已知的。
在某些实施方案中，白色脂肪肽(或者其片段或衍生物)蛋白质化合物可以是经纯化的。通常，“经纯化的”将会是指特定的蛋白质、多肽或肽组合物，其已经经历了分级分离以去除各种其他蛋白质、多肽或肽，并且所述组合物基本上保持其活性，这可以例如通过本领域普通技术人员已知用于该特定的或所希望的蛋白质、多肽或肽的蛋白质测定法来进行评估。可以使用白色脂肪肽的生物学功能等价物，包括此类衍生物和片段。由于可以在根据本发明的白色脂肪肽多核苷酸和/或蛋白质的结构中进行修饰和/或变化，从而获得具有相似或经改善的特征的分子，因此此类生物学功能等价物也包括在本发明之内。
白色脂肪肽的其功能性衍生物或片段相比于SEQ ID NO:1而言包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个或者更多个氨基酸改变。所述白色脂肪肽的其功能性衍生物或片段可以包含SEQ ID NO:1的N-末端截短，例如其中所述截短不多于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个氨基酸，或者其中所述截短为至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个氨基酸。所述白色脂肪肽的其功能性衍生物或片段可以包含SEQ ID NO:1的C-末端截短，例如其中所述截短不多于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个氨基酸，或者所述截短为至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个氨基酸。所述白色脂肪肽的其功能性衍生物或片段可以包含在SEQ IDNO:1中的内部缺失，例如其中所述内部缺失不多于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个氨基酸，或者所述内部缺失为至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个氨基酸。在特别的实施方案中，白色脂肪肽的其功能性衍生物或片段可以包含与SEQID NO:1至少70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一的序列。
在特别的实施方案中，食欲刺激药包含白色脂肪肽或者功能性片段或功能性衍生物。所述刺激药可以特别地用白色脂肪肽进行配制以刺激哺乳动物个体的食欲。可以将这样的刺激药提供给体重过轻、营养不足、进食不足的个体，提供给正设法增大体量的个体，提供用于增加农业动物(例如，奶牛、猪、羔羊、鸡等)的体量，提供用于健身爱好者，等等。所述刺激药组合物可以具有除了白色脂肪肽以外的其他刺激药。
A.经修饰的多核苷酸和多肽
白色脂肪肽的生物学功能等价物可以从已进行了改造从而包含不同序列但同时保持编码“野生型”或标准蛋白质的能力的多核苷酸来产生。这可以依靠遗传密码的简并性(即存在有多个编码相同氨基酸的密码子)来完成。在一个实例中，本领域技术人员可以希望将限制酶识别序列引入到多核苷酸中而不干扰该多核苷酸编码蛋白质的能力。
在另一个实例中，使得白色脂肪肽多核苷酸是(和编码)具有更显著的变化的生物学功能等价物。在蛋白质结构中，某些氨基酸可以被置换成其他氨基酸，而没有关于结构(例如，抗体的抗原结合区，底物分子、受体上的结合位点，等等)的相互作用结合能力的可察觉到的损失。所谓的“保守的”变化不破坏蛋白质的生物学活性，因为该结构变化不是侵害蛋白质执行其设计功能的能力那种变化。因此，发明人设想，可以在本文中所公开的基因和蛋白质的序列中产生各种变化，而仍然达成本发明的目标。
在功能等价物方面，技术人员充分理解，在“生物学功能等价物”蛋白质和/或多核苷酸的定义中固有的是这样的概念，即对于可以在该分子的指定部分内产生而同时保持具有可接受水平的等价生物学活性的分子的变化的数目存在限制。因此，生物学功能等价物在本文中被定义为可以在所选择的氨基酸(或密码子)处进行置换的那些蛋白质(和多核苷酸)。
通常，分子的长度越短，可以在该分子内产生而同时保持功能的变化就越少。较长的结构域可以具有中等数目的变化。全长蛋白质对于较大数目的变化将会具有最大的耐受性。但是，必须意识到，某些高度依赖于其结构的分子或结构域可以耐受很少的修饰或者不能耐受修饰。
氨基酸置换通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如其疏水性、亲水性、电荷、大小等。氨基酸侧链取代基的大小、形状和/或类型的分析揭示：精氨酸、赖氨酸和/或组氨酸都是带正电荷的残基；丙氨酸、甘氨酸和/或丝氨酸都具有相似的大小；和/或，苯丙氨酸、色氨酸和/或酪氨酸都具有总体相似的形状。因此，基于这些考虑，在本文中将精氨酸、赖氨酸和/或组氨酸定义为生物学功能等价物；将丙氨酸、甘氨酸和/或丝氨酸定义为生物学功能等价物；和/或，将苯丙氨酸、色氨酸和/或酪氨酸定义为生物学功能等价物。
为了进行更为定量的变化，可以考虑氨基酸的亲水指数。已经基于其疏水性和/或电荷特征给每种氨基酸分派了亲水指数，这些是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(0.4)；苏氨酸(0.7)；丝氨酸(0.8)；色氨酸(0.9)；酪氨酸(1.3)；脯氨酸(1.6)；组氨酸(3.2)；谷氨酸(3.5)；谷氨酰胺(3.5)；天冬氨酸(3.5)；天冬酰胺(3.5)；赖氨酸(3.9)；和/或精氨酸(4.5)。
亲水氨基酸指数在将相互作用生物学功能赋予蛋白质中的重要性在本领域中是普遍理解的(Kyte和Doolittle,1982，其通过提及而合并入本文)。已知可以将某些氨基酸置换成具有相似亲水指数和/或得分的其他氨基酸，和/或仍然保持相似的生物学活性。在基于亲水指数来产生变化中，其亲水指数在±2之内的氨基酸的置换是优选的，在±1之内的那些是特别优选的，和/或在±0.5之内的那些是更加特别优选的。
本领域中还理解，可以基于亲水性有效地进行相似氨基酸的置换，特别是当打算将由此所产生的生物学功能等价物蛋白质和/或肽用于免疫学实施方案时，如在本发明的某些实施方案中那样。美国专利4,554,101(其通过提及而合并入本文)叙述到，蛋白质的最大局部平均亲水性(由其邻近氨基酸的亲水性决定)与其免疫原性和/或抗原性相关联，即与该蛋白质的生物学特性相关联。
如在美国专利4,554,101中所详细说明的，已经给氨基酸残基分派了下列亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(0.5)；组氨酸(0.5)；半胱氨酸(1.0)；甲硫氨酸(1.3)；缬氨酸(1.5)；亮氨酸(1.8)；异亮氨酸(1.8)；酪氨酸(2.3)；苯丙氨酸(2.5)；色氨酸(3.4)。在基于相似的亲水性值来产生变化中，其亲水性值在±2之内的氨基酸的置换是优选的，在±1之内的那些是特别优选的，和/或在±0.5之内的那些是更加特别优选的。
B.经改变的氨基酸
在许多方面，本发明依靠经过适当的多核苷酸的转录和翻译在细胞中合成肽和多肽。这些肽和多肽将会包括二十种“天然的”氨基酸，和其翻译后修饰。但是，体外肽合成使得能够使用经修饰的和/或不寻常的氨基酸。示例性的而非限制性的、经修饰的和/或不寻常的氨基酸是本领域中已知的。
C.模拟物
除了上面所讨论的生物学功能等价物外，发明人还考虑了，可以设计制定在结构上或在功能上相似的化合物以模拟本发明的肽或多肽的关键部分。这样的化合物(其可被称为肽模拟物)可以以与本发明的肽相同的方式进行使用并因此也是功能等价物。在特别的实施方案中，所述模拟物包含一个或多个来自白色脂肪肽的β折叠。
在Johnson等人(1993)中描述了模拟蛋白质二级和三级结构的要素的某些模拟物。在肽模拟物的使用背后的基础性原理是，蛋白质的肽主链的存在主要是为了使氨基酸侧链定向，从而促进分子相互作用，例如抗体和/或抗原的相互作用。因此，设计肽模拟物以允许与天然分子相似的分子相互作用。此类肽模拟物包括这样的化合物，其不掺入任何天然的氨基酸或氨基酸侧链，但基于白色脂肪肽的肽序列来进行设计并且具有在功能上代替白色脂肪肽的能力。
II.白色脂肪肽或白色脂肪肽受体的抑制剂
本公开内容的实施方案包括白色脂肪肽的一种或多种抑制剂。在特别的实施方案中，所述抑制剂为抗体，虽然在有些情况下所述抑制剂不是抗体。在特别的实施方案中，所述抑制剂可以为一种或多种小分子、一种或多种适体、一种或多种非抗体的衍生自噬菌体展示的肽，其组合等等。在特别的实施方案中，白色脂肪肽的抑制剂特异性地结合白色脂肪肽并使之失活。在特别的实施方案中，所述抑制剂是可溶的。在一些实施方案中，存在用于白色脂肪肽的由可溶性受体介导的抑制的方法和组合物。在特别的实施方案中，可以采用由RNAi和/或微小RNA介导的抑制，例如在其中白色脂肪肽具有与FBN1相分开的其自己的转录单元的特别的实施方案之中。
本公开内容的实施方案包括白色脂肪肽受体的一种或多种抑制剂。在特别的实施方案中，所述抑制剂为抗体，虽然在有些情况下所述抑制剂不是抗体。在特别的实施方案中，所述抑制剂可以为一种或多种小分子、一种或多种适体、一种或多种非抗体的衍生自噬菌体展示的肽、由RNAi和/或微小RNA介导的抑制剂、其下游信号传导的特异性抑制剂，或其组合等。在特别的实施方案中，白色脂肪肽受体的抑制剂特异性地结合白色脂肪肽并使之失活。在一个特别的实施方案中，它特异性地阻断其表达，或者降低其功能活性。在特别的实施方案中，所述抑制剂是可溶的。
在特别的实施方案中，所述抑制剂靶向结构或功能基元，并且所述抑制剂的白色脂肪肽靶位点可以是已知的或未知的。在特别的实施方案中，所述抑制剂靶向一个或多个来自白色脂肪肽的β折叠。在特别的实施方案中，所述白色脂肪肽的抑制剂为白色脂肪肽受体的抑制剂。
在某些实施方案中，存在包含一种或多种白色脂肪肽抑制剂的食欲遏抑药。所述遏抑药组合物可以具有除了白色脂肪肽以外的其他遏抑药。所述遏抑药可以特别地用白色脂肪肽进行配制以遏抑哺乳动物个体的食欲。可以向超重、肥胖、具有糖尿病、处于变成超重的风险中、处于变成肥胖的风险中等等的个体提供这样的遏抑药。
在特别的实施方案中，所述抑制剂为抗体。如在本文中所使用的，术语“抗体”意欲广义地指任何免疫学结合试剂，例如IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。通常，IgG和/或IgM是优选的，因为它们是在生理情况下最常见的抗体并且因为它们是在实验室背景下最容易制备的。术语“抗体”用于指任何具有抗原结合区域的抗体样分子，并且包括抗体片段例如Fab’、Fab、F(ab’)2、单结构域抗体(DAB)、Fv、scFv(单链Fv)等。用于制备和使用各种基于抗体的构建体和片段的技术是本领域熟知的。用于制备和表征抗体的手段也是本领域熟知的(参见例如，Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,1988，其通过提及而合并入本文)。
A.多克隆抗体
对于白色脂肪肽的多克隆抗体通常可以通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射白色脂肪肽或其片段和佐剂而在动物中产生。可以有用的是，将白色脂肪肽或包含靶氨基酸序列的片段缀合至在待进行免疫接种的物种中具有免疫原性的蛋白质(例如，匙孔
Figure BDA0002638299720000191
血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂)，其中使用双官能试剂或衍生化试剂，例如马来酰亚胺基苯甲酰基-磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基进行缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或R1 N＝C＝NR(其中R和R1为不同的烷基基团)。
可以通过将1mg或1μg缀合物(分别对于兔或小鼠)与3倍体积的弗氏完全佐剂相组合并且在多个位点处真皮内注射该溶液，来针对免疫原性缀合物或衍生物对动物进行免疫接种。一个月后，用在弗氏完全佐剂中的1/5至1/10原始量的缀合物通过在多个位点处进行皮下注射来对动物进行加强免疫。在7至14天后，给动物放血，并且就抗白色脂肪肽抗体滴度对血清进行检定。对动物进行加强免疫直至滴度平台期。优选地，用相同的但与不同的蛋白质相缀合和/或通过不同的交联试剂进行缀合的白色脂肪肽的缀合物对动物进行加强免疫。还可以在重组细胞培养物中作为融合蛋白来制备缀合物。另外，使用聚集剂例如明矾来增强免疫应答。
B.单克隆抗体
在特别的实施方案中，可以产生单克隆抗体，并且作为白色脂肪肽的抑制剂进行使用以用于在个体中减轻体重的用途。用于单克隆抗体的免疫原可以是整个白色脂肪肽多肽，或者可以是其片段。可以用于产生单克隆抗体的免疫原的示例性序列如下：
HuFbn1-2746:2770ETEANVSLASWDVEKTAIFAFNISH(SEQ ID NO:3)
HuFbn1 2838:2865
KKKELNQLEDKYDKDYLSGELGDNLKMK(SEQ ID NO:4)。
单克隆抗体获得自基本上同质的抗体的群体，即包含在该群体中的独个抗体是相同的，除了可能以少量存在的可能的天然出现的突变外。因此，修饰语“单克隆(的)”指明了所述抗体的性质为不是离散的抗体的混合物。
