CN107261115B - Asprosin用于制备治疗缺血性心脏病药物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了Asprosin用于制备治疗缺血性心脏病药物的应用。发明人通过在体动物缺血再灌注模型证实，心肌缺血后，给予Asprosin蛋白，可以减少心肌细胞凋亡，减小梗死面积，改善小鼠心脏左室收缩功能，具有治疗心脏缺血性损伤的作用，有着很好的临床应用前景。

Description

Asprosin用于制备治疗缺血性心脏病药物的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及Asprosin用于制备治疗缺血性心脏病药物的应用。

背景技术

Asprosin是2016年首次报道的新型内源性小分子蛋白质(Romere,C.,etal.Asprosin,a Fasting-Induced Glucogenic Protein Hormone.Cell,2016.165(3):p.566-79.)。Asprosin是profibrillin的C端多肽片段。Profibrillin经过弗林蛋白酶(Furin)在靠近C末端切割，形成Fibrillin-1和Asprosin两种蛋白。即Asprosin实际是由FBN1基因的第65和66个外显子编码，第65个外显子编码11个氨基酸残基，第66个外显子编码129个氨基酸残基，共计140个氨基酸残基，实际分子量为约30kDa(可能具有糖基化等翻译后修饰)。主要是由白色脂肪组织分泌，其循环浓度在纳摩尔水平。在禁食时，可以靶向肝脏，通过激活G蛋白-cAMP-PKA信号通路来增加肝细胞中葡萄糖的释放。

缺血性心脏病是严重危害人类健康的心血管疾病之一，具有很高的发病率和致死率。缺血性心脏病的治疗核心在于恢复心肌的血液供应，即再灌注。但是，在心脏经历缺血再灌注后，会发生分子不良适应、细胞功能紊乱、基质重组、体积增大和心室壁畸形等一系列病理学转变，继而发生更加严重的心肌损伤，即缺血再灌注损伤，出现心肌舒缩功能降低、再灌注心律失常、心肌能量代谢障碍、超微结构变化及无血流等现象，易导致死亡。寻找治疗心肌缺血再灌注损伤的药物成为治疗缺血性心脏病亟待解决的手段之一。

发明内容

本发明解决的问题是提出Asprosin作为保护缺血心脏方面的应用，尤其是其在治疗心肌缺血再灌注损伤，减少心肌细胞的凋亡，改善心脏功能方面的应用。

发明人表达纯化得到Asprosin蛋白，建立小鼠心肌缺血再灌注模型，通过腹腔注射给予Asprosin蛋白。心脏伊文氏蓝/TTC染色证明，给予Asprosin可以明显减小缺血再灌注损伤导致的心肌梗死面积；TUNEL染色证明，给予Asprosin可以明显减少缺血再灌注损伤导致的心肌凋亡；小动物心脏超声证实，给予Asprosin可以明显改善缺血再灌注损伤导致的心脏功能下降。发明人发现，Asprosin蛋白具有抑制心肌缺血再灌注损伤，心肌保护作用。因此，Asprosin对于缺血心脏的保护作用可以用于抗心肌缺血损伤治疗药物的制备。

附图说明

图1为重组Asprosin的纯化与鉴定；A重组Asprosin大小及纯度鉴定；B采用Anti-His tag进行western blot鉴定重组蛋白。

图2为重组Asprosin对心肌细胞凋亡的影响；A TUNEL染色代表图，细胞核染色呈蓝色，凋亡染色呈绿色；B细胞凋亡比例；*P<0.05，与MI/R组相比。

图3为外源给予重组Asprosin能够减小心肌梗死面积；*P<0.05，与MI/R组相比。

图4为重组Asprosin对心脏左室功能的影响；A超声心动图代表图，B左室射血分数，*P<0.05与sham组相比,#P<0.05与MI/R组相比。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明做进一步的阐述。实施例是对本发明进行详细说明而不是限定。

