CN111904963A - 2,3-双羟基甘草次酸用于制备治疗病毒性乙肝药物的用途 - Google Patents

2,3-双羟基甘草次酸用于制备治疗病毒性乙肝药物的用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及2,3‑双羟基甘草次酸用于制备治疗病毒性乙肝药物的用途。具体而言，本发明提供了式(1)化合物，即2β,3α‑二羟基‑11‑羰基齐墩果烷‑12‑烯‑30‑羧酸，在制备防治乙型肝炎病毒感染疾病的药物中的应用。式(1)化合物在66.75微克/毫升浓度下其抑制HBeAg分泌的强度为100微克/毫升的拉米呋啶的1.79倍；该浓度下其对HBV‑DNA复制显示出95.3％的抑制率，高于100微克/毫升的阳性对照拉米呋啶对HBV‑DNA复制的抑制活性。以上表明该2,3‑双羟基甘草次酸可预期用于制备治疗乙型肝炎病毒感染疾病之非核苷类药物的用途，具体而言，该化合物具有用于制备HBV‑DNA、HBeAg抑制剂的用途，且其制备方法步骤简单、成本低，且原料来源广泛，容易进行产业化生产。

Description

2,3-双羟基甘草次酸用于制备治疗病毒性乙肝药物的用途
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体而言，本发明涉及一种甘草次酸衍生物即2β,3α-二羟基-11-羰基齐墩果烷-12-烯-30-羧酸用于制备治疗乙型肝炎病毒感染疾病药物的用途。该化合物为一五环三萜酸类衍生物，具有显著的抑制HepG2.2.15细胞分泌HBeAg的活性、并可显著抑制HepG2.2.15细胞中HBV-DNA的复制，可预期用于制备清除HBeAg、抑制HBV-DNA复制，治疗乙型肝炎病毒感染疾病之非核苷类创新型药物的用途。
背景技术
乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV，乙肝病毒)引起的传染病，故又称为病毒性乙肝。HBV是嗜肝DNA病毒科hepadnaviridae的一员，为部分环状DNA病毒，其形状为直径42纳米的球形颗粒，广泛存在于肝脏、胰腺、淋巴细胞等组织中，并且不断复制。HBV是奇特的病毒，在其它动物中较少有传染性，唯有在人体或者灵长类动物黑猩猩体内才能得以复制。该病毒通过乙肝病毒携带者和乙肝病人的血液、唾液、精液、阴道分泌物进行传播，具有慢性携带状态。本病在我国广泛流行，因其分为垂直传播、水平传播、家庭内传播、医源性传播和性传播等多种方式，对人群感染率高，在某些地区感染率达到35％以上。据有关资料，肝炎检测阳性的患者已经达到1.89亿，而应就诊未就诊人数(携带者)将近4亿。是当前危害人民健康最严重的传染病之一。乙肝临床表现多样化，易发展为慢性肝炎和肝硬化，少数病人可转变为原发性肝癌。血液中的乙肝病毒比较容易清除，但是组织细胞中的乙肝病毒很难清除。
乙肝e抗原HBeAg是乙肝病毒HBV内核的结构蛋白，在HBV繁殖时大量产生。乙肝病毒具有所有已知DNA病毒中最小的基因组(仅3.2kb)，其基因主要编码为五种蛋白(S、C、E、P、X)。C蛋白为病毒核心蛋白，而E蛋白是C蛋白的一部分，成为乙肝e抗原(HBeAg)，其是已经编码好但未组装到病毒颗粒中的蛋白、在病毒复制时会分泌到患者血液中去。临床上，通常将血清HBeAg作为HBV复制、传染性、病情严重程度以及对其治疗应答进行评价的重要标志物。该抗原与HBV-DNA密切相关，是临床上表达病毒复制非常实用的血清标志物。血清HBeAg阳性患者说明其体内有HBV复制，故而有较高的传染性；患者HBeAg表达越高说明该患者传染性越强。同理，抑制HBeAg的分泌和复制也是研发抗HBV药物中的一个重要靶标和检测标的。HBeAg清除说明体内有着持续的HBV抑制、ALT正常、组织炎症坏死减轻、肝硬化发生的几率降低。因此，血清HBeAg被认为能够反映更为稳定的治疗效果，HBeAg血清清除标志着患者免疫系统开始发挥作用。2002年，在《新英格兰医学杂志》发表的研究结果认为：对于CHB患者，如在肝硬化前获HBeAg清除，则其肝硬化和肝细胞癌发生率将降低10倍。美国肝病研究协会AASLD、亚太肝脏研究协会APASL和欧洲肝脏研究协会EASL的指南中均将HBeAg血清清除作为治疗终点判定标准之一。所以，能够抑制、降低HBeAg的表达或活性的药物即属于能有效治疗HBV感染疾病的药物。
