CN111789851A - 双羰基甘草次酸甲酯用于制备治疗病毒性乙肝药物的用途 - Google Patents

双羰基甘草次酸甲酯用于制备治疗病毒性乙肝药物的用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及双羰基甘草次酸甲酯用于制备治疗病毒性乙肝药物的用途。具体而言，本发明涉及式(1)化合物，即3,11‑二羰基齐墩果烷‑12‑烯‑30‑羧酸甲酯，在制备治疗乙肝病毒感染疾病药物的用途。式(1)化合物具有显著的抑制HBV DNA复制活性，其在较低剂量(1.33微克/毫升)时对乙肝病毒HBV DNA的复制抑制活性便已超过65％。以上表明该双羰基甘草次酸甲酯化合物可预期用于制备抑制HBV DNA复制、治疗乙型肝炎病毒感染疾病之创新型非核苷类药物的用途。

Description

双羰基甘草次酸甲酯用于制备治疗病毒性乙肝药物的用途
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体而言，本发明涉及一种甘草次酸衍生物即3,11-二羰基齐墩果烷-12-烯-30-羧酸甲酯用于制备治疗乙型肝炎病毒感染疾病药物的用途。所述化合物在较低剂量(1.33微克/毫升)时对乙肝病毒DNA(HBV DNA)的复制抑制活性超过65％，可预期发展为抑制HBV DNA复制的非核苷类创新药物。
背景技术
乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的传染病，故又称为病毒性乙肝。HBV是嗜肝DNA病毒科hepadnaviridae的一员，其形状为直径42纳米的球形颗粒。HBV是奇特的病毒，在其它动物中较少有传染性，唯有在人体或者灵长类动物黑猩猩体内才能得以复制。该病毒通过乙肝病毒携带者和乙肝病人的血液、唾液、精液、阴道分泌物进行传播，具有慢性携带状态。本病在我国广泛流行，因其分为垂直传播、水平传播、家庭内传播、医源性传播和性传播等多种方式，对人群感染率高，在某些地区感染率达到35％以上。据有关资料，肝炎检测阳性的患者已经达到1.89亿，而应就诊未就诊人数(携带者)将近4亿。是当前危害人民健康最严重的传染病之一。乙肝临床表现多样化，易发展为慢性肝炎和肝硬化，少数病人可转变为原发性肝癌。
目前，对乙肝患者的用药主要分为保肝降酶、抗病毒、抗肝纤维化和调节免疫等数个大类。抗病毒是根本方法，而保肝降酶只是辅助治疗，多治标而鲜见治本。虽然近些年来抗病毒药物治疗乙肝方面取得了一些进展；然而，目前对于病毒性乙肝临床上的治疗方案只能达到抑制HBV复制和继发感染，最主要药物仍是核苷类药物如拉米呋啶(3-TC)、恩替卡韦、阿德福韦(ADV)、替比夫定等，还有处于临床试验期中的emtricitabine、tenofovir、clevuding等。核苷类药物部分优点为：生物利用度高，口服较安全。然而，它们虽然能暂时性地控制病情，但一则售价昂贵；二则长期使用均可出现耐药性，以及停药后出现HBV DNA、ALT及肝组织学等指标不同程度的反弹；三是长期使用核苷类药物出现的较为明显的众所周知的不良作用，例如肾脏损伤、婴儿致畸等。最为头痛的是：病毒耐药的出现大大降低了治愈率，因为核苷类药物对病毒复制是可逆的，所以对大部分患者若欲达到最大疗效，疗程必须在一年以上，如此其耐药性随之出现，就达不到预期之效果。且核苷类药物还有难以清除cccDNA、治疗一年后HBsAg难以阴转等不足之处。