实施例1:Asprosin的表达、纯化及鉴定

截取FBN1(GenBank Accession NM_000138)C末端141个氨基酸残基即为Asprosin。根据E.coli密码子偏好性进行密码子优化，避免产生HindIII和EcoRI两个限制性酶切位点，然后全基因合成(序列为：ATGTCTACCAACGAAACCGACGCTTCTAACATCGAAGACCAGTCTGAAACCGAAGCTAACGTTTCTCTGGCTTCTTGGGACGTTGAAAAAACCGCTATCTTCGCTTTCAACATCTCTCACGTTTCTAACAAAGTTCGTATCCTGGAACTGCTGCCGGCTCTGACCACCCTGACCAACCACAACCGTTACCTGATCGAATCTGGTAACGAAGACGGTTTCTTCAAAATCAACCAGAAAGAAGGTATCTCTTACCTGCACTTCACCAAAAAAAAACCGGTTGCTGGTACCTACTCTCTGCAGATCAGTTCTACCCCGCTGTACAAAAAAAAAGAACTGAACCAGCTGGAAGACAAATACGACAAAGACTACCTGTCTGGTGAACTGGGTGACAACCTGAAAATGAAAATCCAGGTTCTGCTGCACTAA)，得到423bp的Asprosin编码DNA片段。将DNA片段连接到表达载体pET-30a的EcoRI和HindIII之间，形成表达质粒pET30a-Asp，转化BL21(DE3)菌株以后，形成Asprosin表达菌株。

对转化了pET30a-Asp的BL21(DE3)菌株进行诱导表达，过夜培养后，按照1％进行转接至LB培养基，37℃，200rpm培养4-6小时至OD600 0.9。

加入诱导剂IPTG使得终浓度达到0.2mM，降低温度至16℃，诱导表达24小时。8000rpm离心，弃去上清，保留沉淀部分。菌体采用结合缓冲液(咪唑20mM，NaCl 500mM，磷酸盐20mM,pH 7.4)进行重新悬浮并加入终浓度为0.5mM的PMSF，置于冰浴超声破碎。破碎条件：工作3sec，停止5sec，功率300W，总共20min。12000rpm离心20min，弃去沉淀，保留上清进行纯化。

Asprosin纯化采用镍柱亲和纯化。采用结合缓冲液进行亲和吸附，清洗缓冲液(咪唑100mM，NaCl 500mM，磷酸盐20mM,pH 7.4)洗脱杂蛋白，洗脱缓冲液(咪唑500mM，NaCl500mM，磷酸盐20mM,pH 7.4)洗脱Asprosin蛋白。通过过夜透析，将缓冲液置换为PBS缓冲液。采用Pierce离心式内毒素去除柱按照说明书步骤，进行毒素去除。采用截留分子量为3KDa的Amico Ultra-15超滤管进行超滤浓缩，得到Asprosin蛋白。

SDS-PAGE后进行考马斯亮蓝染色，纯度鉴定显示，目的蛋白纯度大于95％(图1A)，采用标签特异性抗体Anti-His进行免疫印迹分析，显示只有唯一条带，且大小与考马斯亮蓝染色位置一致(图1B)，说明纯化得到的是Asprosin蛋白。最终，所得蛋白纯度大于95％，内毒素含量小于<0.1EU/μg蛋白，产量约400μg/L菌液，蛋白浓度0.3μg/mL。

实施例2：Asprosin对心肌细胞凋亡的影响

用6-0丝线在小鼠冠脉左前降支距根部2-3毫米处打一活结造成心肌缺血，30分钟后，将活结打开再灌注。再灌注4小时后取心肌组织进行凋亡相关检测。Sham组在相同位置穿过丝线，但不进行结扎；给药治疗组在结扎后，立即给予腹腔注射20μg前述纯化的Asprosin蛋白。

在麻醉状态下，将小鼠固定，剪开小鼠胸廓，暴露小鼠心脏，将左心耳剪破，夹住主动脉。从心肌灌入含有肝素的PBS，待左心耳流出的液体澄清透明后，再灌入4％多聚甲醛，心肌组织僵直变硬，剪下后浸没于4％多聚甲醛。固定24小时后，进行石蜡包埋和切片。保留切片的位置为结扎线结与心肌之间靠近线结1/4处。严格按照试剂盒说明书操作，经过切片脱蜡，TNUEL染色，DAPI复染及甘油封片后，置于激光共聚焦显微镜下观察荧光。随机挑取5个视野进行细胞凋亡检测。

