CN111902142B - 中枢性生长激素释放肽激动剂及其医学用途 - Google Patents

Abstract

新化合物3‑(1‑(2,3‑二氯‑4‑甲氧基苯基)乙基)‑1‑甲基‑1‑(1,3,3‑三甲基哌啶‑4‑基)脲一盐酸盐具有高渗透能力，能通过血脑屏障并在中枢神经系统水平显示一致的生长素释放肽激动剂活性；该化合物可有效治疗和/或预防中枢神经系统中生长素释放肽受体介导的医学病症。特别地，在实验测试中，该化合物显示出在治疗神经毒性损伤方面的高功效，并且在中枢和外周水平均具有有效的神经保护作用组合模式。该化合物还可用于治疗需要降低心率的疾病。该化合物在低至中等剂量下具有药理活性，因此显示出良好的治疗指数。

Description

中枢性生长激素释放肽激动剂及其医学用途

背景技术

生长激素释放肽(Ghrelin)是胃肠道中生长激素释放细胞(ghrelinergic cells)产生的一种天然肽激素，在中枢神经系统中起神经肽的作用。Ghrelin的生物学靶标是G蛋白偶联的Ghrelin受体(GHSR)，最早于1996年被克隆(1)。现已知两种受体亚型1a和1b，但是只有前者能够激活信号转导(2)。GHSR主要在神经系统以及参与多种生理过程的多个非神经器官中表达(2-4)。Ghrelin肽主要参与食欲的调节，在调节能量的分布和使用率方面也起着重要作用。Ghrelin肽作用于下丘脑脑细胞，可以增加饥饿感，又能增加胃酸分泌和胃肠蠕动，为机体摄取食物做好准备。Ghrelin肽在调节多巴胺神经元的奖励感知中也起着重要作用，多巴胺神经元通过其共定位受体以及其与多巴胺和乙酰胆碱的相互作用将腹侧被盖区与伏隔核(在处理性欲，奖励和强化以及成瘾的过程中发挥作用的部位)相连。临床试验评估了生长激素释放肽在多种疾病状态下的治疗潜力，包括神经性厌食症(5)，癌症恶病质(6,7)，睡眠觉醒调节(8)，慢性心力衰竭(9)和胃肠道活动障碍(10)。在动物中，生长素释放肽可促进神经元的细胞增殖和神经发生(11)。Ghrelin肽还被证明具有神经保护特性并防止细胞凋亡(12)。Ghrelin受体(GHSRs)位于中枢神经系统(CNS)的几个不同区域。生长激素释放肽的外源性给药可在临床前模型中改善实验性脑脊髓炎(15)，帕金森氏症(16)和阿尔茨海默氏病(17)。此外，Ghrelin肽已被提议在中枢或周围神经系统损伤后具有直接的神经修复特性(18)。神经性疼痛具有重要的炎性成分，具有神经胶质细胞的持续活化和促炎性细胞因子产生的增加。此外，有报道称生长素释放肽在糖尿病(20)，慢性收缩性损伤(21)和化疗引起的神经毒性(CIPN)(22)以及急性疼痛(23)和慢性关节炎(24)的啮齿动物模型中具有治疗作用。然而，Ghrelin肽的大脑渗透能力有限(25)，缺乏口服生物利用度，啮齿动物中仅8-24分钟的的半衰期短(26)，人类中37分钟的半衰期短(27)限制了其作为临床药物的效用。实际上，临床前疗效的证明通常需要多次系统性注射或鞘内/脑室内给药，强调需要连续输注生长素释放肽或使用半衰期更长和神经系统渗透力增强的激动剂。

生长激素释放肽受体的识别已促进旨在识别具有与生长激素释放肽类似活性的对所述受体具有结合亲和力的新化合物的研究，以寻找相对于原始肽可能的治疗优势。非肽小分子可能会绕过肽的代谢失活途径，因此在这里特别引起关注。但是，与此同时，与原始肽的较高结构差异可能会导致生长素释放肽和生长素释放肽样分子的原始活性谱发生变化。