近几年随着肝病的研究，发展了标准化的HBV-DNA的分析，大大推进了对乙肝患者病情的了解。HBV-DNA的定量分析能预测乙肝的严重性及其预后，因为HBV-DNA持续阳性(即持续病毒血症)容易使乙肝病情进展和加重；高乙肝病毒(HBV-DNA)含量容易促进肝硬化的形成；HBV-DNA持续存在是肝细胞癌(HCC)发生的高危因素。特别是病毒含量较高、病程较长、年龄较大或合并其它肝病者，体内持续高浓度的HBV-DNA，可导致其代偿性肝硬化及原发性肝重症的死亡率明显增加。同时必须认识到，HBV-DNA水平与肝脏组织学的关系极其密切：文献报道经抗病毒治疗，肝脏纤维化的改善、消除明显；近期国际肝病会议报导，强效和低耐药性的抗病毒治疗，随着HBV-DNA的降低和转阴，可观察到肝硬化出现不同程度的逆转。因此，现在主张肝硬化也应进行抗病毒治疗。
因此，HBV-DNA指标在抗病毒治疗中的应用也起着举足轻重的作用：HBV-DNA的水平是决定慢性乙型肝炎是否需要抗病毒治疗的重要指标；在抗病毒治疗中，根据HBV-DNA的治疗反应，判断是否病毒学早期应答进而决定长期用药的策略以取得持续性的病毒学应答，达到持续病毒抑制的目的；根据HBV-DNA持续抑制情况争取病毒持续阴性，以争取达到抗病毒最终治疗目标；根据HBV-DNA持续完全受到抑制，也显示出了cccDNA的不同程度好转和消失；在抗病毒治疗中，以HBV-DNA的变化来评估和预防抗病毒药物所引起的病毒变异及耐药发生的风险；一旦发生病毒变异或耐药时，HBV-DNA的变化是唯一的最先的信号和诊断依据，也是治疗耐药和改变治疗策略的指导和依据。因此，对HBV-DNA的抑制程度在乙肝的进一步诊断和治疗上有着新的重大意义，对疗效的观察、对评估乙肝预后及耐药危险性均有较大的指导作用。所以，亚太肝脏研究学会和欧洲肝脏研究学会均将HBV-DNA检测不到作为乙型肝炎病毒患者治疗终点之一。我国新药开发指南中也将受测化合物对于HBV-DNA的抑制强度视为评价治疗乙肝药物药效的重要指标。
目前，对乙肝患者的用药主要分为保肝降酶、抗病毒、抗肝纤维化和调节免疫等数个大类。抗病毒是根本方法，而保肝降酶只是辅助治疗，多治标而鲜见治本。虽然近些年来抗病毒药物治疗乙肝方面取得了一些进展；然而，目前对于病毒性乙肝临床上的治疗方案只能达到血清中抑制HBV复制和继发感染，最主要药物仍是核苷类药物如拉米呋啶(3-TC)、恩替卡韦、阿德福韦(ADV)、替比夫定等，还有处于临床试验期中的emtricitabine、tenofovir、clevuding等。核苷类药物部分优点为：生物利用度高，口服较安全。然而，它们虽然能暂时性地控制病情，但一则售价昂贵；二则长期使用均可出现耐药性，以及停药后出现HBV-DNA、ALT及肝组织学等指标不同程度的反弹；三是长期使用核苷类药物出现的较为明显的众所周知的不良作用，例如肾脏损伤、婴儿致畸等。最为头痛的是：病毒耐药的出现大大降低了治愈率，因为核苷类药物对病毒复制是可逆的，所以对大部分患者若欲达到最大疗效，疗程必须在一年以上，如此其耐药性随之出现，就达不到预期之效果。且核苷类药物还有难以清除cccDNA、治疗一年后HBsAg难以阴转等不足之处。
干扰素(α、β-干扰素)以及重组干扰素类等来源于人白细胞的生物工程类抗病毒药物近期成为研究和治疗CHB热点药物，其具有抗病毒和免疫调节双重作用。其既可通过抗病毒作用抑制病毒复制从而减轻肝脏细胞炎症反应，减少肝细胞损害，延缓病情发展，改善病人临床症状和肝脏生理功能；又可以增强免疫作用，通过加强体内自然杀伤细胞和辅助性T细胞的作用，尤其是可以促进杀伤T细胞去杀伤被病毒感染细胞，因此间接起到抗病毒作用。因此，干扰素日渐成为临床上用于治疗慢性乙肝病毒的首选药物，但其副作用和不良反应报道较多；只要乙肝病毒脱氧核糖核酸(HBV-DNA)为阳性，很可能其体内乙肝病毒已发生变异，病毒复制活跃、有传染性、已变异的病毒对抗病毒药物不敏感，复发率高，因此干扰素治疗乙肝的总有效率不高，且引起价格昂贵、患者经济负担大，因而造成临床上难以广泛使用。且对失代偿肝硬化患者不适宜应用。为克服上述α-干扰素的副作用和不良反应等制约其临床应用的缺陷，本发明也将其作为阳性对照药物进行对照试验。
必须说明的是：目前使用的抗病毒药物其实只是病毒复制的抑制剂，并不能直接杀灭病毒和破坏病毒体，否则就会损伤宿主细胞。这些抗病毒药物(多为核苷类药物)还存在上述毒副作用大、易引起病毒基因突变、停药后易反跳等缺点，因此开发新型抗病毒药物是当今药物研发领域的当务之急。其对于治疗我国大量的乙肝患者和病毒携带者、控制传染源等都有着极其重要的社会意义和经济意义。所以，从民族民间长期使用的天然药物中发现新的非核苷类乙肝病毒抑制剂及此类能够抑制HBV-DNA复制的先导化合物有着很大的指导性意义，并有着辽阔的发展前景。
