CN111904652B - 一种提高新生小鼠静脉注射效果的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高新生小鼠静脉注射效果的方法，包括将新生小鼠麻醉，固定在平台，放置在解剖显微镜下，新生小鼠头部朝向外置光源；在外置光源和新生小鼠之间设置隔光板，所述隔光板和所述平台之间设置有透光缝隙，透射的光由斜下方向上照射在新生小鼠头部。本发明的一些实例，通过对光照条件进行控制，可以清晰观察到新生小鼠颞浅静脉血管内血流细节，无需借助染料，可以直接观察到注射是否成功。避免了现有方法大剂量注射对新生小鼠的伤害。

Description

一种提高新生小鼠静脉注射效果的方法

技术领域

本发明涉及小鼠的建模方法，特别涉及一种提高新生小鼠静脉注射效果的方法。

背景技术

有多种遗传性罕见病多发于婴幼儿时期，严重威胁着新生儿的生命健康，如脊髓性肌肉萎缩、杜氏肌营养不良症等，目前针对这些疾病几乎没有有效的治疗方法或药物，所以相关的治疗药物研发被迫切需要。这些疾病主要是早期发病，非临床研发阶段因以早期药物干预研究最为合适，在各种小鼠疾病模型运用研究中，给药方式应尽量模拟临床给药条件，静脉注射是被使用最为广泛的临床给药方式，所以一种有效的经静脉注射给药的新生小鼠研究模型在这些需要通过早期干预进行新药评价的临床前研究运用中最为合适。

现在药物早期干预评价新生小鼠模型主要构建对象为刚出生的小鼠。新生小鼠由于体形太小，很难通过尾静脉或其他静脉注射方式给药，新生鼠面部的皮肤较薄，可视度相对较好，且该位置有一条颞浅静脉(superficial temporal vein)相对较粗，基本满足在显微镜下注射的条件，因此颞浅静脉注射方式在新药早期干预评价新生小鼠模型构建中被运用得较为广泛。

新生小鼠头部静脉上方的皮肤呈半透明状，但是可视程度有限，在常规显微镜视野下只能看到血管的位置，无法清晰地看清血管内部的血流状况，在此种视野条件下进行注射，只能使用较粗的针头行进针，通过血液回流判断针尖是否扎入血管。以颞浅静脉为例，新生小鼠颞浅静脉直径约0.4mm，而现有方法常用的32G针头针尖斜面大于0.5mm，很容易扎穿血管，使用更细的针头则无法观察到血液回流现象，在这种条件下进行注射将会出现注射液渗漏到血管周围的组织中或是皮下，甚至从进针处漏到皮肤外侧。现有方法针对这些阻碍的应对手段是通过50～100ul的大体积注射来弥补注射液渗漏到血管外。但是这又导致了另一个严重问题的出现，出生0～4天内的新生小鼠的血液体积总量约80～120ul，可接受静脉注射体积为15～30ul，小鼠静脉注射范围不应超过10ul/g。注射50～100ul的外源物进入小鼠体内，将严重改变小鼠血液的成分和浓度，影响动物健康，而且这样的注射方法大约30％的药物会渗漏到血管外，也就意味着每次药物注射的误差范围大于30％，这完全无法满足药物研发过程中对剂量-效果精准控制的要求。另外，现有的方法由于血管清晰度受限，无法观察到血管内部液体流动细节，只能粗略地通过血液的颜色判断注射情况。简单来说，在注射过程中，注射液会冲走进针部位的血液，使血管变白，依次判断注射情况，但小鼠面部肌肉抽搐也会出现与注射无关的血管变白现象，所以会出现大概率误判。有一些研究人员为了排除这种误判，通过往注射物中添加与血液颜色对比明显的指示剂来增加判断准确度，但该操作引入了颜色值试剂对小鼠模型评价的影响，不符合药物研发要求。所以，通过现有的静脉注射方法构建获得的药物早期干预评价新生小鼠模型在质量和严谨性上存在严重缺陷，亟待优化。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种改进的新生小鼠注射准备方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种提高新生小鼠静脉注射效果的方法，包括：

1)将新生小鼠麻醉，固定在平台，放置在解剖显微镜下，新生小鼠头部朝向外置光源；

2)在外置光源和新生小鼠之间设置隔光板，所述隔光板和所述平台之间设置有透光缝隙，透射的光由斜下方向上照射在新生小鼠头部。

在一些实例中，所述透光缝隙的宽度为5～20mm。

在一些实例中，所述透光缝隙与新生小鼠头部的间距为15～30mm。

在一些实例中，所述外置光源与所述透光缝隙的间距为30～100mm。

在一些实例中，所述外置光源的亮度为600～700lx。

在一些实例中，在注射期间，调节注射操作区域的局部温度以控制新生小鼠的体温在5～10℃。

在一些实例中，注射前，在新生小鼠静脉所在的部位的皮肤表面滴加透明液体并形成液滴。

在一些实例中，所述透明液体包括但不限于无菌水、缓冲液、生理盐水、酒精溶液等对新生小鼠无害，或基本无害的透明液体，优选为无色液体。

在一些实例中，所述透明液体的滴加量为200～400μL，能够形成具有放大效果的液滴即可。

在一些实例中，所述新生小鼠静脉为颞浅静脉、颞中静脉、颞深静脉、上颌静脉、耳前静脉、耳后静脉、颈外静脉、眶上静脉、眶后静脉窦、内眦静脉、面静脉、下颌后静脉。优选为颞浅静脉。根据静脉的不同，需要对小鼠头部的固定位置进行相应的微调。