专利申请WO2012/116176描述了通式(I)的不对称脲。

其具有生长素释放肽受体调节特性；该申请包含有关该化合物的GHSR1a受体亲和力和对小鼠食物摄入的体内活性的实验数据；该化合物被建议用于治疗多种疾病，包括肥胖，超重，饮食失调，代谢综合症，因衰老或艾滋病而消瘦，胃肠道疾病，胃病等。

专利申请WO2015/134839进一步描述了下式的生长素释放肽调节剂：

该申请包含有关该化合物的GHSR1a受体亲和力和对食物摄入和酒精滥用小鼠模型的体内活性的实验数据。

尽管付出了巨大的努力，但最近发现的小分子激动剂尚未被批准用于治疗。它们的临床效用通常受到安全性不令人满意和/或中枢神经系统吸收不良的限制。特别地，鉴于大部分的ghrelin受体在中枢神经系统中表达并且许多ghrelin依赖性疾病至少是部分地由中枢介导的事实，ghrelin激动剂的CNS不可渗透性是一个严重的局限。另一方面，制造能够有效通过血脑屏障的分子是一项复杂的任务：成功的通过血脑屏障需要克服各种关键步骤，特别是：脑内皮细胞从全身循环中摄取药物分子；药物有效内化到所述细胞中；这些细胞释放未代谢形式药物到中枢神经系统腔室的能力，其量高到足以引起药理反应。只有上述机制的微调/协同作用可能会导致活性形式的药物流过屏障到达中枢神经系统靶标：现实中，全身给药后，在中枢神经系统中仅有少部分已知药物分子被以可探测的量发现：这并不令人惊讶，因为血脑屏障的功能结构可以将CNS隔室与血液中可能存在危险的外源生物隔离开来。

而且，对于那些需要在中枢和外周水平都采取处理的医学疾病，发现能够通过血脑屏障面的分子并不是一个理想的解决方案：事实上，它们面临着实现/维持药物在跨屏障的两个分区的活性形态和活性浓度的平衡的进一步挑战，，从而使任何药物动力学偏向于中枢水平的积累都不会损害外周水平的有用作用；在神经系统疾病领域尤其容易感觉到这个问题，神经系统疾病通常涉及中枢和外周水平两者的损害。此外，通过血脑屏障的能力为中枢水平的所需处理开辟了道路，同时也带来了新的问题，这些问题与潜在的药物在大脑中的过度积聚有关。因此，理想的传脑药物应以非常低的剂量有效，从而确保积累/消除过程之间的平衡，从而防止出现明显量的大脑积累风险。

因此，仍然没有满足需求的小分子，其需对脑中的生长素释放肽受体具有很强的亲和力，能够以非代谢形式大量通过血脑屏障并建立药理活性浓度的合成型生长素释放肽激动剂；此外还需要生长激素释放肽激动剂，其在神经系统领域特别有效，在外周和中枢水平均显示出治疗效果；同时，也有对于具有减少不期望的脑积聚的风险的生长激素释放肽激动剂的需求。

发明概述

本申请已发现化合物3-(1-(2,3-二氯-4-甲氧基苯基)乙基)-1-甲基-1-(1,3,3-三甲基哌啶-4-基)脲一氢-盐酸盐是一种ghrelin激动剂，具有很高的渗透血脑屏障的能力，并在中枢神经系统水平上具有显著的ghrelin激动剂活性。因此，该化合物可有效治疗和/或预防中枢神经系统中生长素释放肽受体介导的医学病症。特别地，实验测试已表明其在神经毒性损伤的治疗中产生了高功效，并且在中枢和外周水平都具有有用的神经保护作用组合模式。该化合物还产生中枢介导的心动过缓作用，迄今为止对于生长素释放肽样分子尚不为人所知，这使其特别适用于需要降低心率的心血管疾病的治疗。该化合物还显示出非线性剂量/功效比，在中等剂量而非最高剂量水平时达到最大：这可以在施用中等剂量的同时达到最大预期效果，从而限制了大脑或其他器官中不必要的大脑积聚的风险以及任何其他一般毒性问题。