基于此目的，发明人以前曾完成多项抗乙肝病毒天然产物及其结构改造衍生物的技术和产品研发，发现了多种清除HBeAg、抑制HBV-DNA复制的化合物，从而说明从天然产物及其合成衍生物中筛选出能够防治乙肝病毒感染的创新性药物是可行的。[参见：“一类对映桉烷醇类倍半萜抑制乙肝病毒的医药用途”(赵昱、刘光明、于荣敏、李海波等；ZL200610053827.4)；“2β-羟基冬青酸抑制乙肝病毒的医药用途”(李校堃、赵昱、黄可新、李海波等；ZL 200610053749.8)；“2α,3β-二羟基–5,11(13)–二烯桉烷–12–酸抑制乙肝病毒的医药用途”(赵昱、张礼和、孙汉董、李海波等；ZL 200610053601.4)；“艾里莫芬烷内酯抑制乙肝病毒的用途及其药物组合物”(赵昱、李海波、杨雷香、周长新等；ZL03153691.3)；“一种艾里莫芬内酯酸天然产物及其应用”(赵昱、周长新、施树云、王晓雨等；ZL200610053575.5)；“一种桉烷型倍半萜酸及其用途”(赵昱、刘光明、李海波、巫秀美等；ZL200610053579.3)；“六棱菊属植物提取物在制备抑制单纯疱疹病毒及乙肝病毒的药物组合物中的用途”(赵昱、周长新、于荣敏、白骅；ZL 200510132508.8)；“1β–氧代–5,11(13)–二烯桉烷–12–酸抑制乙肝病毒的医药用途”(赵昱、李校堃、黄可新、李海波等；ZL200610053610.3)；“1β-羟基冬青酸抑制乙肝病毒的医药用途”(赵昱、李校堃、黄可新、巫秀美等；ZL 200610053625.X)；“1-氧-取代苯甲酰奎尼酸化合物及其抑制乙肝病毒用途”(李校堃、胡利红、巫秀美、赵昱等；ZL 200810062451.2)；近期，本发明人团队从天然产物为起始模板合成的衍生物中发明了新型抗HBV活性化合物及其在制备抗HBV药物中的应用：含溴二氢黄酮醇木脂素(ZL 201010181451.1)，A环偶合黄酮木脂素(ZL 201010181892.1)，含苄氧基黄酮木脂素(ZL 201010181644.7)，B/E双甲氧基水飞蓟宾(ZL 201010181499.2)，槲皮素二聚体黄酮(ZL 201010181869.2)，一种苯骈苯丙素(ZL 201010181533.6)，B环乙氧基二氢黄酮醇(ZL 201010181512.4)，取代异水飞蓟宾(ZL 201010181679.0)，A环取代水飞蓟宾酯(ZL 201010181721.9)，E环溴取代水飞蓟宾(ZL 201010181632.4)，E环去甲氧水飞蓟宾(ZL 201010181731.2)，乙酰胺脱氢水飞蓟宾(ZL 201010181523.2)，一种角型黄酮木脂素(ZL 201010181503.5)，双烯丙基黄酮木脂素(ZL 201010181908.9)，双甲基脱氢水飞蓟宾(ZL 201010181775.5)，双胺甲酰脱氢水飞蓟宾(ZL 201010181504.X)，黄酮木脂素(±)Scutella prostin A(ZL 201010181362.7)，芳氨甲酰脱氢水飞蓟宾(ZL201010181414.0)，E环碘取代水飞蓟宾(ZL 201010181661.0)，B环乙氧基水飞蓟宾(ZL201010181500.1)，A环二氧六环黄酮木脂素(ZL 201010181411.7)，脱氢水飞蓟宾双醚(ZL201010117317.5)，一类脱氢水飞蓟宾三烷基醚(ZL200910099405.4)，异戊烯基氧基取代的脱氢水飞蓟宾醚(ZL 200910099404.X)，7及20位脱氢水飞蓟宾双烷醚(ZL200910099403.5)，A环上取代的水飞蓟宾醚(ZL200910099042.4)，双烯丙基取代的水飞蓟宾醚(ZL 200910099041.X)。毋庸置疑，继续从天然产物及其结构改造衍生物中寻找能够有效防治HBV的先导化合物是非常有必要和紧迫的，也因此被国家科技部列为新药研制重大专项之一。