例如，本发明的抗白色脂肪肽单克隆抗体可以通过使用首次由Kohler和Milstein,Nature 256:495(1975)所描述的杂交瘤方法来制备，或者可以通过重组DNA方法(Cabilly等人,美国专利号4,816,567)来制备。在杂交瘤方法中，如在上文中所描述的那样对小鼠或其他适当的宿主动物例如仓鼠进行免疫接种以引发产生或能够产生抗体的淋巴细胞，所述抗体将会特异性地与用于免疫接种的蛋白质相结合。备选地，可以在体外对淋巴细胞进行免疫接种。然后，使用合适的融合试剂(例如聚乙二醇)，将淋巴细胞与骨髓瘤细胞相融合以形成杂交瘤细胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,第59-103页(Academic Press,1986))。
将如此制备的杂交瘤细胞接种在合适的培养基中并使其生长，所述培养基优选地包含一种或多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)这种酶，则用于杂交瘤的培养基典型地将会包含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT缺陷型细胞的生长。
优选的骨髓瘤细胞为这样的那些骨髓瘤细胞，所述骨髓瘤细胞有效地进行融合，支持由所选择的抗体生成细胞稳定且高水平地表达抗体，并且对于培养基例如HAT培养基敏感。在这些骨髓瘤细胞中，优选的骨髓瘤细胞系为鼠类骨髓瘤系，例如从索尔克研究所细胞配给中心(Salk Institute Cell Distribution Center),San Diego,Calif.USA可得的源自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的那些，和从美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection),Rockville,Md.USA可得的SP-2细胞。
就针对白色脂肪肽的单克隆抗体的产生来对其中正生长着杂交瘤细胞的培养基进行检定。优选地，通过免疫沉淀，或者通过体外结合测定法，例如放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)，来测定由杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体的结合特异性。
可以例如通过Munson和Pollard,Anal.Biochem.107:220(1980)的斯卡查德(Scatchard)分析来测定单克隆抗体的结合亲和力。
在鉴定出了产生具有所希望的特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，所述克隆可以通过有限稀释程序进行亚克隆并且通过标准方法(Goding,MonoclonalAntibodies Principles and Practice,第59-104页(Academic Press,1986))进行生长。用于该目的的合适的培养基包括例如Dulbecco改良的Eagle培养基或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可以在动物中作为腹水肿瘤在体内进行生长。
通过常规的免疫球蛋白纯化程序例如A蛋白-Sepharose、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析，从培养基、腹水或血清中合适地分离开由亚克隆所分泌的单克隆抗体。
通过使用常规的程序(例如，通过使用能够与编码鼠类抗体的重链和轻链的基因特异性地结合的寡核苷酸探针)，容易地分离出编码本发明的单克隆抗体的DNA并进行测序。本发明的杂交瘤细胞充当此类DNA的优选的来源。一旦经分离，就可以将所述DNA放置到表达载体中，然后将所述表达载体转染到宿主细胞例如猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或否则不产生免疫球蛋白蛋白质的骨髓瘤细胞中，以获得在重组宿主细胞中单克隆抗体的合成。还可以修饰所述DNA，例如，通过用人重链和轻链恒定结构域的编码序列替换同源的鼠类序列(Morrison等人,Proc.Nat.Acad.Sci.81,6851(1984))，或者通过将非免疫球蛋白多肽的编码序列的全部或部分共价连接至编码免疫球蛋白的序列。以该方式，制备出“嵌合的”或“杂合的”抗体，其具有本文中的抗白色脂肪肽单克隆抗体的结合特异性。
典型地，用这样的非免疫球蛋白多肽替换本发明的抗体的恒定结构域，或者用它们替换本发明的抗体的一个抗原结合位点的可变结构域以产生嵌合的二价抗体，其包含一个对于白色脂肪肽具有特异性的抗原结合位点和另一个对于不同抗原具有特异性的抗原结合位点。
还可以通过使用在合成蛋白质化学中的已知方法(包括牵涉交联剂的那些)来在体外制备嵌合或杂合抗体。例如，可以通过使用二硫化物交换反应或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。用于该目的的合适的试剂的例子包括亚氨基硫醇盐和4-巯基丁酰亚胺酸甲酯。
对于诊断应用，典型地可以用可检测部分对本发明的抗体进行标记。所述可检测部分可以是能够直接或间接地产生可检测信号的任何一种。例如，所述可检测部分可以是放射性同位素，例如3H、14C、32P、35S或125I；发荧光或化学发光的化合物，例如异硫氰酸荧光素、罗丹明或萤光素；生物素；放射性同位素标记物，例如125I、32P、14C或3H；或者酶，例如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶。
可以使用任何本领域中已知用于将抗体分别地缀合至可检测部分的方法，包括由Hunter等人,Nature 144:945(1962)；David等人,Biochemistry 13:1014(1974)；Pain等人,J.Immunol.Meth.40:219(1981)；和Nygren,J.Histochem.and Cytochem.30:407(1982)所描述的那些方法。
本发明的抗体可以在任何已知的检定方法中使用，例如竞争性结合测定法、直接和间接夹心式测定法以及免疫沉淀测定法。Zola,Monoclonal Antibodies:A Manual ofTechniques,第147-158页(CRC Press,Inc.,1987)。
竞争性结合测定法依靠经标记的标准物(其可以是白色脂肪肽或其免疫学反应性部分)与受试样品分析物(白色脂肪肽)竞争结合有限量的抗体的能力。受试样品中白色脂肪肽的量与结合至抗体的标准物的量成反比。为了有助于测定所结合的标准物的量，通常在竞争之前或之后使抗体不溶，从而可以方便地将结合至抗体的标准物和分析物与保持未结合的标准物和分析物相分开。
夹心式测定法牵涉两种抗体的使用，每一种抗体能够与待检测的蛋白质的不同的免疫原性部分或表位相结合。在夹心式测定法中，受试样品分析物被固定化在固体支持物上的第一抗体所结合，此后第二抗体与所述分析物相结合，如此形成不溶的三组分复合物。David和Greene,美国专利号4,376,110。第二抗体可以本身用可检测部分进行标记(直接夹心式测定法)，或者可以通过使用用可检测部分进行标记的抗免疫球蛋白抗体来测量(间接夹心式测定法)。例如，一种夹心式测定法类型为ELISA测定法，在该情况下，所述可检测部分为酶。
C.人源化抗体
用于使非人抗体人源化的方法是本领域熟知的。通常，人源化抗体具有一个或多个被从非人来源引入到其中的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常被称作“输入”残基，其典型地取自“输入”可变结构域。基本上可以依照Winter及合作者(Jones等人,Nature321,522-525(1986)；Riechmann等人,Nature 332,323-327(1988)；Verhoeyen等人,Science 239,1534-1536(1988))的方法，通过将啮齿动物CDR或CDR序列替换成人抗体的相应序列来进行人源化。因此，此类“人源化”抗体为嵌合抗体(Cabilly,同上)，其中实质上小于完整的人可变结构域被来自非人物种的相应序列所替换。在实践中，人源化抗体典型地为其中一些CDR残基和可能地一些FR残基被来自在啮齿动物抗体中的类似位点的残基所替换的人抗体。
重要的是，抗体被人源化，而保留对于抗原的高亲和力和其他有利的生物学特性。为了达到这个目标，根据优选的方法，通过下列过程来制备人源化抗体，即使用亲本和人源化序列的三维模型来分析亲本序列和各种概念上的人源化产物。三维免疫球蛋白模型是通常可得的，并且是本领域技术人所熟悉的。图解并展示所选择的候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序是可得的。检查这些展示使得能够分析所述残基在候选免疫球蛋白序列的功能发挥中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以这种方式，可以从共有输入序列中选择出FR残基并将它们相组合，从而实现所希望的抗体特征，例如增加的对于靶抗原的亲和力。通常，CDR残基直接地且最实质上参与影响抗原结合。关于进一步的细节，参见1992年8月21日提交的美国申请系列号07/934,373，其是1991年6月14日提交的申请系列号07/715,272的部分继续申请。
D.人抗体
人单克隆抗体可以通过杂交瘤方法来制备。已经例如由Kozbor,J.Immunol.133,3001(1984)和Brodeur等人,Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications,第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人杂骨髓瘤细胞系。
现在可能的是，产生在免疫接种后能够在不存在内源免疫球蛋白产生的情况下产生人抗体储库的转基因动物(例如，小鼠)。例如，已描述了，在嵌合的和种系突变型的小鼠中抗体重链连接区(J.sub.H)基因的纯合缺失导致内源抗体产生的完全抑制。将人种系免疫球蛋白基因阵列转移入这样的种系突变型小鼠中将会导致在抗原攻击后产生人抗体。参见例如，Jakobovits等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90,2551-255(1993)；Jakobovits等人,Nature 362,255-258(1993)。
备选地，噬菌体展示技术(McCafferty等人,Nature 348,552-553(1990))可以用于在体外从来自未免疫接种的供者的免疫球蛋白可变(V)结构域基因储库产生抗体和抗体片段。根据该技术，将抗体V结构域基因按阅读框架克隆到丝状噬菌体(例如，M13或fd)的主要或次要外壳蛋白基因中，并作为功能性抗体片段而展示在噬菌体颗粒的表面上。
因为所述丝状颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，所以基于抗体的功能特性的选择还导致选择出编码展现出那些特性的抗体的基因。因此，所述噬菌体模拟了B细胞的一些特性。噬菌体展示可以以各种形式来施行；关于其综述，参见例如Johnson,Kevin S.和Chiswell,David J.,Current Opinion in Structural Biology 3,564-571(1993)。V-基因区段的数种来源可以用于噬菌体展示。Clackson等人,Nature,352:624-628(1991)从源自经免疫接种的小鼠的脾的V基因的小随机组合文库中分离出了各种各样的抗噁唑酮抗体。可以构建来自未免疫接种的人供者的V基因储库，并且可以基本上依照由Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)或Griffith等人,EMBO J.12:725-734(1993)所描述的技术，分离出针对各种各样的抗原(包括自身抗原)的抗体。在天然免疫应答中，抗体基因以高速率积累突变(体细胞超变)。一些所引入的变化将会赋予较高的亲和力，并且展示出高亲和力表面免疫球蛋白的B细胞在后来的抗原攻击中被优先复制和分化。该天然过程可以通过使用称为“链改组(chain shuffling)”的技术来进行模拟(Marks等人,Bio/Technol.10,779-783(1992))。在该方法中，通过噬菌体展示而获得的“初级”人抗体的亲和力可以通过用从未免疫接种的供者获得的V结构域基因的天然出现的变体(储库)的储库相继地代替重链和轻链V区基因来进行改善。该技术允许产生具有在nM范围内的亲和力的抗体和抗体片段。Waterhouse等人,Nucl.Acids Res.21,2265-2266(1993)已经描述了用于制备非常大的噬菌体抗体储库(也称为“所有文库之母(the mother-of-all libraries)”)的策略，并且Griffith等人,EMBO J.(1994)(排印中)报道了直接从这样大的噬菌体文库中分离出高亲和力人抗体。基因改组(gene shuffling)也可以用于从啮齿动物抗体衍生出人抗体，其中人抗体具有与起始的啮齿动物抗体相似的亲和力和特异性。根据该方法(其也称为“表位铭记(epitope imprinting)”)，将通过噬菌体展示技术而获得的啮齿动物抗体的重链或轻链V结构域基因用人的V结构域基因储库代替，从而产生啮齿动物-人嵌合体。在抗原上的选择导致分离出能够恢复功能性抗原结合位点的人可变区，即该表位支配(铭记)伙伴的选择。当重复该过程以便代替其余的啮齿动物V结构域时，获得人抗体(参见PCT专利申请WO 93/06213，公开于1993年4月1日)。与传统的通过CDR嫁接来进行的啮齿动物抗体的人源化不同，该技术提供了完全地人的抗体，其不具有啮齿动物来源的框架或CDR残基。