附图说明

图1：化合物A处理对顺铂注射入大鼠引起的体重，食物摄入和机械痛敏的影响。顺铂(0.5mg/kg)，每天一次，连续3天(第0天至第2天)腹膜内给药，导致体重和每日食物摄入减少，并引起机械性痛觉过敏。A)单因素方差分析(ANOVA)和事后Tukeys多重检验发现顺铂对体重有显著的总体影响(p<0.05)，化合物A以3、10(两者均p<0.01)和30mg/kg(p＜0.05)治疗后体重增加。B)顺铂显著降低了食物摄入(p<0.05)，通过化合物A10和30mg/kg(p<0.05)的治疗则提高了。C)顺铂诱导机械性痛觉过敏，以10和30mg/kg的化合物A治疗得到显著改善(p<0.05)，但3mg/kg的化合物A治疗无改善。

图2：化合物A对经奥沙利铂治疗的小鼠的神经传导速度(NCV)和电位振幅的影响。在完成给药方案之前和24小时之后测量所有参数，给药方案包含每天口服赋形剂或化合物A(10或30mg/kg)，然后腹腔注射奥沙利铂(6mg/kg)或赋形剂(每4天，总共8次给药)。在记录前1h进行最后一次化合物A的给药。(*表示相对于veh/奥沙利铂，p＝＜0.05；相对于veh/veh，#＝p＜0.05)。A)和C)以10mg/kg和30mg/kg的化合物A的施用显著防止了在经奥沙利铂治疗的小鼠中观察到的指部和尾部NCV的降低。B)通过奥沙利铂给药降低了指部的电位幅度，并且用化合物A的治疗趋于使电位幅度标准化，但是仅给予30mg/kg的化合物A能够使该数据标准化。D)奥沙利铂治疗对尾神经电位幅度没有明显影响。

图3：化合物A逆转表皮内神经纤维密度(IENFD)的降低。在最后一次给予化合物A后24小时测量IENFD。奥沙利铂产生的纤维数量显著减少，可以通过每天以10或30mg/kg的化合物A的处理完全正常化(p<0.01)。A)以10mg/kg和30mg/kg的化合物A的施用能够使IENFD相对于被施用赋形剂的小鼠正常化。B)和C)硼替佐米(bortezomib)的长期治疗引起IENFD的具有统计意义的降低；在预防性设定下而非在治疗性设定下，所有剂量的化合物A均显著防止了这种减少。

图4：化合物A的血浆，DRG和坐骨神经浓度。A)和B)单次口服剂量为10和30mg/kg的化合物A后，该化合物易于吸收并在0.25-0.5小时内以峰值浓度分布在血浆和神经组织中。在血浆中的终末半衰期很短，但坐骨神经和DRG的终末半衰期明显更长。该化合物对坐骨神经和DRG均具有出色的组织渗透性。C)每日给药30天后，血浆中化合物A的浓度非常低，但在坐骨神经和DRG中则升高，表明化合物A在这些组织中明显积累。

图5：化合物A给药逆转硼替佐米引起的异常性疼痛。预防性研究。A)在治疗结束时，用硼替佐米与所有剂量的化合物A组合治疗的组均未显示出异常性疼痛，而在单独用硼替佐米治疗的大鼠中观察到了异常性疼痛。治疗性研究。B)在开始与化合物A共同给药之前(4周)，所有接受硼替佐米治疗的动物均出现了异常性疼痛。从共同治疗开始一周后以及治疗结束时，仅单独使用硼替佐米治疗的组有异常性疼痛，而与化合物A共同治疗的所有组均受到保护。

图6：化合物A对经硼替佐米治疗的大鼠的神经传导速度(NCV)和电位振幅的影响。预防性研究。A)单独使用硼替佐米，或与化合物A组合以3和10mg/kg的剂量进行联合治疗，其数字NCV值在统计学上显著降低，而使用最高剂量的化合物A联合治疗的组和对照组相比则无变化。B)在所有组中均未观察到数字电位振幅的变化。C)和D)单独用硼替佐米，或与所有剂量的化合物A组合治疗的所有组的尾NCV和电位振幅均显著降低。治疗性研究。E)和F)仅用硼替佐米治疗的动物显示数字NCV显著降低，而仅在用最高剂量的化合物A共同治疗的组中观察到电位振幅降低。G)和H)如图所示在预防方面，单独使用硼替佐米或与所有剂量的化合物A组合治疗的所有组的尾NCV和电位幅度均明显降低。