中药甘草是豆科甘草属植物，《神农本草经》将此草药列为上品。唐代《药性本草》中载：诸药中甘草为君，治七十二种乳石毒，解一千二百般草木毒，调和众药有功，故有国老之称。杏林中向来有“无草不成方”之说，其主要功效在于清热解毒、调和药性等。TCM120中记载的方剂数据库中，所载处方中甘草使用频率列为第一。甘草的块根和根茎中含大量甘草酸，也称甘草甜素。2003年，德国法兰克福大学医院科学家发现甘草酸能够抑制Vero细胞中的SARS相关病毒也即SARS病毒临床分离株FFM-1和FFM-2的复制(Jindrich Cinatl Jret al,Lancet,2003,361:2045-2046)，更赋予该天然产物更多的研究空间。甘草酸除能抑制病毒复制，还可以抑制病毒的吸附与穿透功能。在病毒吸附期及吸附期后加入甘草酸效果更明显。因此，甘草酸是一个潜在的对抗高危病毒的有效先导化合物。基于此，不断有科学家研究其衍生物筛选更高效的抗病毒制剂，并发现其硫酸酯抗HIV的作用是甘草酸的4倍，极有希望开发成高效的抗病毒制剂或者免疫增强剂。
我国科学家发现：甘草酸还具有保肝的功效，能延缓和降低血清转氨酶的升高[田庆来，等，甘草有效成分的药理作用研究进展，天然产物研究与开发，2006,(18)：343-347]；针对136例慢性乙型肝炎(CHB)患者的临床试验也发现异甘草酸镁注射液能显著改善患者临床症状、体征及肝功能生化指标[徐庆杰等，异甘草酸镁治疗慢性乙型肝炎的临床研究，临床医学，2011，31(7)：74-75]；因此，近年来我国甘草酸制剂已经用于CHB的辅助治疗，虽未能根治病毒性乙肝，但在改善CHB症状等方面取得一定效果。
甘草酸是甘草次酸的二葡萄糖醛酸苷，甘草次酸在临床上当做肾上腺皮质激素及促肾上腺皮质激素药来使用，可以代替去氧皮质酮用于对阿狄森氏病的治疗。虽然甘草次酸具有抗炎、增强非特异性细胞免疫功能、氧自由基清除等多种生理功能，但还没有直接应用于抗HBV感染。18β-甘草次酸衍生物治疗DNA类病毒感染尤其是其用于抗乙肝病毒方面的新用途尚未得到有效开发，故此从甘草次酸类五环三萜衍生物中寻找抗乙肝病毒领域的活性化合物、也即将此类结构改造使其具有抗DNA类病毒活性是一个崭新的领域。从其中发现能清除HBeAg、抑制HBV-DNA复制的先导化合物更是极具希望的挑战。为了探索这个领域，我们将其选做起始物，对其结构进行合理改造，通过以计算机辅助设计为手段，设计了包括式(1)所示结构在内的一系列的18β-甘草次酸衍生物，我们的目的之一是：希望发现能抑制HBeAg分泌、抑制HBV-DNA复制的18β-甘草次酸衍生物类先导化合物，从而将其进一步开发成具有能清除HBeAg、抑制HBV-DNA复制、治疗CHB的创新性药物。
为此，我们设计并制备了含有2,3位双羟基的18β-甘草次酸衍生物，利用合成技术将甘草次酸3位β羟基实施构型翻转化，使其β构型羟基反转成α构型，从而改变整体五环三萜酸构型及亲脂亲水性，并增强该五环三萜酸A环上氧密度，以期发现超乎寻常的清除HBeAg、抑制HBV-DNA复制的活性乃至先导化合物。
发明内容
本发明的目的是提供了式(1)所示的五环三萜酸类甘草次酸衍生物用于制备清除HBeAg、抑制HBV-DNA复制暨治疗乙型肝炎病毒感染疾病药物的新用途。
Figure BDA0002601781880000061
式(1)化合物的名称为：2β,3α-二羟基-11-羰基齐墩果烷-12-烯-30-羧酸，即2,3-双羟基甘草次酸，其IUPAC名为：(2S,4aS,6aS,6bR,8aR,10S,12aS,12bR,14bR)-methyl-10-acetoxy-2,4a,6a,6b,9,9,12a-heptamethyl-13-oxo-1,2,3,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,12,12a,12b,13,14b-icos ahydropicene-2-carboxylate。
本发明还提供了一种制备式(1)所示化合物的方法，其特征是：将市售的甘草次酸3位羟基甲磺酰化，进一步反应脱去甲磺酸后在A环上形成双键。用m-CPBA将A环上新形成的双键环氧化，选用在浓硫酸作用下开环，便可形成式(1)所示之双羟基化合物。
本发明的另一个目的是提供了一种用于制备清除HBeAg、抑制HBV-DNA复制、治疗乙型病毒性肝炎药物用途的组合物，其特征为含有治疗有效量的作为活性成分的由式(1)化合物组成的混合物。其药物剂型可以是片剂、胶囊剂、注射剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、贴片剂、皮下植埋剂、外用搽剂、口服液或软膏剂，还可以采用现代制药界所公知的控释或缓释剂型或纳米制剂。