E.双特异性抗体
双特异性抗体是单克隆的(优选地，人的或人源化的)抗体，其具有对于至少两种不同抗原的结合特异性。在本申请的情况下，结合特异性之一是对于白色脂肪肽的，另一个是对于任何其他抗原的，优选地是对于另一种受体或受体亚基的。例如，特异性地结合白色脂肪肽和白色脂肪肽受体或两种不同白色脂肪肽受体的双特异性抗体在本发明的范围之内。
用于制备双特异性抗体的方法是本领域中已知的。在传统上，双特异性抗体的重组产生基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中所述两个重链具有不同的特异性(Millstein和Cuello,Nature 305,537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机搭配，因而这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadroma))产生10种不同抗体分子的潜在混合物，其中仅一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤来进行的正确分子的纯化是相当繁重的，并且产物产量低。相似的程序公开在PCT申请公开号WO 93/08829(公开于1993年5月13日)中，和在Traunecker等人,EMBO 10,3655-3659(1991)中。
根据不同的且更优选的方法，将具有所希望的结合特异性的抗体可变结构域(抗体-抗原结合位点)与免疫球蛋白恒定结构域序列相融合。所述融合优选地是与包含至少一部分的铰链区、CH2区和CH3区的免疫球蛋白重链恒定结构域。优选的是，在至少一种所述融合物中存在有包含对于轻链结合来说必需的位点的第一重链恒定区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合物(和如果希望，免疫球蛋白轻链)的DNA插入到分开的表达载体中，并且共转染到合适的宿主生物中。当在构建中所使用的三种多肽链的不相等的比例提供最佳产量时，这在具体实施中在调整所述三种多肽片段的相互比例方面提供了很大的灵活性。但是，可能的是，当以相等比例表达至少两种多肽链导致高产量时或者当比例不是特别重要时，在一个表达载体中插入关于两种或所有三种多肽链的编码序列。在该方法的一个优选的实施方案中，所述双特异性抗体由在一个臂中的具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链和在另一个臂中的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(其提供第二结合特异性)组成。发现该不对称结构有助于所希望的双特异性化合物与不想要的免疫球蛋白链组合相分开，因为免疫球蛋白轻链在所述双特异性分子的仅一半中的存在提供了容易的分开方式。该方法公开在1992年8月17日提交的共同未决的申请系列号07/931,811中。
关于产生双特异性抗体的进一步的细节，参见例如Suresh等人,Methods inEnzymology 121,210(1986)。
F.异缀合物(heteroconjugate)抗体
异缀合物抗体也在本发明的范围之内。异缀合物抗体由两个共价连接的抗体组成。此类抗体已被提议例如用于使免疫系统细胞靶向不想要的细胞(美国专利号4,676,980)，和用于治疗HIV感染(PCT申请公开号WO 91/00360和WO 92/200373；EP 03089)。异缀合物抗体可以通过使用任何方便的交联方法来制备。合适的交联剂是本领域熟知的，并且公开在美国专利号4,676,980中，连同许多交联技术一起。
III.需要体重增长的个体
本公开内容的实施方案包括用于在需要体重增长的个体中增加体重的方法和组合物。所述个体可以例如需要脂肪量的增加。所述个体可以是因为各种原因，包括由于医学病况或状态或者因为另一原因，而需要体重增长。在所述个体由于医学病况而体重过轻的情况下，所述医学病况可以是或不是基因的病况，或者可以是或不是遗传的病况。在特别的实施方案中，体重过轻的原因可以是由于遗传学、代谢和/或疾患。在特别的实施方案中，所述医学病况具有作为症状的体重过轻。在有些情况下，体重过轻这一症状存在于所有具有所述医学病况的个体中，虽然它可以存在于少于所有具有所述医学病况的个体中。体重过轻这一症状可以是由于与脂肪代谢调控、脂肪贮存和炎症过程相关的途径中的缺陷，虽然在有些情况下，体重过轻并不直接与脂肪代谢调控、脂肪贮存和炎症过程相关。在有些情况下，所述个体可以是由于新生儿早老样综合征、马方综合征、HIV感染、甲状腺功能亢进、癌症、结核病、胃肠或肝脏问题、药物副作用或精神疾患(例如，具有神经性食欲缺乏或神经性食欲过盛的那些)而体重过轻。例如，可以使具有恶病质的个体经历本公开内容的方法和组合物。所述恶病质可以是任何原因(包括例如，由于癌症、AIDS、慢性阻塞性肺疾病、多发性硬化症、充血性心力衰竭、结核病、家族性淀粉样多发性神经病、汞中毒、激素缺乏，等等)的结果。
在特别的实施方案中，需要体重增长的个体为具有低于18.5的体重指数(BMI)或比就其年龄和身高群体而言正常的体重低15％至20％的体重的个体。经历本公开内容的方法和组合物的个体可以首先由执业医师鉴定为需要体重增长，并且可以为了增加体重的特别目的而向所述个体递送治疗性组合物。
IV.需要体重增长的个体的治疗
在本公开内容的实施方案中，确定个体需要体重增长，例如通过测量其体重，和/或测量其BMI，和/或进行用于测量脂肪量的MRI和/或双能X-射线吸收测量术(DEXA)扫描。所述个体可以是已知需要体重增长的，或者被怀疑需要体重增长或处于需要体重增长的风险中。个体可以自己决定他们需要体重增长，和/或这可以由合适的执业医师来决定。
一旦知道所述个体需要体重增长或者知道其处于需要体重增长的风险中或对于需要体重增长易感，那么就可以给予他们合适的且有效量的白色脂肪肽或者功能性衍生物或功能性片段。在特别的实施方案中，向所述个体提供一种或多种白色脂肪肽或者功能性衍生物或功能性片段，例如在组合物中或在多种组合物中。可以为治疗应用特别地配制包含白色脂肪肽或者功能性衍生物或功能性片段的组合物。
可以基于所需或作为常规给药制度的一部分向个体提供合适剂量的白色脂肪肽。除了服用白色脂肪肽或者功能性衍生物或功能性片段外，所述个体也可以采取其他措施和/或服用其他组合物来增长体重。所述个体可以每天、每周、每月等等地服用白色脂肪肽或者功能性衍生物或功能性片段。所述个体可以与食物消费一起或空腹地服用白色脂肪肽或者功能性衍生物或功能性片段。
在白色脂肪肽或者功能性衍生物或功能性片段给药制度的过程中，所述个体可以由或不由执业医师进行监控。一旦达到所希望的体重，所述个体可以停止服用白色脂肪肽或者功能性衍生物或功能性片段，并且如果所述个体在以后的时间点变得需要增长体重，那么可以重新开始服用白色脂肪肽或者功能性衍生物或功能性片段。如果出现个体超过了合适量的白色脂肪肽或者功能性衍生物或功能性片段以致于增长了太多体重的情况，所述个体可以通过任何合适的手段(包括通过例如锻炼、减少热量摄入和/或服用白色脂肪肽的抑制剂)来减少其体重。
V.需要体重减轻和/或需要经改善的葡萄糖控制的个体
本公开内容的实施方案包括用于在需要体重减轻的个体中降低体重的方法和组合物。所述个体可以例如需要脂肪量的降低。所述个体可以是因为各种原因，包括由于医学病况或状态或者因为另一原因，而需要体重减轻。在所述个体由于医学病况而需要体重减轻的情况下，所述医学病况可以是或不是基因的病况，和可以是或不是遗传的病况。需要体重减轻的原因可以是来自遗传学、代谢和/或疾患。在特别的实施方案中，所述医学病况具有作为症状的超重或肥胖。在有些情况下，超重或肥胖这一症状存在于所有具有所述医学病况的个体中，虽然它可以存在于少于所有具有所述医学病况的个体中。超重或肥胖这一症状可以是由于与脂肪代谢调控、脂肪贮存和炎症过程相关的途径中的缺陷，虽然在有些情况下，超重或肥胖并不直接与脂肪代谢调控、脂肪贮存和炎症过程相关。所述个体可以是由于糖尿病、甲状腺功能减退、代谢紊乱(包括代谢综合征)、药物副作用、酒精中毒、进食障碍病症、睡眠不足、有限的身体锻炼、久坐的生活方式、营养差、成瘾停止和/或压力而超重或肥胖，虽然在有些实施方案中，此类病况是超重或肥胖的结果。
在特别的实施方案中，个体具有葡萄糖控制缺陷并且被确定需要改善这样的缺陷。在特别的实施方案中，所述葡萄糖控制缺陷是在所述个体的血液中存在过多量的葡萄糖。在特别的实施方案中，个体具有糖尿病或为前驱糖尿病患者，并且还可以是或不是超重或肥胖的。在特别的实施方案中，向所述个体提供有效量的一种或多种白色脂肪肽的任何抑制剂以改善血糖控制，包括降低过多的血糖的水平。向糖尿病或前驱糖尿病的个体提供这样的治疗，并且发生在血糖控制方面的改善。血糖水平的降低可以是或不是极其正常的血糖水平。在特别的实施方案中，除了在血糖控制方面的改善外，在施用一种或多种白色脂肪肽抑制剂后，糖尿病或前驱糖尿病的一种或多种症状也得到改善。对于前驱糖尿病个体，在使用一种或多种白色脂肪肽抑制剂后，防止了糖尿病的发作。在特别的实施方案中，对于胰岛素抵抗性个体，白色脂肪肽抑制导致胰岛素敏感性的恢复或改善，从而导致更好的葡萄糖清除。
在特别的实施方案中，需要体重减轻的个体是超重的(在25和29之间的BMI)或肥胖的(30或更高的BMI)。经历本公开内容的方法和组合物的个体可以首先由执业医师鉴定为需要体重减轻，并且可以为了降低体重的特别目的而向所述个体递送治疗性组合物。
在本公开内容的实施方案中，向个体施用白色脂肪肽或者功能性衍生物或功能性片段在所述个体中不导致糖尿病的发作。在特别的实施方案中，所述个体具有糖尿病或不具有糖尿病。
VI.需要体重减轻的个体的治疗
在本公开内容的实施方案中，确定个体需要体重减轻，例如通过测量其体重，和/或测量其BMI，和/或进行用于评估脂肪量的MRI和/或DEXA扫描。所述个体可以是已知需要体重减轻的，或者被怀疑需要体重减轻或处于需要体重减轻的风险中。个体可以自己决定他们需要体重减轻，和/或这可以由合适的执业医师来决定。
一旦知道所述个体需要体重减轻或者知道其处于需要体重减轻的风险中或对于需要体重减轻易感，那么就可以给予他们合适的且有效量的白色脂肪肽的抑制剂。在特别的实施方案中，向所述个体提供一种或多种白色脂肪肽抑制剂，例如在组合物中或在多种组合物中。可以为治疗应用特别地配制包含白色脂肪肽抑制剂的组合物。
可以基于所需或作为常规给药制度的一部分向个体提供合适剂量的白色脂肪肽抑制剂。除了服用白色脂肪肽抑制剂外，所述个体也可以采取其他措施和/或服用其他组合物来减轻体重。所述个体可以每天、每周、每月等等地服用白色脂肪肽抑制剂。所述个体可以与食物消费一起或空腹地服用白色脂肪肽抑制剂。
在白色脂肪肽抑制剂给药制度的过程中，所述个体可以由或不由执业医师进行监控。一旦达到所希望的体重，所述个体可以停止服用白色脂肪肽抑制剂，并且如果所述个体在以后的时间点变得需要减轻体重，那么可以重新开始服用白色脂肪肽抑制剂。如果出现个体超过了合适量的白色脂肪肽抑制剂以致于减轻了太多体重的情况，所述个体可以通过任何合适的手段(包括通过例如增加热量摄入和/或服用白色脂肪肽或者功能性片段或功能性衍生物)来增加其体重。
VII.需要体重调节的个体的诊断
在某些实施方案中，基于在其身体中(包括例如在其血浆中)的白色脂肪肽水平，将个体诊断为需要体重增加或诊断为对于需要体重增加易感。合适的样品可以获自所述个体，并且要么由获得该样品的一方要么由第三方进行加工。在进行分析之前，可以在合适的条件下储存和/或运输样品。在某些实施方案中，当测定了白色脂肪肽的水平低于某一水平时，就知道所述个体需要体重增长或知道其对于需要体重增长易感，并且向所述个体提供合适量的白色脂肪肽或者其功能性片段或功能性衍生物。在特别的实施方案中，基于白色脂肪肽水平来进行诊断不是为了鉴定所述个体需要体重增长或对于需要体重增长易感，而是由于存在体重增长的需要或其易感性的缘故。
在某些实施方案中，基于在其身体中(包括例如在其血浆中)的白色脂肪肽水平，将个体诊断为需要体重降低或诊断为对于需要体重降低易感。合适的样品可以获自所述个体，并且要么由获得该样品的一方要么由第三方进行加工。在进行分析之前，可以在合适的条件下储存和/或运输样品。在某些实施方案中，当测定了白色脂肪肽的水平高于某一水平时，就知道所述个体需要体重减轻或知道其对于需要体重减轻易感，并且向所述个体提供合适量的一种或多种白色脂肪肽抑制剂。在特别的实施方案中，基于白色脂肪肽水平来进行诊断不是为了鉴定所述个体需要体重减轻或对于需要体重减轻易感，而是由于存在体重减轻的需要或其易感性的缘故。在特别的情况下，肥胖的个体可以具有引起过多白色脂肪肽产生的原纤蛋白-1(或其区域)的副本。