近几年随着肝病的研究，发展了标准化的HBV DNA的分析，大大推进了对乙肝患者病情的了解。HBV DNA的定量分析能预测乙肝的严重性及其预后，因为HBV DNA持续阳性(即持续病毒血症)容易使乙肝病情进展和加重；高乙肝病毒(HBV DNA)含量容易促进肝硬化的形成；HBV DNA持续存在是肝细胞癌(HCC)发生的高危因素。特别是病毒含量较高、病程较长、年龄较大或合并其它肝病者，体内持续高浓度的HBV DNA，可导致其代常性肝硬化及原发性肝重症的死亡率明显增加。同时必须认识到，HBV DNA水平与肝脏组织学的关系极其密切：文献报道经抗病毒治疗，肝脏纤维化的改善、消除明显；近期国际肝病会议报导，强效和低耐药性的抗病毒治疗，随着HBV DNA的降低和转阴，可观察到肝硬化出现不同程度的逆转。因此，现在主张肝硬化也应进行抗病毒治疗。
因此，HBV DNA指标在抗病毒治疗中的应用也起着举足轻重的作用：HBV DNA的水平是决定慢性乙型肝炎是否需要抗病毒治疗的重要指标；在抗病毒治疗中，根据HBV DNA的治疗反应，判断是否病毒学早期应答进而决定长期用药的策略以取得持续性的病毒学应答，达到持续病毒抑制的目的；根据HBV DNA持续抑制情况争取病毒持续阴性，以争取达到抗病毒最终治疗目标；根据HBV DNA持续完全受到抑制，也显示出了cccDNA的不同程度好转和消失；在抗病毒治疗中，以HBV DNA的变化来评估和预防抗病毒药物所引起的病毒变异及耐药发生的风险；一旦发生病毒变异或耐药时，HBV DNA的变化是唯一的最先的信号和诊断依据，也是治疗耐药和改变治疗策略的指导和依据。
综上所述，对HBV DNA的抑制程度在乙肝的进一步诊断和治疗上有着新的重大意义，对疗效的观察，对评估乙肝预后及耐药危险性均有较大的指导作用。所以，亚太肝脏研究学会和欧洲肝脏研究学会均将HBV DNA检测不到作为乙型肝炎病毒患者治疗终点之一。我国新药开发指南中也将受测化合物对于HBV DNA的抑制强度视为评价治疗乙肝药物药效的重要指标。
必须说明的是：目前使用的抗病毒药物其实只是病毒复制的抑制剂，并不能直接杀灭病毒和破坏病毒体，否则就会损伤宿主细胞。这些抗病毒药物(多为核苷类药物)还存在上述毒副作用大、易引起病毒基因突变、停药后易反跳等缺点，因此开发新型抗病毒药物是当今药物研发领域的当务之急。其对于治疗我国大量的乙肝患者和病毒携带者、控制传染源等都有着极其重要的社会意义和经济意义。所以，从民族民间长期使用的天然药物中发现新的非核苷类乙肝病毒抑制剂及此类能够抑制HBV DNA复制的先导化合物有着很大的指导性意义，并有着辽阔的发展前景。
基于此目的，发明人团队完成了多项关于抗乙肝病毒天然产物及其结构改造衍生物的研发工作，发现了多种抑制HBV DNA复制的化合物，从而说明从天然产物及其合成衍生物中筛选出能够防治乙肝病毒感染的创新性药物是可行的。[参见：“一类对映桉烷醇类倍半萜抑制乙肝病毒的医药用途”(赵昱、刘光明、于荣敏、李海波等；ZL 200610053827.4)；“2β-羟基冬青酸抑制乙肝病毒的医药用途”(李校堃、赵昱、黄可新、李海波等；ZL200610053749.8)；“2α,3β-二羟基–5,11(13)–二烯桉烷–12–酸抑制乙肝病毒的医药用途”(赵昱、张礼和、孙汉董、李海波等；ZL 200610053601.4)；“艾里莫芬烷内酯抑制乙肝病毒的用途及其药物组合物”(赵昱、李海波、杨雷香、周长新等；ZL 03153691.3)；“一种艾里莫芬内酯酸天然产物及其应用”(赵昱、周长新、施树云、王晓雨等；ZL 200610053575.5)；“一种桉烷型倍半萜酸及其用途”(赵昱、刘光明、李海波、巫秀美等；ZL 200610053579.3)；“六棱菊属植物提取物在制备抑制单纯疱疹病毒及乙肝病毒的药物组合物中的用途”(赵昱、周长新、于荣敏、白骅；ZL 