发明人设计的式(1)化合物2β,3α-二羟基-11-羰基齐墩果烷-12-烯-30-羧酸与天然甘草次酸相比较，具有结构和物化性质上差异化的特征，包括其疏水性、芳香性、吉布斯自由能、氢键受体、电性、分子间范德华力，以及3D构象、伸展方向、分子重心、共轭程度、电性分布中心等特质均与甘草次酸有一定差异；且式(1)化合物分子量比甘草次酸增大了16个质量单位。上述特征都决定了式(1)所示化合物之三维构象与HBeAg乃至HBV-DNA之3D空间结构相结合之配体-受体结合复合物形态和结合方式都可能产生差别，其结合位点和结合模式、其结合自由能等均会产生较大的改变，因而可能在抑制HBeAg分泌、HBV-DNA复制方面有着意想不到的效果。
HepG2.2.15细胞是对人肝癌细胞系HepG2细胞转染HBV基因衍生而得，该细胞系可以稳定的进行HBV基因组的复制，细胞上清也可以测得到HBV-DNA。我们测试了式(1)化合物对HepG2.2.15细胞分泌HBeAg的抑制作用，及其对HepG2.2.15细胞中HBV-DNA复制的抑制活性，以期最终获取能够有效清除HBeAg、抑制HBV-DNA复制之自主知识产权的化学实体。试验结果发现：该双羟基五环三萜酸具有显著的抑制HepG2.2.15细胞分泌的HBeAg之活性，在共培养第8天时，该化合物于66.75微克/毫升浓度下抑制HBeAg分泌的强度是阳性对照药物拉米呋啶(100微克/毫升)的1.79倍；该浓度(66.75微克/毫升)时式(1)化合物对HBV-DNA复制显示出95.3％的抑制率，高于100微克/毫升的拉米呋啶。以上说明式(1)化合物有着意想不到的抗HBV效果，从而可以预期其作为清除HBeAg、抑制HBV-DNA复制、治疗乙型病毒性肝炎之活性先导化合物继续开发。并可预期进一步优化发展为清除乙肝HBeAg抗原、抑制HBV-DNA复制的创新类非核苷类创新药物。
综上所述，我们从甘草次酸衍生而成的2β,3α-二羟基-11-羰基齐墩果烷-12-烯-30-羧酸既有结构上的独特性，又具有抗HBV作用的新颖性，并在抗乙肝病毒活性测试中既发现了不寻常的抑制HBeAg活性以及抑制HBV-DNA复制的活性；有望成为治疗慢性乙肝(CHB)之非核苷类药物之活性先导化合物。经本发明人详细的文献查阅，到目前为止，尚无有关该化合物治疗乙肝病毒感染性疾病和制备抗乙肝病毒药物的报道。五环三萜酸类式(1)化合物对于HBeAg和HBV-DNA的强效抑制属于意想不到的发现，有着确切的原创性，据此完成本发明。
本发明有益之处在于：首次发现式(1)所示之化合物2β,3α-二羟基-11-羰基齐墩果烷-12-烯-30-羧酸具有清除HBeAg、抑制HBV-DNA复制，并在防治乙肝病毒方面的成药潜力，为开发成为治疗乙肝病毒创新药物、开发抑制HBeAg分泌、HBV-DNA复制之非核苷类创新药物提供了新的物质基础。具有潜在巨大的社会效益和经济效益。本发明再一特点为：式(1)化合物制备方法简单易行，原料来源方便易得，成本低，污染小，利于节能减排条件下的大规模生产。产业化前景十分明确。
具体实施方案
本发明人通过化学合成，并通过多种层析手段纯化得到该既能强效抑制HBeAg分泌，又能有效抑制HBV-DNA复制活性的一个甘草次酸衍生而成的式(1)所示五环三萜酸，又经质谱和核磁共振波谱等综合解析推导验证了其化学结构。本发明人发现，式(1)化合物对HepG2.2.15细胞分泌的HBeAg以及HBV-DNA的复制具有显著的抑制作用，提示该化合物具有用药安全、强效清除HBeAg、高效抑制HBV-DNA复制的特点。因此，根据本发明人的研究，发明人所设计并合成的式(1)所示之2β,3α-二羟基-11-羰基齐墩果烷-12-烯-30-羧酸可以用于制备治疗乙肝病毒感染性疾病的非核苷类药物。
为了更好地理解本发明的实质，下面分别用式(1)化合物的制备及其对HepG2.2.15细胞分泌的HBeAg、HBV-DNA复制之抑制作用试验的结果，说明其在制药领域中的新用途。实施例给出了式(1)化合物的部分合成、结构鉴定、和活性数据。若无特别说明，本发明的百分比指的是重量百分比。必须说明，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
实施例1：式(1)化合物2β,3α-二羟基-11-羰基齐墩果烷-12-烯-30-羧酸的制备1.1仪器与试剂