可以采用任何用于鉴定身体中的白色脂肪肽水平的手段。在特别的实施方案中，使用夹心式ELISA、Western印迹、竞争性放射标记结合测定法、受体活性测定法和/或由白色脂肪肽诱导的胞内/胞外信号传导级联的测量来鉴定白色脂肪肽的血浆水平。
VIII.药物制剂
本发明的药物组合物包含有效量的一种或多种白色脂肪肽(或者功能性片段或功能性衍生物)或者一种或多种白色脂肪肽抑制剂，它们溶解或分散在药学上可接受的载体中。短语“药学上或药理学上可接受的”涉及这样的分子实体和组合物，其在当施用给动物(例如人，在合适的情况下)时，不产生不利的、变应性的或其他不希望的反应。鉴于本公开内容，包含至少一种白色脂肪肽(或者功能性片段或功能性衍生物)或者至少一种白色脂肪肽抑制剂的药物组合物的制备将会是本领域技术人员已知的，如由Remington:TheScience and Practice of Pharmacy,第21版,Lippincott Williams and Wilkins,2005(其通过提及而合并入本文)所例示的。此外，对于动物(例如，人)施用，将会理解，制剂应当满足由FDA生物制品标准办公室所要求的无菌性、热原性、一般安全性和纯度标准。
如在本文中所使用的，“药学上可接受的载体”包括任何的和所有的溶剂、分散介质、包衣剂、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗细菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、增甜剂、矫味剂、染料等，以及其组合物，如本领域普通技术人员将会知晓的(参见例如，Remington’sPharmaceutical Sciences,第18版,Mack Printing Company,1990,第1289-1329页，其通过提及而合并入本文)。除非任何常规的载体是与所述活性成分不相容的，否则就考虑其在所述药物组合物中的使用。
所述白色脂肪肽(或者功能性片段或功能性衍生物)或者白色脂肪肽抑制剂可以包含不同类型的载体，取决于它将会以固体、液体还是气溶胶形式进行施用，和对于诸如注射的施用途径来说它是否需要是无菌的。本发明可以以静脉内、真皮内、经皮、鞘内、动脉内、腹膜内、鼻内、阴道内、直肠内、局部表面、肌内、皮下、粘膜、口服、局部表面、局部、吸入(例如，气溶胶吸入)、注射、输注、连续输注、直接浸浴靶细胞的局部化灌注、通过导管、通过灌洗、在霜剂中、在脂质组合物(例如，脂质体)中、或者通过其他方法或上述的任何组合这些方式进行施用，如本领域技术普通人员将会知晓的(参见例如，Remington’sPharmaceutical Sciences,第18版,Mack Printing Company,1990，其通过提及而合并入本文)。
可以将所述白色脂肪肽(或者功能性片段或功能性衍生物)或者白色脂肪肽抑制剂配制成以游离碱、中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐，例如与蛋白质组分的游离氨基基团形成的那些，或者与无机酸(例如，盐酸或磷酸)或有机酸(例如，乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸)形成的那些。与游离羧基基团形成的盐也可以源自无机碱例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁；或者有机碱例如异丙基胺、三甲基胺、组氨酸或普鲁卡因。在配制完成后，就以与所述剂量配制剂相容的方式和以诸如治疗有效的量施用溶液。容易地将所述配制剂以各种各样的剂型进行施用，所述剂型例如为，为了肠胃外施用而配制的那些，例如可注射溶液，或用于递送至肺的气溶胶，或者为了膳食施用而配制的那些，例如药物释放胶囊，等等。
进一步地根据本发明，在药学上可接受的载体(具有或不具有惰性稀释剂)中提供适合于施用的本发明的组合物。所述载体应当是可同化的，并且包括液体、半固体(即糊剂)或固体载体。除非任何常规的介质、试剂、稀释剂或载体对于受者或对于其中所包含的组合物的治疗效用是有害的，否则其在用于在实施本发明的方法中使用的可施用组合物之中的使用是合适的。载体或稀释剂的例子包括脂肪、油、水、盐水溶液、脂质、脂质体、树脂、粘合剂、填充剂等，或其组合。所述组合物还可以包含各种抗氧化剂以延缓一种或多种组分的氧化。另外，可以通过防腐剂来防止微生物的作用，所述防腐剂例如为各种抗细菌剂和抗真菌剂，包括但不限于对羟基苯甲酸酯类(例如，羟苯甲酯、羟苯丙酯)、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞或其组合。
根据本发明，将所述组合物与所述载体以任何方便的和实用的方式相组合，即通过溶解、悬浮、乳化、混合、包囊、吸收等。这样的程序对于本领域技术人员来说是常规的。
在本发明的一个特殊的实施方案中，将所述组合物与半固体或固体载体彻底地相组合或混合。所述混合可以以任何方便的方式例如研磨来进行。在混合过程中也可以添加稳定剂以便保护所述组合物免于治疗活性的丧失，即在胃中变性。用于在所述组合物中使用的稳定剂的例子包括，缓冲液，氨基酸，例如甘氨酸和赖氨酸，碳水化合物，例如右旋糖、甘露糖、半乳糖、果糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、山梨醇、甘露醇等。
在进一步的实施方案中，本发明可以涉及药物脂质载料组合物的使用，所述药物脂质载料组合物包括白色脂肪肽(或者功能性片段或功能性衍生物)、一种或多种脂质和水性溶剂。如在本文中所使用的，术语“脂质”将被定义为包括宽范围的一系列在水中特征性地不溶的且用有机溶剂可提取的物质中的任一种。该宽的化合物类别是本领域技术人员熟知的，并且如术语“脂质”在本文中进行使用那样，它不限于任何特定的结构。例子包括包含长链脂族烃及其衍生物的化合物。脂质可以是天然出现的或合成的(即，由人设计或生产的)。然而，脂质通常是生物物质。生物脂质是本领域熟知的，并且包括例如中性脂肪、磷脂、磷酸甘油酯、类固醇、萜类、脱脂脂质(lysolipid)、鞘糖脂、糖脂、硫苷脂、具有经醚和酯连接的脂肪酸的脂质和可聚合的脂质，以及其组合。当然，被本领域技术人员理解为脂质的、除了本文中具体描述的那些之外的其他化合物也被本发明的组合物和方法所包括。
本领域技术人员将会熟悉为了将组合物分散在脂质载料中可以采用的技术的范围。例如，可以将所述白色脂肪肽(或者功能性片段或功能性衍生物)或者白色脂肪肽抑制剂分散在包含脂质的溶液中，用脂质溶解，用脂质乳化，与脂质相混合，与脂质相组合，共价键合至脂质，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束或脂质体中或与胶束或脂质体相复合，或者与脂质或脂质结构相联合，通过本领域普通技术人员已知的任何手段。分散可能导致或不导致脂质体的形成。
向动物患者施用的本发明的组合物的实际给药量可以通过身体的和生理学的因素，例如体重、病况的严重度、正在治疗的疾病的类型、先前的或同时发生的治疗干预、患者的特发病和施用途径来确定。取决于施用的剂量和途径，优选剂量的和/或有效量的施用的次数可以根据受试者的应答而变化。在任何情况下，负责施用的医师将会确定组合物中活性成分的浓度和对于个体受试者的合适剂量。
在某些实施方案中，药物组合物可以包含例如至少大约0.1％的活性化合物。在其他实施方案中，活性化合物例如可以占该单位剂量的重量的大约2％至大约75％，或大约25％至大约60％，和任何从其中可导出的范围。自然，可以以这样的方式来准备在每个治疗有用的组合物中的活性化合物的量，即使得将会在该化合物的任何给定的单剂中获得合适的剂量。在制备这样的药物配制剂的领域中的技术人员将会考虑诸如可溶性、生物利用率、生物半衰期、施用途径、产品保存期以及其他药理学考虑的因素，并因此可以希望各种各样的剂量和治疗制度。
在其他非限制性的实例中，剂量也可以包含每次施用从大约1μg/kg体重，大约5μg/kg体重，大约10μg/kg体重，大约50μg/kg体重，大约100μg/kg体重，大约200μg/kg体重，大约350μg/kg体重，大约500μg/kg体重，大约1mg/kg体重，大约5mg/kg体重，大约10mg/kg体重，大约50mg/kg体重，大约100mg/kg体重，大约200mg/kg体重，大约350mg/kg体重，大约500mg/kg体重，至大约1000mg/kg体重或更多，以及从其中可导出的任何范围。在从本文所列数字中可导出的范围的非限制性实例之中，可以施用大约5mg/kg体重至大约100mg/kg体重，大约5μg/kg体重至大约500mg/kg体重等的范围，基于上面所描述的数字。
A.膳食组合物和配制剂
在本发明的优选的实施方案中，将所述白色脂肪肽(或者功能性片段或功能性衍生物)或者白色脂肪肽抑制剂配制成通过膳食途径进行施用。膳食途径包括其中所述组合物与消化道直接接触的所有可能的施用途径。特别地，本文中所公开的药物组合物可以通过口服、颊、直肠或舌下方式进行施用。如此，可以将这些组合物与惰性稀释剂或与可同化的食用载体一起进行配制，或者可以将它们包封在硬或软壳的明胶胶囊中，或者可以将它们压制成片剂，或者可以将它们与饮食食物直接相掺合。
在某些实施方案中，可以将活性化合物与赋形剂相掺合，并且以可摄取片剂、口含片剂、含锭、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆剂、糯米纸囊剂等的形式来进行使用(Mathiowitz等人,1997；Hwang等人,1998；美国专利号5,641,515、5,580,579和5,792,451，每篇文献特别地通过提及而以其整体合并入本文)。所述片剂、含锭、丸剂、胶囊等还可以包含下列：粘合剂，例如黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉、明胶或其组合；赋形剂，例如磷酸二钙、甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁或其组合；崩解剂，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸或其组合；润滑剂，例如硬脂酸镁；增甜剂，例如蔗糖、乳糖、糖精或其组合；矫味剂，例如薄荷油、冬青油、樱桃调味料、柑橘调味料等。当剂量单位形式是胶囊时，除了上述类型的材料外，它还可以包含液体载体。各种其他材料可以作为包衣剂而存在，或者要么修饰剂量单位的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊可以用紫胶、糖或两者进行包衣。当剂型是胶囊时，除了上述类型的材料外，它还可以包含诸如液体载体的载体。明胶胶囊、片剂或丸剂可以包有肠溶衣。肠溶包衣防止所述组合物在其中pH为酸性的胃或上肠道中变性。参见例如，美国专利号5,629,001。在到达小肠后，那里的碱性pH溶解所述包衣，并允许所述组合物被释放并被特化的细胞(例如，肠上皮细胞和派尔淋巴集结M细胞)吸收。糖浆剂或酏剂可以包含活性化合物、蔗糖(作为增甜剂)、羟苯甲酯和羟苯丙酯(作为防腐剂)、染料和调味料(例如，樱桃或柑橘风味)。当然，在制备任何剂量单位形式中所使用的任何材料应当是药学上纯的，并且在所采用的量之下是基本上无毒性的。另外，可以将活性化合物掺入到持续释放制剂和配制剂中。
对于口服施用，备选地可以将本发明的组合物与一种或多种赋形剂相掺合，以漱口剂、牙粉、口含片剂、口腔喷雾剂或舌下口服施用的配制剂的形式。例如，可以通过以所需要的量将活性成分掺入到合适的溶剂(例如，硼酸钠溶液(多贝尔溶液))中来制备漱口剂。备选地，可以将活性成分掺入到口服溶液(例如，包含硼酸钠、甘油和碳酸氢钾的溶液)中，或者分散在牙粉中，或者以治疗有效量添加至可以包含水、粘合剂、磨料、矫味剂、起泡剂和湿润剂的组合物。备选地，可以将所述组合物制成可以放置在舌头下面或者溶解在口中的片剂或溶液形式。
另外的适合于其他膳食施用方式的配制剂包括栓剂。栓剂是具有各种不同重量和形状的固体剂型，其通常加入了药物，用于插入直肠。在插入后，栓剂变软、融化或溶解在腔液中。通常，对于栓剂，传统的载体可以包括例如聚亚烷基二醇、甘油三酯或其组合。在某些实施方案中，栓剂可以从包含例如在大约0.5％至大约10％，和优选地大约1％至大约2％的范围内的活性成分的混合物来形成。
B.肠胃外组合物和配制剂
在进一步的实施方案中，可以通过肠胃外途径来施用所述白色脂肪肽(或者功能性片段或功能性衍生物)或者白色脂肪肽抑制剂。如在本文中所使用的，术语“肠胃外(的)”包括绕开消化道的途径。特别地，本文中所公开的药物组合物可以例如但不限于以静脉内、真皮内、肌内、动脉内、鞘内、皮下或腹膜内方式进行施用(美国专利号6,7537,514、6,613,308、5,466,468、5,543,158、5,641,515和5,399,363，每篇文献特别地通过提及而以其整体合并入本文)。