200510132508.8)；“1β–氧代–5,11(13)–二烯桉烷–12–酸抑制乙肝病毒的医药用途”(赵昱、李校堃、黄可新、李海波等；ZL 200610053610.3)；“1β-羟基冬青酸抑制乙肝病毒的医药用途”(赵昱、李校堃、黄可新、巫秀美等；ZL 200610053625.X)；“1-氧-取代苯甲酰奎尼酸化合物及其抑制乙肝病毒用途”(李校堃、胡利红、巫秀美、赵昱等；ZL200810062451.2)；近期，本发明人团队从天然产物为起始模板合成的衍生物中发明了新型抗HBV活性化合物及其在制备抗HBV药物中的应用：含溴二氢黄酮醇木脂素(ZL201010181451.1)，A环偶合黄酮木脂素(ZL 201010181892.1)，含苄氧基黄酮木脂素(ZL201010181644.7)，B/E双甲氧基水飞蓟宾(ZL 201010181499.2)，槲皮素二聚体黄酮(ZL201010181869.2)，一种苯骈苯丙素(ZL 201010181533.6)，B环乙氧基二氢黄酮醇(ZL201010181512.4)，取代异水飞蓟宾(ZL 201010181679.0)，A环取代水飞蓟宾酯(ZL201010181721.9)，E环溴取代水飞蓟宾(ZL 201010181632.4)，E环去甲氧水飞蓟宾(ZL201010181731.2)，乙酰胺脱氢水飞蓟宾(ZL 201010181523.2)，一种角型黄酮木脂素(ZL201010181503.5)，双烯丙基黄酮木脂素(ZL 201010181908.9)，双甲基脱氢水飞蓟宾(ZL201010181775.5)，双胺甲酰脱氢水飞蓟宾(ZL 201010181504.X)，黄酮木脂素(±)Scutella prostin A(ZL 201010181362.7)，芳氨甲酰脱氢水飞蓟宾(ZL201010181414.0)，E环碘取代水飞蓟宾(ZL 201010181661.0)，B环乙氧基水飞蓟宾(ZL201010181500.1)，A环二氧六环黄酮木脂素(ZL 201010181411.7)，脱氢水飞蓟宾双醚(ZL201010117317.5)，一类脱氢水飞蓟宾三烷基醚(ZL 200910099405.4)，异戊烯基氧基取代的脱氢水飞蓟宾醚(ZL 200910099404.X)，7及20位脱氢水飞蓟宾双烷醚(ZL200910099403.5)，A环上取代的水飞蓟宾醚(ZL 200910099042.4)，双烯丙基取代的水飞蓟宾醚(ZL 200910099041.X)。毋庸置疑，继续从天然产物及其结构改造衍生物中寻找能够抑制HBV DNA复制的先导化合物是非常有必要和紧迫的，也因此被国家科技部列为新药研制重大专项之一。
中药甘草是豆科甘草属植物，《神农本草经》将此草药列为上品。唐代《药性本草》中载：诸药中甘草为君，治七十二种乳石毒，解一千二百般草木毒，调和众药有功，故有国老之称。杏林中向来有“无草不成方”之说，其主要功效在于清热解毒、调和药性等。TCM120中记载的方剂数据库中，所载处方中甘草使用频率列为第一。甘草的块根和根茎中含大量甘草酸，也称甘草甜素。2003年，德国法兰克福大学医院科学家发现甘草酸能够抑制Vero细胞中的SARS相关病毒也即SARS病毒临床分离株FFM-1和FFM-2的复制(Jindrich Cinatl Jret al,Lancet,2003,361:2045-2046)，更赋予该天然产物更多的研究空间。甘草酸除能抑制病毒复制，还可以抑制病毒的吸附与穿透功能。在病毒吸附期及吸附期后加入甘草酸效果更明显。因此，甘草酸是一个潜在的对抗高危病毒的有效先导化合物。基于此，不断有科学家研究其衍生物筛选更高效的抗病毒制剂，并发现其硫酸酯抗HIV的作用是甘草酸的4倍，极有希望开发成高效的抗病毒制剂或者免疫增强剂。