图7：平均心率–与安慰剂相比，用0.1、0.3、1或10mg化合物A剂量治疗的人类患者的绝对值(平均值等于一式三份读数的平均值)。

图8：平均心率–与安慰剂相比，用0.1、1、0.3或10mg化合物A剂量治疗的人类患者相对于基线的变化(平均值等于一式三份读数的平均值)。

图9：化合物A的XRPD数据。

图10：化合物A的¹H-NMR。

图11：化合物A的¹³C-NMR。

图12：对雄性Sprague Dawley大鼠单次静脉注射10mg/kg后，血浆(ng/mL)和大脑(ng/g)中化合物A的平均浓度。

发明详述

本发明的化合物3-(1-(2,3-二氯-4-甲氧基苯基)乙基)-1-甲基-1-(1,3,3-三甲基哌啶-4-基)脲一盐酸盐在本文中简称为“化合物A”。其具有以下化学结构式：

本文所用的术语“医学病症”是指疾病或干扰；术语“疾病”是指已建立的医学综合症；术语“干扰”是指可能导致或不引起完全病理综合症的特定的身体部位、器官或组织的任何损坏或功能失常。

术语“在中枢神经系统中由生长素释放肽受体介导的医学病症”是指对生长素释放肽的治疗有反应的那些典型或至少部分是典型的中枢神经系统疾病/干扰；其可以是脑脊髓炎，帕金森氏病，阿尔茨海默氏病和认知障碍；特别地，化合物A对神经病，神经性疼痛和/或神经变性高度有效；此外，化合物A还显示出意想不到的心动过缓活性，可用于需要降低心率的疾病(心动过速)，例如在化学疗法诱发的心血管毒性反应中；心动过速是中枢神经系统疾病的一部分，因为它对迷走神经控制有反应。当用于治疗神经病时，优选是化学疗法诱导的中央和/或外周水平存在的神经病。化学治疗剂是本领域众所周知的：通常但不限于，它们是烷基化剂或蛋白酶体抑制剂(32)。在烷基化剂中，可以提及的是铂络合物，例如，顺铂、卡铂等。在蛋白酶体抑制剂中，可以提及的有硼替佐米，卡非佐米(carfizomib)，伊沙佐米(ixazomib)，阿普罗佐米(oprozomib)，地兰佐米(delanzomib)，马利佐米(marizomib)，MG-132，ONX-0914，VR-23，塞那妥尔(celastrol)，环己霉素(epoxomicin)等。

术语“生长素释放肽受体”在本领域中是众所周知的，还具有其替代名称“生长激素促分泌素受体”或“GHS受体”。所有这些同义词都是等效的，可以在本文中互换使用；术语生长激素释放肽受体及其同义词扩展到其所有可能的形式(例如GHS1形式)以及其所有同工型(例如同工型GHS1a，GHS1b等)。

当在本文中使用时，术语“治疗”是指旨在治愈、改善、稳定或预防疾病、病理状况或病症的患者的医学管理。该术语包括积极治疗，即专门针对疾病、病理状况、病症或紊乱的改善的治疗，还包括因果治疗，即针对消除相关疾病、病理状况或紊乱的原因的治疗。另外，该术语包括姑息治疗，即旨在缓解症状，病理状况或病症而不是治愈疾病的治疗；预防性治疗，即旨在最小化或部分或完全抑制相关疾病，病理状况或病症发展的治疗；以及支持治疗，即用于补充另一种针对相关疾病，病理状况或病症改善的特定治疗的治疗。

本发明提供了一种治疗或预防由中枢神经系统中的生长素释放肽受体介导的一种或多种医学病症(即疾病或干扰)的方法，其特征在于将化合物A给予需要的患者。

本发明的另一目的是化合物A用于治疗或预防中枢神经系统中ghrelin受体介导的一种或多种医学病症(疾病或干扰)。

本发明的另一个目的是化合物A在制备用于治疗或预防中枢神经系统中ghrelin受体介导的一种或多种医学病症(疾病或干扰)的药物中的用途。

本发明的另一个目的是在有需要的患者中促进中枢神经系统吸收生长素释放肽激动剂的方法，其特征在于向所述患者施用治疗有效量的作为生长素释放肽激动剂的化合物A。

本发明的另一个目的是一种有利于在有需要的患者的中枢神经系统中建立治疗有效浓度的生长激素释放肽激动剂的方法，其特征在于向所述患者施用治疗有效量的作为生长激素释放肽激动剂的化合物A。