可以在合适地与表面活性剂(例如，羟丙基纤维素)相混合的水中制备作为游离碱或药理学上可接受的盐的活性化合物的溶液。也可以在甘油、液体聚乙二醇和其混合物中和在油中制备分散体。在平常的储存和使用条件下，这些制剂包含防腐剂以防止微生物生长。适合于可注射使用的药物形式包括无菌水性溶液或分散体，和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉剂(美国专利5,466,468，其特别地通过提及而以其整体合并入本文)。在所有情况下，所述形式必须是无菌的，和必须是流动的，到可容易地进行注射的程度。它必须在制造和储存条件下是稳定的，并且必须免于受到微生物(例如，细菌和真菌)的污染作用的影响。所述载体可以是溶剂或分散介质，包含例如水、乙醇、多元醇(即甘油、丙二醇和液体聚乙二醇，等等)，其合适的混合物，和/或植物油。可以通过下述方式来维持适当的流动性：例如，通过使用包衣剂，例如卵磷脂；在分散体的情况下，通过保持所要求的颗粒大小；和通过使用表面活性剂。微生物作用的防止可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯类、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)来达到。在许多情况下，将会是优选的是包括等渗剂，例如糖或氯化钠。可以通过在组合物中使用延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)来达到可注射组合物的延长的吸收。
对于例如以水溶液来进行的胃肠外施用，所述溶液应当适当地进行缓冲(如果需要)，并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂变成等渗的。这些特别的水溶液尤其适合于静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用。关于这一点，可以采用的无菌水性介质将会是本领域技术人员已知的，鉴于本公开内容。例如，可以将一个剂量溶解在等渗的NaCl溶液中，并且要么添加皮下灌注液要么注射在所提议的输注位点(参见例如，“Remington’sPharmaceutical Sciences”,第15版,第1035-1038和1570-1580页)。取决于正在进行治疗的受试者的病况，必然将会出现一些在剂量方面的变化。在任何情况下，负责施用的人员将会确定对于个体受试者的合适剂量。此外，对于人施用，制剂应当满足由FDA生物制品标准办公室所要求的无菌性、热原性、一般安全性和纯度标准。
无菌可注射溶液通过下述方式来制备：以所需要的量将活性化合物掺入到具有上面列举的各种其他成分(如果需要)的合适的溶剂中，接着过滤灭菌。通常，分散体通过下述方式来制备：将各种经灭菌的活性成分掺入到包含基础分散介质和所需要的其他成分(来自上面所例举的那些)的无菌载料中。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，这些技术从其事先经无菌过滤的溶液产生活性成分加上任何另外的所希望的成分的粉末。将粉末状的组合物与液体载体(例如，水或盐水溶液)(具有或不具有稳定剂)相组合。
C.各色各样的药物组合物和配制剂
在本发明的其他优选的实施方案中，可以将活性化合物即白色脂肪肽(或者功能性片段或功能性衍生物)或者白色脂肪肽抑制剂配制成用于通过各种各色各样的途径进行施用，例如局部表面(即，经皮的)施用、粘膜施用(鼻内、阴道等)和/或吸入。
用于局部表面施用的药物组合物可以包含被配制成用于加入了药物的应用(例如，软膏剂、糊剂、霜剂或粉剂)的活性化合物。软膏剂包括所有用于局部表面应用的油质的具有吸附、乳化和水溶解基质的组合物，而霜剂和洗剂是仅包含乳化基质的那些组合物。局部表面施用的药剂可以包含渗透增强剂以促进活性物质穿过皮肤的吸附。合适的渗透增强剂包括甘油、醇类、烷基甲基亚砜、吡咯烷酮类和月桂氮
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酮。关于用于局部表面应用的组合物的可能的基质包括聚乙二醇、羊毛脂、冷霜和矿脂，以及任何其他合适的吸收、乳化或水溶性软膏剂基质。局部表面制剂还可以包含乳化剂、胶凝剂和抗微生物的防腐剂，作为用于保存活性成分和提供均匀混合物的必需品。本发明的经皮施用还可以包括“贴剂”的使用。例如，所述贴剂可以在固定的时间段期间以预先确定的速率和以连续的方式提供一种或多种活性物质。
在某些实施方案中，所述药物组合物可以通过滴眼剂、鼻内喷雾剂、吸入剂和/或其他气溶胶递送载料来进行递送。用于通过鼻气溶胶喷雾剂将组合物直接递送至肺的方法已经描述在例如美国专利号5,756,353和5,804,212(每篇文献特别地通过提及而以其整体合并入本文)中。同样地，通过使用鼻内微颗粒树脂(Takenaga等人,1998)和溶血磷脂酰甘油化合物(美国专利号5,725,871，其特别地通过提及而以其整体合并入本文)的药物递送也是制药领域中熟知的。同样地，以聚四氟乙烯支持基体的形式的透粘膜药物递送描述在美国专利号5,780,045(其特别地通过提及而以其整体合并入本文)中。
术语“气溶胶”是指分散在液化的或加压的气体推进剂中的微细固体或液体颗粒的胶体系统。用于吸入的本发明的典型气溶胶将会由在液体推进剂或液体推进剂和合适溶剂的混合物中的活性成分的悬浮液组成。合适的推进剂包括烃和烃醚。合适的容器将会根据推进剂的压力要求而变化。气溶胶的施用将会根据受试者的年龄、体重以及症状的严重度和应答而变化。
IX.本公开内容的试剂盒
可以在试剂盒中包含本文中所描述的任何组合物。在一个非限制性的实例中，可以在试剂盒中包含白色脂肪肽(或者功能性片段或功能性衍生物)和/或白色脂肪肽抑制剂。因此，所述试剂盒将会在合适的容器器具中包含白色脂肪肽(或者功能性片段或功能性衍生物)和/或白色脂肪肽抑制剂。
可以在水性介质中或者以冻干的形式包装所述试剂盒的组分。所述试剂盒的容器器具将通常包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其他容器器具，在其中可以放置组分，并且优选地，合适地分成等份。当在试剂盒中存在超过一种组分时，该试剂盒还将通常包含第二、第三或其他另外的容器，在其中可以分开地放置所述另外的组分。然而，可以在小瓶中包含组分的各种组合。本发明的试剂盒还将典型地在紧密封闭下包括用于包含所述白色脂肪肽(或者功能性片段或功能性衍生物)和/或白色脂肪肽抑制剂的器具和任何其他试剂容器以用于商业销售。这样的容器可以包括注塑或吹塑的塑料容器，在其中保留所希望的小瓶。
当在一种和/或多种液体溶液中提供所述试剂盒的组分时，所述液体溶液是水溶液，其中无菌水溶液是特别优选的。还可以将所述白色脂肪肽(或者功能性片段或功能性衍生物)或者白色脂肪肽抑制剂组合物配制成可用注射器注射的组合物。在这种情况下，所述容器器具本身可以是注射器、移液管和/或其他此类器械，从其中可以将所述配制剂施加至身体的被感染的区域，注射到动物中，和/或甚至施加至所述试剂盒的其他组分和/或与所述试剂盒的其他组分相混合。
但是，所述试剂盒的组分可以以干燥的粉末形式提供。当以干燥的粉末形式提供试剂和/或组分时，所述粉末可以通过添加合适的溶剂来进行重构。预想了还可以在另一个容器器具中提供所述溶剂。
本发明的试剂盒还将典型地在紧密封闭下包括用于包含小瓶的器具以用于商业销售，例如注塑和/或吹塑的塑料容器，在其中保留所希望的小瓶。
所述试剂盒可以包含分别配制成食欲刺激药或食欲遏抑药的白色脂肪肽(或者功能性片段或功能性衍生物)或者白色脂肪肽抑制剂。
在特别的实施方案中，所述试剂盒进一步包含一种或多种用于体重减轻或体重增长的组合物，其包括例如食欲遏抑药或食欲刺激药。在某些实施方案中，所述试剂盒包含一种或多种用于从个体获得样品和/或加工样品的器械和/或试剂。
实施例
下面的实施例被包括用于证明本发明的优选的实施方案。本领域技术人员应当意识到，在下面的实施例中所公开的技术代表了被发明人发现在本发明的实施中工作良好的技术，并因此可以被认为构成了关于其实施的优选方式。然而，鉴于本公开内容，本领域技术人员应当意识到，可以在所公开的特定实施方案中作出许多变化并仍然获得相像或相似的结果，而不背离本发明的精神和范围。
实施例1
对于维持最佳脂肪量来说关键的脂肪衍生多肽激素
与新生儿早老样综合征(NPS)相关的脂肪营养不良。NPS以先天性的、由于皮下脂肪组织减少而引起的极度消瘦(主要影响脸和四肢)为特征(Hou等人,2009；O’Neill等人,2007)。该表型典型地在出生时是明显的(和甚至在出生前由于子宫内生长迟缓)，其中具有由于皮下脂肪缺乏而引起的薄皮肤和突起的脉管系统(O’Neill等人,2007)。在所有年龄，患者展示出比就年龄而言正常的值低几个标准偏差的体重指数(BMI)(O’Neill等人,2007)。虽然NPS患者看起来由于面部畸形特征和减少的皮下脂肪而是早老样的，但他们不具有真正早衰的惯常特征例如白内障、头发过早变灰或胰岛素抵抗(O’Neill等人,2007)。在本文中，通过临床检查，鉴定了两个个体具有NPS并且表征了驱动其极度消瘦表型的机制。这两名患者都具有极低的BMI(图1b)，并且显著地展示出减少的皮下脂肪，其主要影响脸和四肢，而相对放过了臀部区域(图1a)。这两名患者都具有正常的空腹血浆葡萄糖和胰岛素水平，这暗示他们具有正常的胰岛素敏感性和葡萄糖处理(O’Neill等人,2007)。他们是其家族中唯一患病的成员，这最初暗示了要么是潜在的从新的突变要么是隐性遗传(图1b)。
全外显子组测序鉴定出了在NPS中的3’FBN1突变。全外显子组和Sanger测序的组合在这两名患者中都鉴定出了在FBN1基因中的从新的、杂合的3’突变(图1b、1c)。对于相似病例的文献搜索揭示了五个病例报告，其描述了相同的表型以及FBN1 3’截短性突变(Graul-Neumann等人,2010；Horn和Robinson等人,2011；Goldblatt等人,2011；Takenouschi等人,2013；Jacquinet等人,2014)。所有7名患者(包括本公开内容的那些)都被诊断为具有NPS，并且所有都具有在大约8600个碱基对编码区的71个碱基对区段之内的截短性突变(图1c)。所有7个突变都出现在倒数第二个外显子的3’50个核苷酸处(图1c)，预测其导致从无义介导的衰变逃逸，并且其导致由于移码而引起的原纤蛋白-1蛋白质的C-末端截短(图1d)。FBN1是与马方综合征(一种典型地影响眼睛、大血管(例如主动脉)和骨骼的结缔组织病症)相关的基因(Pyeritz等人,2009)。患者典型地是高且瘦的，并且具有相对于其身高而言的长的两臂伸展距离(Pyeritz等人,2009)。虽然本公开内容的患者显著地看起来非常不同于经典的马方综合征患者，但仔细的身体检查在本公开内容的患者中揭示出了大部分的马方综合征的特征，基于用于诊断马方综合征的经修订的Ghent疾病分类学(Loeys等人,2010)。这通过五个发表的将NPS与在FBN1中的3’突变相联系的病例报告而得到证实(Graul-Neumann等人,2010；Horn和Robinson等人,2011；Goldblatt等人,2011；Takenouschi等人,2013；Jacquinet等人,2014)。因此，这些NPS患者组合了马方综合征表型(脉管的、眼睛的和骨骼的特征)与部分的脂肪营养不良。脂肪营养不良给予NPS患者独特的外表，并且使得诊断相关的马方综合征的任务变得相对具有挑战性。这可以解释为什么在这些患者中鉴定出FBN1突变之前，几十年来将NPS描述为与马方综合征没有关系的其自己的独特的临床实体(OMIM 264090)。原纤蛋白-1是一种模块式蛋白质，因为影响不同模块的突变导致不同的表型(马方综合征、肢端过小性发育不良、冻体性发育不良(Geleophisicdysplasia)、皮肤僵硬综合征、韦-马综合征)(Pyeritz等人,2009；Davis等人,2012)。因此，将还有其他的综合征与原纤蛋白-1突变相联系不是令人惊奇的。采用可靠的临床和分子诊断，本实施例阐明了原纤蛋白-1C-末端截短性突变导致脂肪营养不良的机制。
FBN1在白色脂肪组织中高度地且动态地表达。FBN1在人脂肪组织中以高水平表达(Biogps.org，智人(Homo sapien)探针组：202765_s_at)，与减少的皮下脂肪的NPS表型相一致。在小鼠中，相比于褐色脂肪组织和骨骼肌而言，Fbn1在白色脂肪组织中特异性地表达(图2a)。人的前脂肪细胞向脂肪细胞的分化导致FBN1表达的增加(图2b)，而在暴露于高脂肪饮食数周的小鼠中观察到在腹股沟脂肪组织中Fbn1表达减少(图2c)。
白色脂肪肽是原纤蛋白原的循环性C-末端切割产物。原纤蛋白-1被制造为2871个氨基酸的蛋白原，其从细胞中分泌并被称为弗林蛋白酶的细胞外蛋白酶在C-末端处进行切割(Milewicz等人,1995；Ritty等人,1999；Raghunath等人,1999；Wallis等人,2003)。这导致释放出140个氨基酸的C-末端切割产物(CT多肽)和充当细胞外基质组分的成熟的原纤蛋白-1(Milewicz等人,1995；Ritty等人,1999；Raghunath等人,1999；Wallis等人,2003)。所有七个NPS突变簇集在切割位点周围，这导致所述CT多肽的杂合丢失(图1d)。相比于该蛋白质的其他部分而言，并且当与其他物种相比较时，所述CT多肽显示出最高的进化保守性，这暗示了重要的生物学作用(图3a、3b)。认为在正常的生理条件下，所述CT多肽保持稳定并且具有与NPS表型有关的独立功能。Western印迹法确认了在来自人和小鼠的血浆中独特的、离散的16-kDa交叉反应性实体的存在(图3c、3d)。使用来自肥胖的小鼠和人的血浆，发现所述CT多肽的水平在这两个物种中均与肥胖性成正比(图3c、3d)。由于FBN1在白色脂肪组织中高度表达并且在临床上通过白色脂肪量的减少来辨别出NPS表型，因此将所述CT多肽依照“Aspros”(希腊语“白色的”)命名为白色脂肪肽(Asprosin)。