我国科学家发现：甘草酸还具有保肝的功效，能延缓和降低血清转氨酶的升高[田庆来，等，甘草有效成分的药理作用研究进展，天然产物研究与开发，2006,(18)：343-347]；针对136例慢性乙型肝炎(CHB)患者的临床试验也发现异甘草酸镁注射液能显著改善患者临床症状、体征及肝功能生化指标[徐庆杰等，异甘草酸镁治疗慢性乙型肝炎的临床研究，临床医学，2011,31(7)：74-75]；因此，近年来我国甘草酸制剂已经用于CHB的辅助治疗，虽未能根治病毒性乙肝，但在改善CHB症状等方面取得一定效果。
甘草酸是甘草次酸的二葡萄糖醛酸苷，甘草次酸在临床上当做肾上腺皮质激素及促肾上腺皮质激素药来使用，可以代替去氧皮质酮用于对阿狄森氏病的治疗。虽然甘草次酸具有抗炎、增强非特异性细胞免疫功能、氧自由基清除等多种生理功能，然而，18β-甘草次酸衍生物治疗DNA类病毒感染尤其是其用于抗乙肝病毒方面的新用途尚未得到有效开发，故此从甘草次酸类五环三萜衍生物中寻找抗乙肝病毒领域的活性化合物、也即将此类结构改造使其具有抗DNA类病毒活性是一个崭新的领域。从其中发现抗HBV的先导化合物更是极具希望的挑战。为了探索这个领域，我们设计了包括式(1)所示结构在内的一系列的18β-甘草次酸衍生物，以期发现能抑制HBV DNA复制的18β-甘草次酸衍生物类先导化合物，从而将其进一步开发成具有能抑制HBV DNA复制、治疗CHB的创新性药物。
发明内容
虽然甘草次酸具有抗炎、增强非特异性细胞免疫功能、氧自由基清除等多种生理功能，但还没有直接应用于HBV DNA复制的抑制。因此，我们将其选做起始物，对其结构进行合理改造，通过以计算机辅助设计为手段，设计并制备了与18β-甘草次酸结构有所差异的一种五环三萜衍生物，也即甘草次酸3位氧化成羰基，增强整个分子的不饱和度，降低了氧氢比，同时再将30位羧基进行甲基化。我们的目的之一是：希望发现能抑制HBV DNA复制的18β-甘草次酸衍生物类先导化合物，从而将其进一步开发成抗HBV感染的制剂。
本发明的目的是提供了式(1)所示的3,11-二羰基齐墩果烷-12-烯-30-羧酸甲酯用于制备抑制HBV DNA复制暨治疗乙型肝炎病毒感染疾病药物的新用途。
Figure BDA0002602825330000051
式(1)化合物的名称为：3,11-二羰基齐墩果烷-12-烯-30-羧酸甲酯，其IUPAC名为：(2S,4aS,6aS,6bR,12aS)-methyl-2,4a,6a,6b,9,9,12a-heptamethyl-10,13-dioxo-1,2,3,4,4a,5,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,12,12a,12b,13,14b-icosahydropicene-2-carboxylate。
本发明还提供了一种制备式(1)所示化合物的方法，其特征是：用市售的甘草次酸先以重氮甲烷生成羧酸甲酯，再以三氧化铬温和反应生成烯酮结构而得。
本发明的另一个目的是提供了一种用于制备能抑制HBV DNA复制、治疗乙型病毒性肝炎药物用途的组合物，或者它的可药用盐和可药用辅料及溶剂化物，其特征为含有治疗有效量的作为活性成分的由式(1)化合物组成的混合物。其药物剂型可以是片剂、胶囊剂、注射剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、贴片剂、皮下植埋剂、外用搽剂、口服液或软膏剂，还可以采用现代制药界所公知的控释或缓释剂型或纳米制剂。