如本文所用，术语“药学上可接受的”是指可用于制备通常安全，无毒且不在生物学上或其他方面有不期望的影响的药物组合物，并且包括兽医用以及人用药学上可接受的那些。

化合物A，即3-(1-(2,3-二氯-4-甲氧基苯基)乙基)-1-甲基-1-(1,3,3-三甲基-哌啶-4-基)脲一盐酸盐是一个新的化合物；相应的游离碱在专利申请WO2012/116176中描述。因此，本发明包括化合物A本身，其在医学中的用途以及包含它的药物组合物；本发明还包括制备化合物A的方法，其特征在于其游离碱与盐酸反应，如实施例部分所示。

如实施例部分进一步所示的，化合物A具有令人感兴趣的纯度，稳定性和溶解性，这使其特别适合于在不同制造条件下以多种药物形式配制，且没有纯度和效价的明显下降。因此，本发明扩展到晶体形式的化合物A，特别是具有图9所示的XRDP峰图案的特定晶体形式。同样由于这些性质，化合物A可以根据所选药物治疗的需要以任何药物形式自由地配制。优选适合全身给药的形式。例如，可以将其配制成片剂，丸剂，胶囊剂，微胶囊，颗粒剂，微颗粒剂，丸粒剂，微丸剂，粉剂，冻干粉剂，溶液剂，混悬剂或乳剂，凝胶剂，乳膏剂，经皮或透皮给药系统等。

基于游离碱的重量，化合物A优选以约0.03mg至约10mg，优选约0.1mg至约2mg的剂量给药。对于一般的成年患者，这些剂量是每日剂量。它们可以根据疾病的严重程度，特定的患者状况，选择的特定给药途径等进行更改和/或调整。

化合物A的给药途径是全身性的：由于其具有血脑屏障穿透能力，为了靶向中枢神经系统，不必将其直接注射到中枢神经系统或大脑中。实际上，药物通过一种常规的全身性给药途径例如全身给药途径达到全身循环就足够了，如口服，经口，经口腔，吸入，直肠等。一旦在血液中循环后，化合物A被中枢神经系统的内皮细胞吸收，并从中以活性形式释放到中枢神经系统中。因此，有可能治疗由生长素释放肽受体介导的中枢神经系统疾病，该途径无需回溯到直接进入中枢神经系统的侵入性给药途径(例如鞘内、脊柱内等)。具有优势的，根据本发明，可以避开直接进入中枢神经系统的侵入性给药途径。因此，本发明预期的施用方法也可以表征为：“在中枢神经系统周围”或“在中枢神经系统外部”。

可以开发利用本发明化合物A的各种药物组合物。该组合物可以适合于通过任何合适的途径给药，例如以液体或固体形式的口服、肠胃外或静脉内给药。优选的给药途径是注射和/或口服。这些组合物通常将包含惰性稀释剂或可食用赋形剂。它们可以装在明胶胶囊中(用于口服)或压制成片剂(用于口服或颊用)或配制成锭剂(用于颊用)。为了这些目的，可以将活性化合物与赋形剂结合并以片剂，锭剂或胶囊的形式使用。药学上相容的粘合剂和/或佐剂材料可以作为组合物的一部分包括在内。

片剂，丸剂，胶囊剂，锭剂等可包含以下任何成分或类似性质的化合物：粘合剂，如微晶纤维素，黄芪胶或明胶；赋形剂，例如淀粉或乳糖；崩解剂，例如藻酸，Primogel或玉米淀粉；润滑剂，例如硬脂酸镁；滑爽剂，例如胶体二氧化硅；甜味剂，例如蔗糖或糖精；或调味剂，例如薄荷，水杨酸甲酯或橙味调味剂。当剂量单位形式是胶囊时，除上述类型的材料外，它还可以包含液体载体，例如脂肪油。另外，剂量单位形式可以包含改变剂量单位的物理形式的各种其他材料，例如糖、紫胶或其他肠溶衣的图层。