白色脂肪肽在体外挽救与NPS相关的脂肪形成性分化缺陷。通过使用来自具有NPS的患者和未患病对照受试者的真皮成纤维细胞，在体外测试了NPS突变对于细胞的脂肪形成性分化的影响。将细胞暴露于脂肪形成诱导混合物七天，所述脂肪形成诱导混合物诱导许多转录因子和脂肪特异性基因的增加的表达(Jaager等人,2012)。与WT细胞相比，NPS突变体成纤维细胞在脂肪形成性分化方面是惊人地缺陷的(图4a)。该缺陷可以通过过表达WTFBN1(图4d)或白色脂肪肽的分泌形式来挽救，但无法通过无信号肽地表达的白色脂肪肽(这导致其细胞内截留)来挽救(图4c、4e、4f)。为了确认白色脂肪肽的脂肪形成效应的细胞外作用场所，在大肠杆菌中产生了重组的白色脂肪肽。将重组的白色脂肪肽添加至培养基促进了在WT细胞中的脂肪形成性分化(图4g)，并且足以挽救在NPS突变体细胞中的脂肪形成缺陷(图4h)。
高的循环白色脂肪肽是致肥胖的和致糖尿病的。为了最初测试白色脂肪肽的体内效应，在用标准食物进行饲喂的WT小鼠中，通过使用携带在CMV启动子的控制之下的关于WTFBN1或GFP的cDNA的腺病毒，使其在肝脏中进行表达。在暴露于FBN1腺病毒的小鼠中，大量的白色脂肪肽存在于循环中(图7)，这暗示了原纤蛋白原被肝脏正确地分泌和切割。在腺病毒注射后十天，在小鼠上的MRI扫描显示了在具有较大数量的循环白色脂肪肽的小鼠中脂肪量具有2.5倍的增加(图5a)，但瘦肉量没有变化(图5b)。此类小鼠的体重相对于对照小鼠的体重而言相对应地增加(图5c)。
第二种方法依靠在用标准食物进行饲喂的WT小鼠中每天皮下注射高度纯化的重组的白色脂肪肽或GFP十天。与腺病毒方法相似，十天的每天皮下白色脂肪肽注射引起相比于GFP注射而言显著的脂肪量增加(图5d)。与腺病毒实验相反，注射了白色脂肪肽和GFP的小鼠的瘦肉量均显示出轻微但显著的降低(图5e)，这可能反映了由于每天处理和注射而强加在小鼠上的应激。不管怎样，这两种方法都证明了剧烈增加循环白色脂肪肽的量在体内驱动脂肪扩张。在这两个实验中，腹股沟白色脂肪的显微镜检查均在暴露于白色脂肪肽的小鼠中显示了较大的脂肪细胞体积(图8)。与在这些小鼠中较大的肥胖性相一致，存在较高水平的血浆瘦蛋白和脂连蛋白(这是其循环水平已知与脂肪量直接成正比的脂肪衍生激素)(图9)。同时，存在较低水平的血浆甘油三酯和游离脂肪酸(图10)，这可能反映了在较大的脂肪细胞中较大数量的脂质隔离。
鉴于在暴露于较大数量的循环白色脂肪肽的小鼠中存在肥胖症的开始，因而在这些动物中检定了葡萄糖内环境稳定。禁食的、用白色脂肪肽进行处理的小鼠显示出高血糖症和高胰岛素血症(图11)，这暗示了胰岛素抵抗。葡萄糖和胰岛素耐量测试这两者均与高的循环白色脂肪肽的致糖尿病效应相一致(图5g、5h、5i、5j)。与肥胖症和胰岛素抵抗的状态相一致，在暴露于较大数量的循环白色脂肪肽的动物的肝脏中存在增加的脂质积累(图12)。总之，循环白色脂肪肽的剧烈增加被发现在小鼠中具有强有力的致肥胖和致糖尿病效应。
截短的原纤蛋白原的显性负调控效应。除了极度消瘦之外，NPS患者还是胰岛素敏感的(O’Neill等人,2007)。暴露于过多循环白色脂肪肽的小鼠的相反的生理学特性谱证实了，NPS表型可能是由于降低的循环白色脂肪肽水平而引起的。它们的杂合基因型预测，NPS患者应当具有相比于未患病对照而言一半的循环白色脂肪肽，但在这些患者中根本不存在可检测的循环白色脂肪肽(图6a)。最近已显示，所述CT多肽对于原纤蛋白原从细胞中分泌来说是必需的(Jensen等人,2014)。在其不存在的情况下，从无义介导的衰变逃逸的截短的原纤蛋白原依然被截阻在细胞内(Jensen等人,2014)。因此，认为在NPS中突变型的截短的原纤蛋白原以显性负调控方式起作用以阻止从WT等位基因的原纤蛋白原的分泌。这还可以解释为什么NPS表型不同于经典的马方综合征，至少在具有更多N-末端截短的患者中，其然后经历无义介导的衰变或全基因缺失－两者都将不会表达截短的原纤蛋白原。为了测试该理论，在来自NPS细胞以及来自具有突变型的截短的原纤蛋白原过表达的WT细胞的细胞培养基中检定了白色脂肪肽的水平。如所预期的那样，在这两种情况下，在培养基中都存在显著降低的白色脂肪肽水平(图6b、6d)。另外，在WT细胞中突变型原纤蛋白原的过表达足以降低原纤蛋白-1分泌到培养基中的量，这暗示了在NPS情况下所看到的对于马方综合征表型的发病机制的显性负调控模式(图13)。
方法
研究受试者和伦理学声明。在贝勒医学院，根据三个经机构审查委员会(Institutional Review Board)批准的方案之一，在参与之前从所有受试者获得知情同意。
临床评价。临床医师通过直接病史、身体检查和家族史分析来评估研究受试者。审查了以图表记录和笔记形式的临床信息。还通过电话与这些受试者进行了访谈。与患者一起对家族进行了访谈。当可得时，审查来自先前的诊断研究、手术报告或放射学研究的报告。在知情同意后，在合适的麻醉剂和通用的预防措施之下进行用于分离真皮成纤维细胞的皮肤活组织检查。
全外显子组捕获和测序。使来自患者#1及其父母的基因组DNA经历全外显子组测序(三件套(trio)分析)。用于全外显子组测序的方法先前已经详细进行了描述(Lupski等人,2013)。总之，通过在Covaris平板(Covaris,Inc.Woburn,MA)中进行超声处理来使1mg的基因组DNA片段化。如所描述的那样，将基因组DNA样品构建成Illumina成对末端文库(Lupski等人,2013)。将预捕获文库汇聚在一起，并且在溶液中与BCM-HGSC CORE外显子组捕获设计物(Bainbridge等人,2011)(52Mb，Nimble-Gen)进行杂交。将捕获的DNA片段在Illumina HiSeq 2000平台上进行测序，从而产生9-10Gb/样品，并且取得以206或更大的最小深度覆盖了90％的所靶向的外显子组碱基的平均值。
数据分析。使用HGSC Mercury分析管线，将所产生的序列读取值作图并与GRCh37(hg19)人基因组参照合集进行比对。使用Atlas2套件来确定和调用变体，从而产生变体调用文件(VCF：variant call file)。通过使用内部开发的注释工具套件对高质量的变体进行注释。
Sanger测序。使来自患者#2的基因组DNA经历Sanger测序。通过使用Primer3来设计引物以包括外显子65和66，其中包括FBN1基因的内含子-外显子边界。通过使用Lasergene Seqman软件来分析Sanger读取值。
动物。对于所有体内研究，使用10周龄雄性WT C57/Bl6小鼠。将小鼠以2–5只/笼进行笼养，在12小时光照/12小时黑暗的循环中，可随意摄取食物和水。通过尾静脉注射，使小鼠暴露于由腺病毒介导的转基因发生(1011个病毒颗粒/小鼠)。于10天期间每天通过皮下注射用2.6μM重组的具有His标签的白色脂肪肽或重组的GFP对小鼠进行注射。在病毒输注或肽注射后10天，处死小鼠并且分离出血浆和各个器官。贝勒医学院的机构动物照管和使用委员会(Institutional Animal Care and Utilization Committee)批准了所有实验。
FBN1和GFP腺病毒。通过使用标准的Ad5载体系统将FBN1编码区克隆在CMV启动子的控制之下，来产生携带FBN1 cDNA的腺病毒。相应的GFP腺病毒从贝勒医学院的载体开发中心(Vector Development Core)购买。
重组的白色脂肪肽和GFP。克隆人的FBN1(2732-2871氨基酸)cDNA并随后亚克隆到pSPE质粒中以在大肠杆菌中进行表达。在大肠杆菌中表达出的融合蛋白的长度为146个氨基酸，其包含在N-末端处的具有6个氨基酸的His标签和具有140个氨基酸的野生型C-末端FBN1(2732-2871氨基酸)。从Thermo Scientific购买具有His标签的GFP作为对照多肽。
身体组成和血清分析。用ECHO-MRI系统(Echo medical systems，Texas)来分析身体组成。从通过心脏穿刺而获得的血液制备小鼠血清，并且用COBAS Integra 400plus分析仪(Roche)进行分析。血浆瘦蛋白、FFA、脂连蛋白和甘油三酯水平通过分别使用小鼠瘦蛋白ELISA试剂盒(Millipore)、NEFA C测试试剂盒(Wako)、小鼠脂连蛋白ELISA试剂盒(Millipore)和血清/血浆甘油三酯检测试剂盒(Sigma)来进行测量。
组织学。将小鼠腹股沟脂肪组织样品在10％甲醛中进行固定以用于H&E染色。将经冷冻的肝脏用于油红O染色以评价肝脏的甘油三酯含量。
葡萄糖耐量测试(GTT)和胰岛素耐量测试(ITT)。对于GTT，在6小时的禁食期后，腹膜内注射1.5g葡萄糖/kg体重。对于ITT，在4小时的禁食期后，腹膜内注射常规胰岛素(Humulin R；0.75个单位/kg体重)。血糖水平通过使用葡萄糖计量仪(Life Scan)来进行测量。
表达载体。使用pCMV6-Neo载体系统，将WT FBN1(1-2871氨基酸)、具有140个氨基酸的白色脂肪肽(2732-2871氨基酸)和在N-末端处附着有天然的具有27个氨基酸的FBN1信号肽的白色脂肪肽(氨基酸1-27+氨基酸2732-2871)亚克隆在CMV启动子的控制之下。使用表达GFP的相同载体或空载体作为对照。
细胞培养。使用标准的实验方案，使从NPS受试者中分离出的人真皮成纤维细胞或者来自未患病对照受试者的WT真皮成纤维细胞经历脂肪形成性分化。为了刺激脂肪形成，在7天期间，给培养基补充2uM胰岛素、1uM地塞米松、0.25mM异丁基甲基黄嘌呤和10-7M罗格列酮。对于体外转基因发生，采用使用表达质粒的标准转染方法。
RNA和蛋白质分析。采用标准的RNA提取程序(来自Qiagen的RNeasy Mini Kit)。使用Superscript III试剂盒(Invitrogen)，采用制造商的实验方案来进行反转录。对于基因表达分析，使用来自Roche(通用探针文库(Universal Probe Library))的序列特异性引物和探针来进行QPCR。将TBP用作关于所有基因表达测定法的内部对照。在血浆或细胞培养基上通过使用标准方法来进行Western印迹法，其中使用针对白色脂肪肽的小鼠单克隆抗体，其购买自Abnova(目录号H00002200-M01)。针对原纤蛋白-1的小鼠单克隆抗体购买自Abcam(目录号ab3090)。对于在培养基上的Western印迹法，使细胞经历持续7天的脂肪形成性分化，随后用来自Mediatech的补充有Cellgro ITS(胰岛素、转铁蛋白、硒)的无血清的DMEM代替该诱导培养基并持续3天。在那时，在进行Western印迹法之前，使用Amicon Ultra-2离心过滤器装置来浓缩培养基。
统计学方法。所有结果呈现为平均值±SEM。在合适的情况下，通过非成对Student’s t检验或ANOVA来计算P值。＊P<0.05，＊＊P<0.01，和＊＊＊P<0.001。
实施例2
测定原纤蛋白-1C-末端多肽的功能增益的体内影响
在50年前鉴定出了原纤蛋白-1蛋白质(Guba等人,1964)。关于其在维持细胞外基质(特别是在主动脉平滑肌中)方面的功能以及其在健康和疾病方面的作用已经知道很多(Davis和Summers等人,2012；Reinhardt等人,1995)。其结构已知是“模块式的”，这意味着在该蛋白质的不同部分中的突变导致不同的临床后果。如此，已将它与马方综合征、肢端过小性发育不良、冻体性发育不良、皮肤僵硬综合征和韦-马综合征相联系(Davis和Summers，2012)。通过使用全外显子组测序以及现有的文献，还将它与称为新生儿早老样综合征(NPS)的罕见的极度消瘦病症相联系。
NPS是常染色体显性遗传病症，其导致由于皮下脂肪组织急剧减少而引起的极度消瘦(图1)(O’Neill等人,2007；Hou等人,2009)。患者的表型与经典的马方综合征相重叠但又与之不同，尤其是当达到其脂肪营养不良时(Graul-Neumann等人,2010；Takenouchi等人,2013；Horn等人,2011；Goldblatt等人,2011)。因此，对突变的位点和类型进行了表征以解释所述差异。2名在本公开内容中鉴定出的患者和4名以前描述了的患者(Graul-Neumann等人,2010；Takenouchi等人,2013；Horn等人,2011；Goldblatt等人,2011)都具有在FBN1的倒数第二个外显子中的C-末端截短突变。这6个截短性突变在～8600bp基因中处于彼此的70bp之内。特别地，由于从未与在FBN1的其他部分中发现的突变相联系地描述过脂肪营养不良，因此看起来清楚的是，这些突变型蛋白质的共享特征以某种方式影响脂肪生物学。研究已揭示了独立地有功能的原纤蛋白-1C-末端多肽，其一般在它从细胞中分泌后被从亲本蛋白质上切掉(Ritty等人,1999；Raghunath等人,1999；Wallis等人,2003；Milewicz等人,1995)。初步的实验已显示，所述C-末端多肽的单倍体机能不全导致有缺陷的脂肪分化。一个目标是表征该多肽的过表达是否足以使WT和脂肪营养不良的小鼠增长脂肪量。这对于导致脂肪量减少的泛发性和局限性的脂肪营养不良病况来说均具有直接的治疗暗示。