发明人设计的式(1)化合物3,11-二羰基齐墩果烷-12-烯-30-羧酸甲酯与天然甘草次酸相比较，具有诸多结构和物化性质上差异化的特征，包括其疏水性、芳香性、吉布斯自由能、氢键受体、电性、分子间范德华力、以及3D构象、伸展方向、分子重心、共轭程度、电性分布中心等特质均与甘草次酸有着明显不同；且式(1)化合物分子量比甘草次酸增大了12个质量单位。上述特征都决定了式(1)所示化合物之三维构象与HBV DNA之3D空间结构相结合之配体-受体结合复合物形态和结合方式都可能产生较大的差别，其结合位点和结合模式、其结合自由能等均会产生较大的改变，因而可能在抑制HBV DNA复制方面有着意想不到的效果。
HepG2.2.15细胞是对人肝癌细胞系HepG2细胞转染HBV基因衍生而得，该细胞系可以稳定的进行HBV基因组的复制，细胞上清也可以测得到HBV DNA。我们测试了式(1)化合物对HepG2.2.15细胞分泌的HBV DNA复制的抑制活性，以期最终获取能够有效抑制HBV DNA复制之自主知识产权的化学实体。试验结果发现：式(1)所示之18β-甘草次酸衍生物对乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸的复制具有极为强效的抑制作用，令人兴奋的是：其在较低剂量(1.33微克/毫升)时对HBV DNA的复制抑制活性超过65％。以上说明式(1)化合物有着意想不到的抗HBV效果，从而可以预期其作为抑制HBV DNA复制、治疗乙型病毒性肝炎之活性先导化合物继续开发。并可预期进一步优化发展为抑制HBV DNA复制的创新类非核苷类创新药物，据此完成本发明。
综上所述，我们从甘草次酸衍生而成的该五环三萜既有结构上的独特性，又有抗病毒作用方面研究的新颖性，并在抗乙肝病毒活性测试中发现了不寻常的抑制HBV DNA复制的活性，有望成为治疗CHB之非核苷类药物之活性先导化合物。经本发明人详细的文献查阅，到目前为止，尚无有关该化合物治疗乙肝病毒感染性疾病和制备抗乙肝病毒药物的报道。五环三萜类式(1)化合物对于HBV DNA强效抑制属于意想不到的发现，有着确切的原创性。
本发明有益之处在于：首次发现式(1)所示之化合物3,11-二羰基齐墩果烷-12-烯-30-羧酸甲酯具有抑制HBV DNA复制、并在防治乙肝病毒方面的成药潜力，为开发成为抗HBV之非核苷类创新药物、开发治疗病毒性乙肝的创新药物提供了新的物质基础。具有潜在巨大的社会效益和经济效益。本发明再一特点为：本发明之合成起始物甘草次酸和/或甘草酸来源方便，式(1)化合物制备方法简单易行，原料来源方便易得，成本低，污染小，利于节能减排条件下的大规模生产。产业化前景十分明确。
具体实施方案
本发明人通过化学合成，并通过多种层析手段纯化得到该强效抑制HBV DNA复制活性的一个甘草次酸衍生而成的式(1)所示五环三萜酸类化合物，又经质谱和核磁共振波谱等综合解析推导出其化学结构。本发明人发现，式(1)化合物对HBV DNA的复制具有显著的抑制作用，提示该化合物具有用药安全、强效抑制HBV DNA复制的特点。因此，根据本发明人的研究，发明人所设计并合成的式(1)所示之甘草次酸类衍生物可以用于制备治疗乙肝病毒感染性疾病的非核苷类药物和用于治疗乙肝病毒感染性疾病。
为了更好地理解本发明的实质，下面分别用式(1)化合物的制备及其对HepG2.2.15细胞分泌的HBV DNA复制之抑制作用试验的结果，说明其在制药领域中的新用途。实施例给出了式(1)化合物的部分合成、结构鉴定、和活性数据。若无特别说明，本发明的百分比指的是重量百分比。必须说明，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