紫外光谱用Shimadzu UV-240紫外分光光度计测定；核磁共振氢谱1H-NMR由INOVA型超导核磁共振波谱仪(VARIAN INOVA-400MHz)测定(四甲基硅醚TMS为内标)；电喷雾质谱ESI-MS由Bruker Esquire 3000+质谱仪测定；柱层析用硅胶(100～200，200～300和300～400目)以及薄层层析用硅胶GF254(10～40目)均由青岛海洋化工厂生产；所用试剂均为分析纯，其中石油醚沸程为60～90℃；高效液相检测(HPLC)使用安捷伦1100仪；薄层制备层析(PTLC)用Merck公司的铝箔硅胶板；柱色谱用葡聚糖凝胶Sephadex LH-20采用瑞典Amersham Pharmacia Biotech AB公司产品；薄板(TLC)检测用254nm和365nm的紫外灯；显色剂用碘蒸气、10％硫酸-乙醇以及磷钼酸溶液。
Figure BDA0002601781880000081
其中，glycyrrhetic acid是指甘草次酸，MsCl是甲基磺酰氯。
1.2中间体化合物3β-甲基磺酰基-11-羰基齐墩果烷-12-烯-30-酸(2)的制备
在干燥的反应瓶中加入4.70克甘草次酸(购自西安晨艺生物科技有限公司，HPLC检测纯度99％)，以100毫升二氯甲烷和60毫升三乙胺混合溶液溶解。在通风橱内冰浴条件下，磁子搅拌，向此混合溶液滴加甲基磺酰氯15毫升，过程中控制温度不高于4℃，滴加完毕后继续反应3小时。过滤，滤液以1摩尔/升盐酸溶液洗涤至微酸性，再水洗至中性。无水硫酸镁干燥24小时，过滤，减压蒸除溶剂，硅胶柱层析，以石油醚-醋酸乙酯(100﹕1～1﹕1)洗脱，TLC薄层检测，收集纯品，得到式(2)所示之中间体化合物3β-甲基磺酰基-11-羰基齐墩果烷-12-烯-30-酸3.60克，熔点155～156.5℃(二氯甲烷)，Rf(石油醚﹕氯仿﹕甲醇＝4﹕4﹕0.6)＝0.33；收率65.7％。核磁共振氢谱1H NMR(400MHz，氘代氯仿)δ：0.85(单峰,3H)，0.89(单峰,3H)，1.05(单峰,3H)，1.15(单峰,3H)，1.21(单峰,3H)，1.31(单峰,3H)，1.36(单峰,3H)，2.33(单峰,1H,H-9)，2.85(1H,宽双峰,J＝3.6Hz,H-1)，3.03(单峰,3H,CH3 SO2-)，4.38(1H,双双峰,J＝11.6,4.0Hz,H-3)，5.71(单峰,1H,H-12)；电喷雾质谱ESI-MS：m/z 549[M+H]+。
1.3式(3)化合物2,3-烯-18β-甘草次酸的制备
将1.09克式(2)所示之3β-甲基磺酰基-18β-甘草次酸溶于40毫升N,N-二甲基甲酰胺中，搅拌下加入0.48克碳酸锂，加热回流半小时。TLC检验反应完全后，过滤，滤液加入30毫升水和30毫升乙醚。分层后再以乙醚30毫升萃取两次。合并有机相，以1摩尔/升盐酸溶液洗涤至微酸性，再以蒸馏水洗至中性。无水硫酸钠干燥24小时，过滤，减压蒸除溶剂，以50克硅胶柱层析纯化产物，以二氯甲烷﹕醋酸乙酯(10﹕1～2﹕1)梯度洗脱，TLC检验合并，最终减压蒸除溶剂得到2,3-烯-18β-甘草次酸(即，11-羰基齐墩果烷-2,12-二烯-30-酸)490毫克。Rf(石油醚﹕氯仿﹕甲醇＝4﹕4﹕0.6)＝0.61；熔点：252～253℃(二氯甲烷)；[α]25 D+102.1°(c0.20,CH2Cl2)；1H NMR(400MHz，氘代氯仿)δ：0.86(单峰,3H)，0.92(单峰,3H)，0.97(单峰,3H)，1.16(单峰,3H)，1.17(单峰,3H)，1.23(单峰,3H)，1.38(单峰,6H)，2.43(单峰,1H,H-9),3.05(双双峰,1H,H-1,J＝17.0，6.0Hz)，5.42(2H,多重峰,H-2,H-3)，5.79(单峰,1H,H-12)；电喷雾质谱ESI-MS：m/z 453[M+H]+。
1.4式(4)化合物2,3-环氧-18β-甘草次酸的制备
取1.3项下制备得到的式(3)化合物2,3-烯-18β-甘草次酸452毫克溶于15毫升二氯甲烷，搅拌下加入间氯过氧苯甲酸550毫克，室温下搅拌反应12小时。反应完全后，加入10毫升蒸馏水，分层后，以二氯甲烷萃取水层两次，每次10毫升。合并有机相，以饱和碳酸氢钠溶液洗涤至微碱性，再水洗至中性。无水硫酸镁干燥，减压蒸除溶剂，以40克硅胶反复柱层析纯化产物，以石油醚﹕醋酸乙酯(10﹕1～2﹕1)梯度洗脱，TLC检验合并目标产物式(4)化合物，最终减压蒸除溶剂得到式(4)化合物2,3-环氧-18β-甘草次酸(即，2α,3α-环氧-11-羰基齐墩果烷-12-烯-30-酸)284毫克。Rf(石油醚﹕醋酸乙酯＝2﹕1,+1％甲酸)＝0.56；熔点214～215℃(二氯甲烷)；[α]25 D-75.0°(c 0.20,CHCl3)；核磁共振氢谱1H NMR(400MHz，氘代氯)δ：0.84(单峰,3H)，1.04(单峰,3H)，1.10(单峰,3H)，1.12(单峰,3H)，1.16(单峰,3H)，1.23(单峰,3H)，1.33(单峰,3H)，2.86(1H,双峰,J＝3.6Hz,H-3)，3.20(2H,多重峰,H-1&H-2)，5.71(单峰,1H,H-12)；电喷雾质谱ESI-MS：m/z 469[M+H]+。