可以在体内测试在脂肪内环境稳定方面原纤蛋白-1C-末端肽的所预测的充足性。这些研究可以在用重组的C-末端多肽以及携带关于其的cDNA的腺病毒进行处理的小鼠中评估所述C-末端肽对于脂肪增积能力的影响。可以产生和挖掘全局基因表达和代谢物组学数据集以发展关于由原纤蛋白-1C-末端多肽所采用的途径的可测试的假说。
实验方法：
A.在小鼠中注射重组的原纤蛋白-1C-末端多肽和GFP：每两天使用皮下方法，用各20ug的重组C-末端多肽或重组GFP对8周龄C57/Bl6 WT和PPARγ-零(脂肪营养不良的)小鼠进行注射，总共五个剂量。事先通过使用细菌表达以及随后的纯化和内毒素去除来产生所述重组多肽。各20ug的剂量是基于评估了在小鼠中的内源性血浆水平的初步数据而决定的。在注射后10天，在所有测定法中对在每个性别相匹配的组中的8只小鼠进行比较。
B.在小鼠中注射携带原纤蛋白-1C-末端多肽和GFP的腺病毒载体：用各1011个病毒颗粒的事先产生的表达与信号肽相融合的C-末端多肽的腺病毒(图14)或表达GFP的腺病毒对8周龄C57/Bl6 WT和PPARγ-零(脂肪营养不良的)小鼠进行注射。基于使用该技术的以前的实验，大多数的腺病毒载量将会感染肝脏(Chopra等人,2008；Chopra等人,2011)。在通过肝细胞进行过表达后，将会由所述细胞分泌与天然原纤蛋白-1信号肽相融合的C-末端多肽。在注射后两周，就所述多肽的血浆水平来对在每个性别相匹配的组中的8只小鼠进行比较，随后为其他下游测定法。
C.测量所述C-末端多肽的过表达对于肥胖性的影响：将小鼠麻醉，并记录体重和身长。将它们放置在DEXA分析仪(Oosting等人,2012)中，并且在进行真正的测量扫描之前进行侦察扫描。每只小鼠的照射剂量设定在300μSv。对于数据分析，定义了目的区域。所述分析可以包含不包括头部区域的全身测量。通过软件将计数数据转化成骨和非骨组分。产生关于每只小鼠的体重、身长、骨和脂肪量、骨量密度和瘦肉量的信息。DEXA测量和分析在BCM的“小鼠表型分析核心设施(Mouse Phenotyping Core Facility)”上进行。在安乐死之后，提取腹股沟脂肪垫，照相，并称重。
D.通过进行无偏血浆代谢物特性谱绘制来测量所述C-末端多肽的过表达对于全 局代谢变化的影响：为了鉴定作为原纤蛋白-1C-末端多肽过表达的后果的整个生物体范围的代谢变化，采用了RNAseq。通过放血来收集来自禁食的和饲喂的小鼠的EDTA-血浆。将冷冻的、经编号的样品送至Metabolon,Inc.(Durham，NC)，并且通过仅与原始来源相联系的唯一的标识符登记到Metabolon系统中。为了质量控制目的，在提取过程中在第一步之前添加回收标准物。样品制备使用有专利权的系列的有机和水性提取以去除蛋白质，而同时允许小分子的最大回收。将经提取的样品分成相等的部分以用于通过气相色谱法/质谱法(GC/MS)和液相色谱法/质谱法(LC/MS)平台来进行分析。从包含少量每种样品的均质汇集物产生几个技术重复样品。将原始MS数据文件加载到关系数据库中。通过使用Metabolon的有专利权的峰积分软件来鉴定峰，并将组成部分储存在分开的和特别设计的复式数据结构中。通过与经纯化的标准物或反复出现的未知实体的文库条目进行比较来鉴定化合物。已知化学实体的鉴定基于与超过1000种商购可得的、在LIMS中登记的、用于分配给LC和GC平台的经纯化的标准化合物进行比较。种群统计状况通过下列来呈现：关于分类变量的频率和关于连续变量的平均值±标准偏差(平均值±SD)，随后为Bonferroni测试后分析以获得统计学显著性。通过使用该技术，可以以无偏方式同时检定出大约3000种单独的处于各种类别的血浆代谢物(酰基肉碱、有机酸、氨基酸、肽、离子等)。
E.使用RNAseq在全局基因表达的水平上评估所述C-末端多肽的脂肪特异性过表 达对于脂肪内环境稳定的影响：为了鉴定作为原纤蛋白-1C-末端多肽过表达的后果的在脂肪组织中的整个基因组范围的转录物组变化，采用了RNAseq。从先前快速冷冻的腹股沟脂肪组织中分离总RNA。在经汇集的来自5个单独的小鼠腹股沟白色脂肪储存库的RNA样品上进行测序反应。将流动槽(flowcell)的四个泳道用于在Genome Analyzer II上进行样品的测序。Genome Analyzer(GA)运行38个循环。关于循环1–38用GA管线软件(v1.3，Illumina软件)分析来自GA的图像以进行图像分析、碱基确名和与参照基因组的序列比对。用ELAND软件对序列进行比对。将经比对的读取值用作用于Illumina CASAVA程序(v1.0)的输入，以计数与参照基因组的基因、外显子和剪接点进行比对的序列读取值。将与特征(基因、外显子和剪接点)进行比对的序列的原始计数用CASAVA通过将原始计数除以相关特征的长度来进行标准化。将“读取计数/基因”用作用于DEGseq和DEseq的输入以鉴定差异表达的基因。这两个工具都是通过统计学程序包R和Bioconductor可得的。DEGseq和DESeq使用不同的统计学方法(泊松分布，负二项分布)来估计关于差异基因表达的概率。将表达水平的P≤0.001和2-倍变化(经标准化的)用作截止标准。
在特别的实施方案中，可以预期本文中所描述的研究确立了原纤蛋白-1C-末端多肽对于脂肪增积和炎症这样的孪生过程的充足性。为了评估相同终点的目的，在本文中描述了两种功能增益方法。可以预期，即使一种方法失败，另一种也会提供结论性的结尾。由于缺乏关于天然多肽在血浆中的半寿期的信息，因而如果大多数的该肽被快速降解，那么重组多肽实验可能失败。在那种情况下，预期由腺病毒介导的转基因发生方法通过以足够量持续产生该多肽从而导致功能增益来避开该问题。以其真正的性质，过表达实验具有产生不反映正被测试的蛋白质的真实功能性的生理学状态的潜力。因此，需要谨慎地解释，和如果可能，在同时进行的功能丧失研究的背景下解释它们。在本文中提出的功能增益和功能丧失研究的集合式解释可以使得能够得出关于原纤蛋白-1C-末端多肽的真实体内功能的正确结论。
实施例3
测定原纤蛋白-1C-末端多肽的功能丧失的体内影响
原纤蛋白-1蛋白质包含C-末端切割位点(RGRKRR基元)，其已显示经历通过弗林蛋白酶/PACE的酶家族来进行的蛋白水解加工(Ritty等人,1999；Raghunath等人,1999；Wallis等人,2003；Milewicz等人,1995)。这导致两个片段，即功能性的原纤蛋白-1(～2500个氨基酸)，其依赖于所述切割事件以适当地插入到细胞外基质中(Raghunath等人,1999；Milewicz等人,1995)，和较小的C-末端多肽(～140个氨基酸)，其独立功能未知。导致NPS表型的在FBN1中的所有6个杂合突变的共同结果是绝大多数所述C-末端多肽的丧失。如果所述C-末端片段的单倍体机能不全的确对所述表型负责，那么恢复该片段至其正常水平应当导致挽救所述表型。在体外对该构思进行了探究，并且发现恢复所述C-末端多肽的表达以及通过将所述C-末端多肽添加至培养基来简单地将突变体细胞暴露于所述C-末端多肽，挽救了与NPS相关的脂肪分化和致炎症缺陷(图15)。
在体内使用了类似的方法。通过使用单克隆抗体来免疫隔离循环C-末端多肽(图16)以阐明其对于脂肪增积的必要性和对于针对肥胖症和代谢综合征的保护作用的潜力。这对于肥胖症和代谢综合征(由于未缓和的脂肪增积而引起的病况)两者来说均具有直接的治疗暗示。
实验方法：
A.将WT和遗传性肥胖的小鼠暴露于靶向原纤蛋白-1C-末端多肽的单克隆抗体：每天使用腹膜内方法，用500ug的抗-CT-原纤蛋白-1IgG或非特异性IgG对8-周龄C57/Bl6 WT和ob/ob(具有功能丧失性瘦蛋白突变的肥胖小鼠)小鼠进行注射，总共五个剂量。所述靶向原纤蛋白-1C-末端多肽的单克隆抗体事先已从Sigma Inc.获得，并且在内部进行了验证。在注射后10天，在所有测定法中对在每个性别相匹配的组中的8只小鼠进行比较。
B.测量所述C-末端多肽的丧失对于肥胖性的影响：如在目标1C中所描述的那样，通过使用DEXA扫描和腹股沟脂肪垫重量来测量原纤蛋白-1C-末端多肽的中和对于肥胖性的影响。评估了八只暴露于抗-CT-原纤蛋白-1IgG和对照IgG的性别相匹配的8周龄WT和ob/ob小鼠。
C.通过进行无偏血浆代谢物特性谱绘制来测量所述C-末端多肽的丧失对于全局 代谢变化的影响：通过放血来收集来自八只暴露于抗-CT-原纤蛋白-1IgG和对照IgG的性别相匹配的8周龄WT和ob/ob小鼠的EDTA-血浆。如在目标1D中所描述的那样，进行代谢物组学分析。
D.使用RNAseq在全局基因表达的水平上评估原纤蛋白-1C-末端多肽的丧失在脂 肪内环境稳定中的影响：从先前快速冷冻的来自十五只暴露于抗-CT-原纤蛋白-1IgG和对照IgG的性别相匹配的8周龄WT和ob/ob小鼠的腹股沟脂肪组织中分离总RNA。在经汇集的来自5个单独的小鼠腹股沟白色脂肪储存库的RNA样品上进行测序反应(N＝3)。如在本文中其他地方所描述的那样来进行RNAseq分析。
在特别的实施方案中，可以预期本文中所描述的研究确立了原纤蛋白-1C-末端多肽对于脂肪增积来说是必需的并且针对肥胖症具有保护作用。通过使用靶向原纤蛋白-1C-末端多肽的单克隆抗体来考虑的研究不像基因切除研究将会的那样纯净。但是，鉴于目标是研究这样的单克隆抗体作为针对肥胖症的治疗模式的用途，因而重要的是与非特异性抗体相比较地对其进行测试，在至少一些实施方案中。在其中该方法关于此类抗体确立了针对肥胖症的保护性作用的实施方案之中，例如用基因敲除研究来确认那些结果。
实施例4
图17显示，在已经用白色脂肪肽进行注射的小鼠中，增加的血浆CT多肽(白色脂肪肽)的量导致饮食过多。在本公开内容的实施方案中，方法涉及向需要增长体重或增加脂肪量的个体提供有效量的所述CT多肽。
在具有NPS或另一种其中个体有着不足的脂肪量的医学病况的个体中，所述个体可能消耗相比于不具有NPS或另一种此类医学病况的个体而言减少的每天的热量负荷。在关于这些个体的特别的实施方案中，可以向他们提供有效量的白色脂肪肽或者其功能性衍生物，以便增加他们的每天的热量负荷，例如通过增加他们的食欲。
实施例5
本公开内容的实施方案的意义
瘦蛋白的发现显示，导致体重极端状况的遗传病症具有在理解肥胖症、糖尿病和代谢综合征中非常能够提供信息的潜力(Friedman,2009)。本文中所描述的是一种新的多肽激素，即白色脂肪肽，其对于维持最佳脂肪量来说是必需的，并且其起源与原纤蛋白-1这种细胞外基质蛋白拴系在一起。由于它与内皮抑制素(一种血管发生的调节剂，其为胶原蛋白XVIII该不同的细胞外基质蛋白的C-末端切割产物)相像(O’Reilly等人,1997)，因此合理地认为有些细胞外基质组分可能已经演化为其功能不同于其亲本蛋白质的C-末端切割产物的运载者。
几个以前的研究已显示了原纤蛋白原如何地被分泌和可能地被弗林蛋白酶系统在细胞外切割(Graul-Neumann等人,2010；Horn和Robinson，2011；Goldblatt等人,2011；Takenouchi等人,2013；Jacquinet等人,2014)。该切割事件对于原纤蛋白-1的正确加工和其插入到细胞外基质中来说是必需的(Graul-Neumann等人,2010；Horn和Robinson，2011；Goldblatt等人,2011；Takenouchi等人,2013；Jacquinet等人,2014)。但是，另一种切割产物即具有140个氨基酸的C-末端多肽的命运仍是未知的。在本公开内容的实施方案中，NPS患者的基因型暗示了这样的可能性：所述C-末端多肽即白色脂肪肽在脂肪生物学中具有重要作用。本公开内容的数据显示，白色脂肪肽存在于循环中并且对于维持最佳脂肪量来说是必需的。在人中白色脂肪肽的丧失导致脂肪营养不良，而在小鼠中过多的白色脂肪肽导致脂肪扩张和葡萄糖不耐受(其为肥胖症和差的代谢健康的特征)的发展。事实上，在小鼠和人中在与差的代谢健康相关联的肥胖状态中存在提高的循环白色脂肪肽水平。相反地，具有很少的循环白色脂肪肽至没有循环白色脂肪肽的NPS患者的表型展示出极度消瘦和胰岛素敏感性，这表明在有些实施方案中降低白色脂肪肽有利于正面的代谢特性谱。这与一些类型的导致胰岛素抵抗的脂肪营养不良相反(Nolis等人,2013)。
在一个实施方案中，在NPS中胰岛素敏感性的保留是某些脂肪储存库(尤其是在臀部区域中)的放过，它们据推测保留了其响应于胰岛素的葡萄糖摄取能力。在另一个实施方案中，白色脂肪肽本身在小鼠中促进胰岛素抵抗，并因此在NPS中其不存在可以具有直接的胰岛素敏化效应。
数据表明，超出了将会从NPS基因型预测出的，在NPS中循环白色脂肪肽的极度减少至少部分地是从无义介导的衰变逃逸的被截阻在细胞内的突变型原纤蛋白原的显性负调控效应的结果。在特别的实施方案中，这就是为什么全基因缺失、非截短性突变或接近弗林蛋白酶切割位点的截短性突变导致马方综合征，但不导致额外的表征NPS的脂肪营养不良的特征(Pyeritz等人,2009)。