所述化合物可以作为酏剂，悬浮液，糖浆，薄片，口腔崩解膜，口腔崩解片剂，咀嚼胶糖的组分来施用。除了活性化合物之外，糖浆还可包含蔗糖作为甜味剂和某些防腐剂，染料，着色剂和调味剂。

用于注射的溶液或悬浮液可以包括以下成分：无菌稀释剂，例如注射用水，盐溶液，不挥发油，聚乙二醇，甘油，丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂，例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲液，例如乙酸盐，柠檬酸盐或磷酸盐，以及用于调节张力的试剂，例如氯化钠，甘露醇和葡萄糖。用于注射的制剂可以装入玻璃或塑料制成的安瓿瓶，一次性注射器或多剂量小瓶中。

接下来参考以下非限制性实施例来描述本发明。

实施例

实施例1

(3-(1-(2,3-二氯-4-甲氧基苯基)乙基)-1-甲基-1-(1,3,3-三甲基哌啶-4-基)脲单盐酸盐的合成与表征(化合物A)。

在22℃±3℃下，将先前通过WO2012/116176中所述的合成方法获得的1.63Kg(3-(1-(2,3-二氯-4-甲氧基苯基)乙基)-1-甲基-1-(1,3,3-三甲基哌啶-4-基)脲干燥产物溶于11.2Kg丙酮中。将溶液用1微米滤袋过滤，进行上光过滤，并用丙酮(1.6Kg)洗涤过滤器。保持内部温度为22℃±3℃，将4M(1.2Kg)的盐酸水溶液中加入过滤溶液中，将所得悬浮液在22℃±3℃搅拌至少2小时，然后通过离心并用丙酮(1.6Kg)洗涤分离出产物，得到1.5Kg湿产物。将湿产物在60℃±5℃下真空干燥至少18小时，得到1.4Kg(3-(1-(2,3-二氯-4-甲氧基苯基)乙基)-1-甲基-1-(1,3,3-三甲基哌啶-4-基)脲单盐酸盐(化合物A)，为白色至类白色结晶粉末。最低纯度(HPLC)98％。

化合物A的XRPD，¹H-NMR，¹³C-NMR表征见图9-11。

实施例2水溶性测试

化合物A在室温下在水中的溶解度约为33mg/mL。作为参考，相应的富马酸盐的溶解度仅为10mg/mL，相应的游离碱的溶解度远低于2mg/mL。

实施例3稳定性测试

通过HPLC分析化合物A的稳定性。在下表中，在湿储存过程中以及实验室规模的干燥过程中收集的数据。另外，对工业批次的干燥物料进行了为期3年的稳定性研究。

粗湿物料化合物A在2-8℃和室温下在空气中的稳定性：

根据结果，湿粉末在2-8℃下储存4周以上，我们没有观察到化合物A的任何降解。同样，在冰箱中放置36天后，在室温下保存24天的样品在HPLC中没有任何降解。

干燥的粗料化合物A在25℃/60％R.H.(relative humidity，相对湿度)下的稳定性：

根据结果，在干燥产品于25℃/60％R.H储存3年后，我们未观察到化合物A的任何降解。

干燥的粗制化合物A在60℃干燥期间的稳定性

根据结果，我们观察到该材料在60℃下干燥74小时期间是稳定的。

实施例4化合物A的ghrelin激动活性的评估

稳定表达人类GHSR1a受体的HEK293细胞用于FLIPR分析。将细胞使用标准程序维持处理。测试前一天，将细胞以1.5x10⁴/孔的密度接种在装有30μl DMEM完全培养基的包被的384孔板中，并在37℃的5％CO₂环境中孵育22-26小时。在测试当天，将4×负载染料(loading dye)添加到每个孔中(对于384孔板，每孔10μl)。将测定板在37℃黑暗条件下温育30分钟。然后300rpm离心30s除去染料。使用Platemate Matrix(低速设定，Thermo)将含1mM杀虫剂的40μl HBSS/Hepes一并加入。然后将板置于FLIPR Tetra(Molecular Device)中，并通过FLIPR添加5×工作浓度的激动剂。根据标准设置，在室温下用FLIPR检测荧光信号。