1.5式(1)化合物2β,3α-二羟基-11-羰基齐墩果烷-12-烯-30-羧酸的制备
取1.4项下制备得到的式(4)化合物2α,3α-环氧-11-羰基齐墩果烷-12-烯-30-酸234毫克溶于15毫升干燥四氢呋喃中，搅拌下逐滴加入浓硫酸1毫升及1毫升的双蒸水，反应液搅拌条件下回流反应1小时。TLC检验反应进度。反应完全后，先减压脱去大部分有机溶剂，再向残液中加入10毫升双蒸水，分层后，水层以醋酸乙酯萃取三次，每次10毫升；合并有机相，饱和碳酸氢钠溶液洗涤至微碱性，再以蒸馏水洗至中性。无水硫酸镁干燥，过滤，滤液减压蒸除溶剂，以20克硅胶反复柱层析纯化产物，以石油醚﹕醋酸乙酯(10﹕1～2﹕1)梯度洗脱，TLC检验合并式(1)化合物，最终减压蒸除溶剂得到2β,3α-二羟基-11-羰基齐墩果烷-12-烯-30-羧酸23.5毫克。Rf(石油醚﹕醋酸乙酯＝2﹕1,+1％甲酸)＝0.20；白色无定形固体，熔点172～173℃(二氯甲烷)；[α]25 D-145.0°(c 0.04,CH2Cl2)；核磁共振氢谱1H NMR(400MHz，氘代氯仿)δ：0.84(单峰,3H)，0.94(单峰,3H)，1.05(单峰,3H)，1.10(单峰,3H)，1.21(单峰,3H)，1.26(单峰,3H)，1.31(单峰,3H)，2.52(单峰,1H,H-9)，3.69(多重峰,2H,H-3&H-2)，5.75(单峰,1H,H-12)；核磁共振碳谱13C NMR(100MHz，氘代氯仿)δ：19.0(t),18.9(q),19.5(q),22.1(q),23.2(q),23.4(q),23.7(q),26.2(q),26.4(t),26.8(t),30.7(t),32.1(C-7),32.2(s),35.0(s),35.8(t),38.5(s),41.1(t),44.5(s),43.5(s),43.6(s),46.2(t),48.3(d),52.5(d),62.1(d),68.3(d),81.1(d),128.4(d),170.5(s),182.9(s),200.7(s)。电喷雾质谱ESI-MS：m/z 487[M+H]+。根据核磁共振碳谱与氢谱的HMBC结果对碳谱进行一一归属；根据NOESY分析结果：H-2与H-5之间有NOE效应，从而确认H-2与H-5同侧，均为α构型，而H-3与H-2之间无NOE效应，根据该化合物的立体构型特征，确认了H-2和H-3均为直立键，也即说明3位羟基为平伏键，属于α构型；而H-2为β构型，从而证明了合成的终产物即为2β,3α-二羟基-11-羰基齐墩果烷-12-烯-30-羧酸。
实施例2：式(1)化合物对HepG2.2.15细胞分泌的HBV-DNA复制的抑制作用
2.1细胞培养：
将HepG2.2.15细胞培养于含10％灭活胎牛血清，100U/毫升青霉素和100U/毫升链霉素，100微克/毫升G418的DMEM培养基中，置37℃，5％CO2，100％相对湿度的培养箱中培养。
2.2测定式(1)化合物对乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBV-DNA)复制的抑制作用：
取对数生长期的HepG2.2.15细胞，用培养基将细胞稀释成1×105个/毫升，接种于96孔细胞培养板，每孔100微升，在37℃，5％CO2，100％相对湿度的培养箱中培养24小时后加入用培养基稀释的式(1)所示之五环三萜酸类化合物，浓度分别为66.75微克/毫升，13.35微克/毫升和2.67微克/毫升，每孔200微升，每个浓度设三个复孔，置于37℃，5％CO2，100％相对湿度的培养箱中培养，每4天换含相同浓度样品的培养基，将同一样品同一浓度的换出的培养基等体积混匀，作为待测样品。第8天时用HBV-DNA定量PCR试剂盒测定培养基中HBV-DNA浓度。以拉米呋啶(3-TC)为阳性对照，其测试浓度为100微克/毫升，20微克/毫升和4微克/毫升。
2.3实验结果
实验结果举例说明如表1所示，具有五环三萜酸骨架之式(1)化合物具有强效的抑制乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBV-DNA)复制的作用。