本发明的有益效果是：

本发明的一些实例，通过对光照条件进行控制，可以清晰观察到新生小鼠颞浅静脉血管内血流细节，无需借助染料，可以直接观察到注射是否成功。避免了现有方法大剂量注射对新生小鼠的伤害。

本发明的一些实例，通过在注射期间将新生小鼠的体温维持在5～10℃，可以很好的使小鼠处于麻醉状态不会挣扎，同时保证小鼠血流速度正常，利于观察到注射导致的血流变化，大幅提高了注射的成功率。

本发明的一些实例，通过在注射处滴加透明的液滴，利用液滴形成的透镜效应，使得新生小鼠静脉血管在显微镜下视野被聚焦，更为清晰可见，同时不影响注射。

本发明的一些实例，接受药物注射体积低至1ul，药物注射剂量误差可控制在0.1ul以内，相对于10～15ul的注射总体积，注射剂量误差小于1％，解决了通过其他技术构建新生小鼠模型接受药物注射体积超出安全注射量(超过10ul/g)，药物注射量和实际进入血管药物量误差大(平均大于30％)，注射药物消耗量大(每次注射消耗注射液50～100ul)等问题。

附图说明

图1是外置光源的设置示意图；

图2是隔光处理前后的显微视野照片；

图3是滴加无菌水聚焦的对比显微照片；

图4和图5是一些注射实例的结果照片。

具体实施方式

一种提高新生小鼠静脉注射效果的方法，包括：

1)将新生小鼠麻醉，固定在平台，放置在解剖显微镜下，新生小鼠头部朝向外置光源；

2)在外置光源和新生小鼠之间设置隔光板，所述隔光板和所述平台之间设置有透光缝隙，透射的光由斜下方向上照射在新生小鼠头部。

在一些实例中，所述透光缝隙的宽度为5～20mm。缝隙的宽度指上下间距。缝隙的宽度可以根据具体的显示效果进行相应的调整。

在一些实例中，所述透光缝隙与新生小鼠头部的间距为15～30mm。这样会具有相对更佳的静脉显示效果。

在一些实例中，所述外置光源与所述透光缝隙的间距为30～100mm。可以进一步调节间距，以获得更佳的静脉显示效果。

在一些实例中，所述外置光源的亮度为600～700lx。这种亮度下，新生小鼠头部静脉的显示效果更佳。当外源光源距离较远时，也可以相应提高其亮度。

在一些实例中，在注射期间，调节注射操作区域的局部温度以控制新生小鼠的体温在5～10℃。这样可以很好地维持小鼠的麻醉状态，同时可以保证小鼠血流速度正常，利于观察到注射导致的血流变化，大幅提高了注射的成功率。

在一些实例中，注射前，在新生小鼠静脉所在的部位的皮肤表面滴加透明液体并形成液滴。

在一些实例中，所述透明液体包括但不限于无菌水、缓冲液、生理盐水、酒精溶液等对新生小鼠无害、无刺激，或基本无害无刺激的透明液体，优选为无色液体。

在一些实例中，所述透明液体的滴加量为200～400μL，能够形成具有放大效果的液滴即可。

在一些实例中，所述新生小鼠静脉为颞浅静脉、颞中静脉、颞深静脉、上颌静脉、耳前静脉、耳后静脉、颈外静脉、眶上静脉、眶后静脉窦、内眦静脉、面静脉、下颌后静脉。特别的，所述新生小鼠静脉为颞浅静脉。

下面结合实例，进一步说明本发明的技术方案。

实施例1：

一种高精准度新生小鼠静脉注射方法，包括：

预处理：

S1)对手术台和相关设备进行消毒处理，并对手术台预降温处理；

S2)准备好注射液和注射器。

新生小鼠注射：

S3)将新生小鼠进行麻醉处理，并将小鼠固定在在手术台上；

S4)将固定好的小鼠放置到解剖显微镜下，对准焦距，使用LED灯从操作人员的正前方照入，灯光亮度在600-700lx，在灯光与动物之间放一块底端有缝的隔光板，使少部分灯光从缝中透过，形成衍射效果(图1)；