实施例1：式(1)化合物3,11-二羰基齐墩果烷-12-烯-30-羧酸甲酯的制备
1.1仪器与试剂
紫外光谱用Shimadzu UV-240紫外分光光度计测定；核磁共振氢谱1H-NMR由INOVA型超导核磁共振波谱仪(VARIAN INOVA-400MHz)测定(四甲基硅醚TMS为内标)；电喷雾质谱ESI-MS由Bruker Esquire 3000+质谱仪测定；柱层析用硅胶(100～200，200～300和300～400目)以及薄层层析用硅胶GF254(10～40目)均由青岛海洋化工厂生产；所用试剂均为分析纯，其中石油醚沸程为60～90℃；高效液相检测(HPLC)使用安捷伦1100仪；薄层制备层析(PTLC)用Merck公司的铝箔硅胶板；柱色谱用葡聚糖凝胶Sephadex LH-20采用瑞典Amersham Pharmacia Biotech AB公司产品；薄板(TLC)检测用254nm和365nm的紫外灯；显色剂用碘蒸气、10％硫酸-乙醇以及磷钼酸溶液。
1.2中间体化合物甘草次酸甲酯(2)的制备
Figure BDA0002602825330000071
其中，glycyrrhetic acid是指甘草次酸，CH2N2,Et2O是指重氮甲烷乙醚溶液。
在干燥的反应瓶中加入7.02克甘草次酸(购自西安晨艺生物科技有限公司，HPLC检测纯度99％)，以乙醚﹕四氢呋喃(1﹕1，V/V)混合溶液50毫升溶解。在通风橱内，磁子搅拌下以分液漏斗滴入新制备的重氮甲烷的乙醚溶液20毫摩尔，生成大量白色絮状固体，待气泡溢出消失后，继续反应60分钟。滴入1M盐酸溶液，至无气体放出(消除过量重氮甲烷)，布氏漏斗过滤，将白色固体与水层分开，固体先以50毫升0.1N氢氧化钠溶液洗涤，再以双蒸水洗至滤下液为中性，减压干燥，得到白色固体5.80克。硅胶柱层析，以氯仿-丙酮(100﹕1～1﹕1)洗脱，TLC薄层检测，收集纯品，得到中间体化合物甘草次酸甲酯(式2化合物)4.98克，Rf(石油醚﹕氯仿﹕甲醇＝4﹕4﹕0.6)＝0.75；收率69.0％。
1.3式(1)化合物的制备
将1.2项下制备出的中间体化合物甘草次酸甲酯(2)4.84克加入9毫升醋酐和70毫升的冰醋酸混合溶液中，搅拌溶解呈澄清淡黄色溶液。缓慢加入三氧化铬4.0克，常温下搅拌2小时，TLC检测反应完全。向褐色溶液中加水50毫升，二氯甲烷100毫升后静置。分层后以分液漏斗分出水层与有机层。水层以40毫升二氯甲烷洗三次，合并有机层。有机层溶液以饱和碳酸氢钠溶液洗至碱性后，再用水冲洗至中性。以污水硫酸钠干燥过夜。以120克硅胶(100～200目)柱层析梯度洗脱，洗脱剂为石油醚﹕醋酸乙酯(10﹕1～7﹕1)，TLC检测，合并纯品，得到纯度为98％的白色固体3.24克，收率67.2％。Rf(石油醚﹕氯仿﹕甲醇＝4﹕4﹕0.6)＝0.81；核磁共振氢谱1H-NMR(400MHz，氘代氯仿)δ：0.82(单峰,3H)，1.07(单峰,3H)，1.10(单峰,3H)，1.15(单峰,3H)，1.16(单峰,3H)，1.27(单峰,3H)，1.37(单峰,3H)，2.11～2.28(多重峰，5H)，2.44(单峰,1H,H-9)，2.97(多重峰,1H,H-1)，3.70(单峰，3H，CO2Me)，5.71(单峰,1H,H-12)；核磁共振碳谱13C-NMR(100MHz，氘代氯仿)δ：15.6(q),17.9(q),20.4(t),21.8(q),21.9(q),25.5(q),26.1(t),26.7(q),27.2(t),28.5(q),31.0(t),32.1(t),33.6(t),35.8(s),36.2(t),38.7(t),39.8(s),42.1(t),44.3(s),44.6(s),45.7(s),47.4(s),49.8(d),52.5(q),56.5(d),60.1(d),128.4(d),169.7(s),178.8(s),201.1(s),216.3(s)。电喷雾质谱ESI-MS：m/z 483[M+H]+。