化合物A在FLIPR分析中显示出强大的激动剂活性，EC₅₀为1.25±0.42nM。

在另外的结合研究中，将化合物A溶解在DMSO中，并用水以不同的浓度范围稀释。由稳定表达人类GHSR1受体的BHK细胞制备的膜蛋白用于结合测定。将膜在分析缓冲液中稀释，以得到20μg/孔，每孔120μl。结合测定在96孔板中如下所述进行：120μl[¹²⁵I]Ghrelin(终浓度1nM)和15μl化合物A(10x)在测定缓冲液中稀释。将反应混合物在室温下温育30分钟，然后使用细胞收集器(Perkin Elmer)通过预先浸泡在0.3％PEI中的GF/B滤板快速过滤终止。将滤膜洗涤3次并在37°干燥过夜。用MicroBeta Trilux(Perkin Elmer)测量结合在滤膜上的放射性。化合物A在[¹²⁵I]Ghrelin结合试验中显示出对GHSR1 A受体的强亲和力，Ki值为1.42±0.35nM。

实施例5

化合物A的药代动力学研究和脑渗透评估

在对Sprague Dawley大鼠单次静脉注射10mg/kg化合物A后，该化合物迅速从全身循环中清除，并分布到组织和器官中。化合物A在血浆和脑中的生物分析通过LC-MS-MS方法进行，药代动力学分析通过标准的非房室方法进行。在该测试中，发现在以10mg/kg的量给药后1、2和8小时在大脑中测量的化合物A的浓度比血浆中的浓度高1.5到1.9倍，且两条曲线均与血浆中的相应浓度曲线平行衰减。图12显示对雄性Sprague Dawley大鼠单次静脉注射10mg/kg化合物A后，血浆(ng/mL)和脑(ng/g)中化合物A的平均浓度变化。有趣的是，脑中较高浓度的化合物A与血浆浓度平行衰减：这表明该化合物尽管具有较高的大脑亲和力，但不会在其中蓄积，从而避免了局部脑毒性的风险。

详细地，在以3、10和30mg/kg的剂量单次口服给药后，化合物A的生物利用度高并且超过80％。在单次静脉内和口服给药后，化合物A的暴露量随所测剂量范围内的剂量而增加。口服或静脉内给予化合物A的大鼠的药代动力学数据摘要报告如下：

在进一步的研究中，将化合物A的药代动力学与先前在专利申请WO2012/116176中描述的两种参考化合物的药代动力学进行了比较。获得的数据如下：

参考1

参考2

化合物A(发明)

以上数据表明，静脉内给药2小时后，所测试的参考化合物未能在脑中达到具有治疗意义的浓度。相比之下，化合物A的浓度提高了2倍或3倍(172ng/g)。特别有趣的是脑/血比，与血液中剩余的分数相比，表明了给药剂量是如何选择性地定向穿过整个血脑屏障并在大脑中累积的：两种参考化合物仅显示0.1/0.3脑/血比，显示出较差的脑渗透性，给药剂量基本上保留在血液中。相比之下，化合物A的脑/血比为1.4：化合物A与脑室的亲和力更强，因此在全身性给药后仅2小时，在大脑中发现了很大一部分给药剂量；脑吸收尚未完全，这使药物在外周水平上可以部分显示有用的活性。这在神经系统疾病中特别有用，该神经系统疾病除了在中枢神经系统CNS级别受到损害外，还涉及周围神经变性，并需要在此级别进行修复。不受理论的束缚，似乎化合物A的高脑渗透性可能是由于其不作为P-gp底物的能力，P-gp是防止分子通过血屏障的外排泵系统。

下表列出了其他药代动力学数据：

化合物A-急性和慢性给药后的药代动力学

*终端消除的相关系数<0.9时NR(未报告)