S5)在小鼠面部静脉上方的面部滴加300ul无菌水，形成液体聚焦透镜；

S6)使用提前准备好的注射器，选取视野内任意一根静脉(包括头部的所有静脉)向近心端进针，在清晰视野下将针头插入静脉内

S7)使用手动或者自动注射泵推动注射器进行注射，整个注射过程需要使小鼠体温保持在5～10℃之间；

S8)完成注射后，迅速拔出针头并按压止血，对小鼠进行标记，体温恢复，放回母鼠身边进行哺乳，完成药物早期干预评价的新生小鼠模型构建。

对比例1：常规的新生小鼠头部静脉注射，操作规程如下：

注射前准备：

S1)对手术台和相关设备进行消毒处理；

S2)准备好注射液和注射器。

新生小鼠注射：

S3)将新生小鼠进行麻醉处理，并将小鼠固定在在手术台上；

S4)将固定好的小鼠放置到解剖显微镜下，对准焦距，使用酒精擦拭小鼠面部皮肤并找到颞浅静脉；

S5)从颞浅静脉出进针，当看到出血或血液回流证明针尖扎入血管内；

S6)开始注射，通过血管变白或者颜色指示剂来判断是否成功；

S7)完成注射后，迅速拔出针头并按压止血，对小鼠进行标记，体温恢复，放回母鼠身边进行哺乳。

同一实验人员分别使用实施例1的改进方法和对比例1的常规方法进行新生小鼠注射，对比情况如下表示：

注射方法	注射成功率	最小注射剂量	注射进入血管剂量误差
				实施例1	>85％	1μL	±1％
对比例1	<50％	50μL	±30％

其中：

注射成功率＝药物注射进入血管小鼠数量/尝试注射总数量

注射进入血管剂量误差＝±渗漏到血管外的剂量/当次注射总剂量

渗漏到血管外的注射物一般会渗入血管周围的组织内，无法达到药物进入血管的效果。

隔光板对显微视野的影响：

不设置或设置隔光板，解剖显微镜下的新生小鼠静脉分布如图2所示。从图中可以看出，隔光板的设置，显著提高了新生小鼠头部静脉的可视性，有利于注射。

透明液滴对显微视野的影响：

分别记录上述S5)步滴加无菌水前后的显微视野，结果如图3所示。从图3可以看出，水滴的存在，使得静脉更加清晰可见，且注射器的针尖可以穿过水滴扎入小鼠组织内，进而满足精准注射的要求。

通过在注射处滴加透明的液滴，利用液滴形成的透镜效应，使得新生小鼠静脉血管在显微镜下视野被聚焦，更为清晰可见，同时不影响注射。

注射期间小鼠体温对注射效果的影响

小鼠体温大于10℃时，小鼠较为清醒，在注射过程中不断挣扎，无法固定其头部，不利于注射。

小鼠体温小于5℃时，血流缓慢甚至停止，无法在注射部位产生血流恢复现象，没有血流恢复现象将会大概率导致注射失败。

通过在注射期间将新生小鼠的体温维持在5～10℃，可以很好的使小鼠处于麻醉状态不会挣扎，同时保证小鼠血流速度正常，利于观察到注射导致的血流变化，大幅提高了注射的成功率。

实际注射效果

图4和图5为采用实施例1方法，对出生48小时内的小鼠进行EGFP绿色荧光蛋白表达载体病毒注射所获得的效果，注射体积5ul，精准控制微量注射。图4和图5所示组织为海马和脊髓，注射后观察到EGFP表达效果与注射总量成梯度相关。

本发明一些实例，接受药物注射体积低至1ul，药物注射剂量误差可控制在0.1ul以内，相对于10～15ul的注射总体积，注射剂量误差小于1％，解决了通过别的技术构建新生小鼠模型接受药物注射体积超出安全注射量(超过10ul/g)，药物注射量和实际进入血管药物量误差大(平均大于30％)，注射药物消耗量大(每次注射消耗注射液50～100ul)等问题。

Claims (4)

1.一种提高新生小鼠静脉注射效果的方法，包括：

将新生小鼠麻醉，固定在平台，放置在解剖显微镜下，新生小鼠头部朝向外置光源；

在外置光源和新生小鼠之间设置隔光板，所述隔光板的下表面和所述平台的上表面之间设置有透光缝隙，使一部分灯光从所述透光缝隙中透过，形成衍射效果，透射的光由斜下方向上照射在新生小鼠头部；

所述外置光源为LED灯；

所述透光缝隙与新生小鼠头部的间距为15～30 mm；

所述外置光源与所述透光缝隙的间距为30～100 mm；

在注射期间，调节注射操作区域的局部温度以控制新生小鼠的体温在5～10℃；

注射前，在新生小鼠静脉所在的部位的皮肤表面滴加透明液体并形成液滴；

所述透明液体为无菌水、缓冲液、生理盐水、酒精溶液；

所述透光缝隙的宽度为5～20 mm。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述外置光源的亮度为600～700 lx。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述透明液体的滴加量为200～400 μL。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述新生小鼠静脉为颞浅静脉、颞中静脉、颞深静脉、上颌静脉、耳前静脉、耳后静脉、颈外静脉、眶上静脉、眶后静脉窦、内眦静脉、面静脉、下颌后静脉。

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