表1受试样品对HepG2.2.15细胞的HBV-DNA复制的抑制率(％)
Figure BDA0002601781880000111
2.4结果说明
该实施例结果说明：式(1)所示之五环三萜酸类化合物2β,3α-二羟基-11-羰基齐墩果烷-12-烯-30-羧酸对乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBV-DNA)的复制具有极为强效的抑制作用，在浓度为66.75微克/毫升剂量时其对HBV-DNA复制显示出95.3％的抑制率，高于100微克/毫升的阳性对照药物拉米呋啶，因此该五环三萜酸类化合物属于有效的非核苷类抑制乙肝病毒天然产物，值得进一步关注和深入研究，并可预期五环三萜酸化合物或其可药用盐及其组合物进一步优化发展为抑制乙肝病毒HBV-DNA复制的非核苷类创新药物。
实施例3：式(1)化合物对乙型肝炎e抗原(HBeAg)的抑制作用
3.1细胞培养：
将HepG2.2.15细胞培养于含10％灭活胎牛血清、100U/毫升青霉素和100U/毫升链霉素、100微克/毫升G418的DMEM培养基中，置37℃，5％CO2，100％相对湿度的培养箱中培养。
3.2测定受试样品对HepG2.2.15细胞分泌的HBeAg的抑制作用：
取对数生长期的HepG2.2.15细胞，用培养基将细胞稀释成1×105/毫升，接种于96孔细胞培养板，每孔100毫升，在37℃，5％CO2，100％相对湿度的培养箱中培养24小时后加入用培养基稀释的受试样品，每个浓度设三个复孔，每孔200微升，置于37℃，5％CO2，100％相对湿度的培养箱中培养，每4天换含相同浓度样品的培养基，将同一样品同一浓度的换出的培养基等体积混匀，作为待测样品。第八天时用ELISA试剂盒测定培养基中乙型肝炎e抗原(HBeAg)浓度，以P/N表示。其中，根据实施例1制备得到的式(1)化合物的浓度为66.75微克/毫升，13.35微克/毫升和2.67微克/毫升；以拉米呋啶(3-TC)为阳性对照，其测试浓度为100微克/毫升，20微克/毫升和4微克/毫升。
3.3实验结果：
实验结果如表2所示。式(1)所示之五环三萜酸2β,3α-二羟基-11-羰基齐墩果烷-12-烯-30-羧酸显示出确切的抑制乙型肝炎e抗原(HBeAg)的作用。在实验第八天时，式(1)化合物在较低的浓度(66.75微克/毫升)下对HepG2.2.15细胞分泌的HBeAg抑制活性便达到35.7％，高于最高浓度(100微克/毫升)的3-TC对HBeAg的抑制活性。
表2.受试样品对HepG2.2.15分泌的乙型肝炎e抗原(HBeAg)抑制率(％)
Figure BDA0002601781880000121
3.4结果说明：
该实施例结果表明：式(1)所示之五环三萜酸2β,3α-二羟基-11-羰基齐墩果烷-12-烯-30-羧酸对HepG2.2.15细胞分泌的乙型肝炎e抗原(HBeAg)具有确切的抑制作用。其于66.75微克/毫升浓度下抑制HBeAg分泌的强度是阳性对照药物(100微克/毫升3-TC)的1.79倍；可见该五环三萜酸可以显著抑制乙肝病毒分泌HBeAg的活性，因而可预期发展为降低乙型肝炎e抗原、控制病毒性乙型肝炎症状的药物。
在上述说明书阐述本发明时，同时提供了实施例的目的是举例说明本发明的实际操作过程和本发明的意义。在进入本发明权利要求和其等同物范围内时，本发明的实际应用包括所有一般变化、配合，或改进。

Claims (3)

1.具有式(1)所示结构的2,3-双羟基甘草次酸用于制备治疗乙型病毒性肝炎药物的用途；
Figure FDA0002601781870000011
式(1)化合物的名称为：2β,3α-二羟基-11-羰基齐墩果烷-12-烯-30-羧酸。
2.具有权利要求1中式(1)所示结构的2,3-双羟基甘草次酸用于制备乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸HBV-DNA抑制剂的药物中的应用，式(1)化合物的名称为：2β,3α-二羟基-11-羰基齐墩果烷-12-烯-30-羧酸。
3.具有权利要求1中式(1)所示结构的2,3-双羟基甘草次酸用于制备乙型肝炎病毒核心抗原HBeAg抑制剂的药物中的应用，式(1)化合物的名称为：2β,3α-二羟基-11-羰基齐墩果烷-12-烯-30-羧酸。
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