如图2所示，进行MI/R手术后，小鼠心肌细胞出现凋亡，约有27％的心肌细胞出现凋亡，而外源给予重组Asprosin后，心肌细胞的凋亡比例下降显著，降低至18％。给予重组Asprosin后，心肌细胞凋亡与MI/R组相比差异显著，说明重组Asprosin可以抑制MI/R损伤，发挥心肌保护作用。

实施例3:给予重组Asprosin能够减小心肌梗死面积

如实施例2部分所述，建立小鼠心肌缺血再灌注模型。再灌注24小时以后，取心脏伊文氏蓝/TTC染色检测心梗面积。在体小鼠心肌局部IR过程完成后，将左冠状动脉原位重新结扎，通过主动脉根部注射伊文式蓝溶液，非缺血区心肌染成蓝色。取下整个心脏，磷酸缓冲液冲洗后置于-20℃冷却10min后，剪去心房，心室部分放入专门切片机，垂直于长轴横切成4-6块1-2mm厚的心肌片，心肌片置于1％氯化三苯基四氮唑(2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride,TTC)溶液中，37℃孵育15min，有活性的心肌组织被染成砖红色。非缺血区已由Evans氏液染成蓝色，缺血危险区(area at risk,AAR)内包括砖红色的存活心肌及未被染色的灰白梗死组织。即得出整个心脏的心肌梗死区(infarct size,IS)、缺血危险区(AAR)以及梗死区与缺血危险区之比(IS/AAR)。

结果显示，进行MI/R手术后，小鼠心肌产生损伤，梗死面积约占48％，而给予重组Asprosin之后，心肌梗死面积约32％，与MI/R组相比差异显著(图3)，说明重组Asprosin可以显著减小MI/R后心肌梗死面积，发挥心肌保护作用。

实施例4:重组Asprosin对心脏左室功能的影响

如实施例2部分所述，建立小鼠心肌缺血再灌注模型。再灌注24小时以后，将小鼠放入小动物气体麻醉机，给予含有2％异氟烷的氧气进行吸入麻醉，使用脱毛膏进行胸前区脱毛。脱毛后，采用Vevo高分辨率小动物超声影像系统检测小鼠心脏功能。使用仪器自带软件通过测量收缩及舒张期时，心肌厚度计算小鼠心脏左室射血分数LVEF％。

结果显示，单纯缺血再灌注组(MI/R)心功能明显下降(图4A)，在外源给予纯化的重组Asprosin后，与MI/R组相比有心功能有明显的改善(图4A)，左室射血分数LVEF％明显上升(图4B)，说明重组Asprosin具有抑制心功能损伤，改善心功能的作用。

核苷酸序列表电子文件

<110>中国人民解放军第四军医大学

<120>Asprosin用于制备治疗缺血性心脏病药物的应用

<141>

<160>

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>全基因合成序列

<220>

<223>

<400>1

ATG TCTACCAACGAAACCGACGCTTCTAACATCGAAGACCAGTCTGAAACCGAAGCTAACGTTTCTCTGGCTTCTTGGGACGTTGAAAAAACCGCTATCTTCGCTTTCAACATCTCTCACGTTTCTAACAAAGTTCGTATCCTGGAACTGCTGCCGGCTCTGACCACCCTGACCAACCACAACCGTTACCTGATCGAATCTGGTAACGAAGACGGTTTCTTCAAAATCAACCAGAAAGAAGGTATCTCTTACCTGCACTTCACCAAAAAAAAACCGGTTGCTGGTACCTACTCTCTGCAGATCAGTTCTACCCCGCTGTACAAAAAAAAAGAACTGAACCAGCTGGAAGACAAATACGACAAAGACTACCTGTCTGGTGAACTGGGTGACAACCTGAAAATGAAAATCCAGGTTCTGCTGCACTAA

Claims (3)

1.Asprosin用于制备治疗缺血性心脏病药物的应用，所述Asprosin序列为SEQ ID NO:1所示序列。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的缺血性心脏病药物为抗心肌缺血再灌注损伤药物。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的缺血性心脏病药物为注射给药制剂。

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