实施例2：式(1)化合物对HepG2.2.15细胞分泌的HBV DNA复制的抑制作用2.1细胞培养：
将HepG2.2.15细胞培养于含10％灭活胎牛血清，100U/毫升青霉素和100U/毫升链霉素，100微克/毫升G418的DMEM培养基中，置37℃，5％CO2，100％相对湿度的培养箱中培养。
2.2测定式(1)化合物对乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBV DNA)复制的抑制作用：
取对数生长期的HepG2.2.15细胞，用培养基将细胞稀释成1×105个/毫升，接种于96孔细胞培养板，每孔100微升，在37℃，5％CO2，100％相对湿度的培养箱中培养24小时后加入用培养基稀释的式(1)化合物，浓度分别为20微克/毫升，4微克/毫升和0.8微克/毫升，每孔200微升，每个浓度设三个复孔，置于37℃，5％CO2，100％相对湿度的培养箱中培养，每4天换含相同浓度样品的培养基，将同一样品同一浓度的换出的培养基等体积混匀，作为待测样品。第8天时用HBV DNA定量PCR试剂盒测定培养基中HBV DNA浓度。以拉米呋啶(3-TC)为阳性对照，3-TC的测试浓度为100微克/毫升、20微克/毫升和4微克/毫升。
2.3实验结果：
实验结果举例说明如表1所示，式(1)所示之双羰基甘草次酸甲酯化合物具有强效的抑制乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBV DNA)复制的作用。
表1样品第8天时对HepG2.2.15细胞的HBV DNA复制的抑制率(％)
Figure BDA0002602825330000081
2.4结果说明：
该实施例结果说明：式(1)所示之双羰基甘草次酸甲酯化合物对乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBV DNA)的复制具有极为强效的抑制作用，令人兴奋的是：其在较低剂量(1.33微克/毫升)时对乙肝病毒HBV DNA的复制抑制活性超过65％，因此该五环三萜酸类化合物属于显著有效的非核苷类抑制乙肝病毒天然产物，非常值得进一步关注和深入研究，并可预期进一步优化发展为抑制乙肝病毒HBV DNA复制的创新类非核苷类创新药物。
在上述说明书阐述本发明时，同时提供了实施例的目的是举例说明本发明的实际操作过程和本发明的意义。在进入本发明权利要求和其等同物范围内时，本发明的实际应用包括所有一般变化、配合，或改进。

Claims (2)

1.具有式(1)所示结构的双羰基甘草次酸甲酯用于制备治疗乙型病毒性肝炎药物的用途；
Figure FDA0002602825320000011
式(1)化合物的名称为：3,11-二羰基齐墩果烷-12-烯-30-羧酸甲酯。
2.具有权利要求1中式(1)所示结构的双羰基甘草次酸甲酯用于制备抑制乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸HBV DNA复制的药物之用途，式(1)化合物的名称为：3,11-二羰基齐墩果烷-12-烯-30-羧酸甲酯。
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