白色脂肪肽由于两个原因而是值得注意的。暴露于外源白色脂肪肽的小鼠在刚10天的时间就展示出其脂肪量的扩张和胰岛素抵抗。值得注意的是，这是在标准食物而不是高脂肪饮食的情况下取得的。第二，其编码区展示出相比于原纤蛋白原的其余部分而言极度高的进化保守性。这表明了可能由细胞表面受体介导的高度保守的功能。这样的假定的受体的身份还是未知的。因为，基于其表达特性谱，脂肪组织可能是较普遍的白色脂肪肽产生和分泌位点之一，因而可能看起来自相矛盾的是，白色脂肪肽对于脂肪细胞分化来说也是必需的。然而，存在无数的用于调节其产生器官的分子的例子。除了脂肪形成性分化和脂肪量扩张之外，在有些实施方案中，白色脂肪肽还调节脂肪组织(和也许其他组织)的其他功能。事实上，由白色脂肪肽介导的葡萄糖内环境稳定的扰动是否是经改变的脂肪量或经改变的脂肪活性的效应仍然是未知的。
结果提供了引人兴趣的治疗途径。最显而易见的是在NPS患者中简单地矫正缺陷。但是，重组的白色脂肪肽在具有继发于各种不同的病因学(例如高龄、癌症、HIV感染等)的恶病质的患者中是有用的。除了其他原因外，此类患者具有尤其因减少的脂肪量而引起的显著的虚弱(Mueller等人,2014；Pureza和Florea，2013；Gelato等人,2007；Agarwal等人,2013；Kulstad和Schoeller，2007)，并且可能从由白色脂肪肽所提供的脂肪扩张中受益。相反地，降低循环白色脂肪肽可以在具有肥胖症和糖尿病的患者中引起脂肪量的降低和经改善的血糖控制。在某些实施方案中，与NPS相关的脂肪营养不良和肥胖症是白色脂肪肽方程式的两端，一端太少而另一端太多。无论如何，在本公开内容的特别的实施方案中，在因病理学而改变的脂肪量的情况下循环白色脂肪肽水平的矫正提供了显著的治疗益处。
参考文献
所有在说明书中提及的专利和出版物表明了本发明所属领域的技术人员的水平。所有专利和出版物通过提及而合并入本文，就如同具体地和单独地指明每一个单个的出版物通过提及而合并入本文一样。
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尽管已经详细描述了本发明及其优点，但是应当理解，可以在此处进行各种变化、替换和改变而不背离由所附权利要求书所定义的本发明的精神和范围。此外，并不意欲将本申请的范围限制于在说明书中所描述的过程、机器、制造、物质组成、手段、方法和步骤的特别的实施方案。如本领域普通技术人员将会容易地从本发明的公开内容中所意识到的，根据本发明，可以使用执行与本文中所描述的相应实施方案基本上相同的功能或取得与本文中所描述的相应实施方案基本上相同的结果的、目前存在或待以后发展的过程、机器、制造、物质组成、手段、方法或步骤。因此，所附的权利要求书意欲在其范围内包括这样的过程、机器、制造、物质组成、手段、方法或步骤。
本申请的一些实施方案如下：
1.重组的白色脂肪肽多肽或者其功能性衍生物或功能性片段。
2.实施方案1的多肽，其中所述白色脂肪肽多肽包含SEQ ID NO:1的序列。
3.实施方案1或2的多肽，其中所述多肽被包含在药学上可接受的载体中。
4.实施方案1-3中任一项的多肽，其中所述其功能性衍生物或片段相比于SEQ IDNO:1而言包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个或者更多个氨基酸改变。
5.实施方案1-4中任一项的多肽，其中所述其功能性衍生物或功能性片段包含SEQID NO:1的N-末端截短。
6.实施方案5的多肽，其中所述截短不多于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个氨基酸，或者其中所述截短为至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个氨基酸。
7.实施方案1-6中任一项的多肽，其中所述其功能性衍生物或功能性片段包含SEQID NO:1的C-末端截短。
8.实施方案7的多肽，其中所述截短不多于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个氨基酸，或者所述截短为至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个氨基酸。
9.实施方案1-8中任一项的多肽，其中所述其功能性衍生物或功能性片段包含在SEQ ID NO:1中的内部缺失。
10.实施方案9的多肽，其中所述内部缺失不多于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个氨基酸，或者所述内部缺失为至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个氨基酸。
11.实施方案1-11中任一项的多肽，其中所述白色脂肪肽的其功能性衍生物或片段可以包含与SEQ ID NO:1至少70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一的序列。
12.实施方案1-11中任一项的多肽，其中所述多肽是经标记的。
13.调节个体体重的方法，所述方法包括调节所述个体中天然的白色脂肪肽的水平的步骤。
14.实施方案13的方法，其中当所述个体的体重不足时，增加天然的白色脂肪肽的水平。
15.实施方案13的方法，其中当所述个体的体重过量时，降低天然的白色脂肪肽的水平。
16.实施方案13的方法，其中天然的白色脂肪肽的水平通过调节白色脂肪肽的转录来进行调节。
17.实施方案13的方法，其中天然的白色脂肪肽的水平通过调节白色脂肪肽的翻译来进行调节。
18.实施方案13的方法，其中天然的白色脂肪肽的水平通过调节白色脂肪肽从细胞中的分泌来进行调节。
19.实施方案13的方法，其中天然的白色脂肪肽的水平通过调节白色脂肪肽的稳定性来进行调节。
20.增加个体体重的方法，所述方法包括向所述个体提供有效量的实施方案1-12中任一项的多肽的步骤。
21.实施方案20的方法，其中所述个体的食欲水平得到增加。
22.降低个体体重的方法，所述方法包括向所述个体提供有效量的白色脂肪肽的抑制剂的步骤。
23.实施方案22的方法，其中所述抑制剂为抗体。
24.实施方案22的方法，其中所述抑制剂为小分子。
25.降低个体的血液中的葡萄糖水平的方法，所述方法包括向所述个体提供有效量的白色脂肪肽的抑制剂的步骤。
26.增加个体的血液中的葡萄糖水平的方法，所述方法包括向所述个体提供有效量的实施方案1-12中任一项的多肽的步骤。
27.包含实施方案1-12中任一项的多肽的试剂盒，所述多肽储藏在合适的容器中。
28.刺激个体食欲的方法，所述方法包括向所述个体提供有效量的实施方案1-12中任一项的多肽的步骤。
29.实施方案1-12中任一项的多肽的抑制剂。
序列表
<110> Chopra, Atul
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<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 140
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
Ser Thr Asn Glu Thr Asp Ala Ser Asn Ile Glu Asp Gln Ser Glu Thr
1 5 10 15
Glu Ala Asn Val Ser Leu Ala Ser Trp Asp Val Glu Lys Thr Ala Ile
20 25 30
Phe Ala Phe Asn Ile Ser His Val Ser Asn Lys Val Arg Ile Leu Glu
35 40 45
Leu Leu Pro Ala Leu Thr Thr Leu Thr Asn His Asn Arg Tyr Leu Ile
50 55 60
Glu Ser Gly Asn Glu Asp Gly Phe Phe Lys Ile Asn Gln Lys Glu Gly
65 70 75 80
Ile Ser Tyr Leu His Phe Thr Lys Lys Lys Pro Val Ala Gly Thr Tyr
85 90 95
Ser Leu Gln Ile Ser Ser Thr Pro Leu Tyr Lys Lys Lys Glu Leu Asn
100 105 110
Gln Leu Glu Asp Lys Tyr Asp Lys Asp Tyr Leu Ser Gly Glu Leu Gly
115 120 125
Asp Asn Leu Lys Met Lys Ile Gln Val Leu Leu His
130 135 140
<210> 2
<211> 147
<212> PRT
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 2
Met His His His His His His Ser Thr Asn Glu Thr Asp Ala Ser Asn
1 5 10 15
Ile Glu Asp Gln Ser Glu Thr Glu Ala Asn Val Ser Leu Ala Ser Trp
20 25 30
Asp Val Glu Lys Thr Ala Ile Phe Ala Phe Asn Ile Ser His Val Ser
35 40 45
Asn Lys Val Arg Ile Leu Glu Leu Leu Pro Ala Leu Thr Thr Leu Thr
50 55 60
Asn His Asn Arg Tyr Leu Ile Glu Ser Gly Asn Glu Asp Gly Phe Phe
65 70 75 80
Lys Ile Asn Gln Lys Glu Gly Ile Ser Tyr Leu His Phe Thr Lys Lys
85 90 95
Lys Pro Val Ala Gly Thr Tyr Ser Leu Gln Ile Ser Ser Thr Pro Leu
100 105 110
Tyr Lys Lys Lys Glu Leu Asn Gln Leu Glu Asp Lys Tyr Asp Lys Asp
115 120 125
Tyr Leu Ser Gly Glu Leu Gly Asp Asn Leu Lys Met Lys Ile Gln Val
130 135 140
Leu Leu His
145
<210> 3
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 3
Glu Thr Glu Ala Asn Val Ser Leu Ala Ser Trp Asp Val Glu Lys Thr
1 5 10 15
Ala Ile Phe Ala Phe Asn Ile Ser His
20 25
<210> 4
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 4
Lys Lys Lys Glu Leu Asn Gln Leu Glu Asp Lys Tyr Asp Lys Asp Tyr
1 5 10 15
Leu Ser Gly Glu Leu Gly Asp Asn Leu Lys Met Lys
20 25

Claims (10)

1.SEQ ID NO:1中所示的重组白色脂肪肽多肽或者其功能性衍生物或功能性片段在制备用于增加个体体重的药物组合物中的用途。
2.SEQ ID NO:1中所示的重组白色脂肪肽多肽或者其功能性衍生物或功能性片段在制备用于增加个体食欲的药物组合物中的用途。
3.SEQ ID NO:1中所示的重组白色脂肪肽多肽或者其功能性衍生物或功能性片段在制备用于增加个体的血液中的葡萄糖水平的药物组合物中的用途。
4.SEQ ID NO:1中所示的重组白色脂肪肽多肽或者其功能性衍生物或功能性片段在制备用于刺激个体食欲的药物组合物中的用途。
5.权利要求1-4中任一项的用途，其中所述功能性衍生物或功能性片段与SEQ ID NO:1中所示的重组白色脂肪肽多肽至少95％同一。
6.权利要求1-4中任一项的用途，其中所述重组白色脂肪肽多肽或者其功能性衍生物或功能性片段被包含在药学上可接受的载体中。
7.权利要求1-4中任一项的用途，其中所述功能性衍生物或功能性片段相比于SEQ IDNO:1中所示的重组白色脂肪肽多肽而言包含1至20个氨基酸改变。
8.权利要求1-4中任一项的用途，其中所述功能性衍生物或功能性片段包含SEQ IDNO:1的N-末端截短，所述截短不多于1至5个氨基酸。
9.权利要求1-4中任一项的用途，其中所述功能性衍生物或功能性片段包含SEQ IDNO:1的C-末端截短，所述截短不多于1至5个氨基酸。
10.权利要求1-4中任一项的用途，其中所述重组白色脂肪肽多肽或者其功能性衍生物或功能性片段是经标记的。
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