SN＝坐骨神经；DRG＝背根神经节

实施例6

化合物A对动物体内神经毒性模型的影响

药物和制剂

制备化合物A在0.5％羧甲基纤维素溶液中的悬浮液，对大鼠和小鼠的给药量分别为1和10mL/kg，并以3、10或30mg/kg口服给药。将顺铂在生理盐水中以0.5mg/kg进行腹腔注射给药(1mL/kg)。奥沙利铂在5％葡萄糖溶液中配制浓度为0.6mg/mL并腹腔注射(10mL/kg)。硼替佐米在10％Tween 80、10％EtOH 100％和80％盐水溶液中制备，浓度为0.2mg/kg，并进行静脉注射(1mL/kg)。在每个给药日制备新鲜的所有剂量溶液。

顺铂研究

实验开始时将五十只体重为250-300g的雄性Wistar大鼠随机分为5组，每组10只。第1组每天接受化合物A赋形剂(口服)6天，顺铂赋形剂(腹腔注射)3天。第2组接受化合物A赋形剂(口服)和0.5mg/kg顺铂(腹腔注射)3天，随后再接受化合物A赋形剂3天。第3组每天接受3mg/kg化合物A(口服)和0.5mg/kg顺铂(腹腔注射)3天，然后再接受3mg/kg化合物A 3天。第4组接受10mg/kg化合物A(口服)和0.5mg/kg顺铂(腹腔注射)3天，然后再接受10mg/kg化合物A 3天。第5组每天接受30mg/kg化合物A(口服)和0.5mg/kg顺铂(腹腔注射)3天，然后再接受30mg/kg化合物A 3天。在每种情况下，在化合物A或化合物A赋形剂之后30分钟给予顺铂或顺铂赋形剂，其在von Frey细丝测试前1小时给予。从开始给药前每天测量个体体重和24小时食物摄入量。

奥沙利铂研究

实验开始时使用60只体重20-25g的雌性Balb/C小鼠，分为4组，每组15只。第1组每天在奥沙利铂赋形剂给药(腹腔注射)之前60-90分钟接受一次化合物A赋形剂(口服)，每周两次，共4周。第2组在6mg/kg的奥沙利铂赋形剂给药(腹腔注射)之前60-90分钟接受一次化合物A赋形剂(口服)，每周两次，持续4周。第3组每天接受6mg/kg奥沙利铂(腹腔注射)60-90分钟前，接受10mg/kg化合物A(口服)，每周两次，持续4周。第4组每天在接受6mg/kg奥沙利铂(腹腔注射)60-90分钟前，接受30mg/kg化合物A(口服)，每周两次，持续4周。每天在开始给药前立即测量体重。在最后一次奥沙利铂(或赋形剂)给药后24h和在最后一次化合物A(或赋形剂)给药后1h，进行神经传导速度(NCV)和电位振幅测量，此后收集血液、组织样本(DRG，坐骨神经[SN]和足垫)用于药代动力学和IENFD评估。

硼替佐米研究

预防范例：在实验开始时，将体重为200-225g的56只雌性Wistar大鼠随机分为5个实验组。第1组不予处理(CTRL，n＝10)；第2组用硼替佐米处理，0.2mg/kg静脉注射，每周3次，共8周(BTZ，n＝10)；第3组用每周3次，共8周的硼替佐米0.2mg/kg静脉注射和每天的硼替佐米静脉注射90min前进行口服3mg/kg化合物A来联合治疗(BTZ+化合物A 3，n＝12)；第4组用每周3次，共8周的硼替佐米0.2mg/kg静脉注射和每天的硼替佐米静脉注射90min前进行口服10mg/kg化合物A来联合治疗(BTZ+化合物A 10，n＝12)；第5组用每周3次，共8周的硼替佐米0.2mg/kg静脉注射和每天的硼替佐米静脉注射90min前进行口服30mg/kg化合物A来联合治疗(BTZ+化合物A 30，n＝12)。在基线和治疗8周后，进行了尾神经和指神经传导以及电位幅度研究，行为测试(动态)和血液采集以研究蛋白酶体抑制作用。治疗8周后，收集组织样本(坐骨神经和尾神经，DRG和足垫)并进行分析，以研究形态学参数和表皮内神经纤维密度(IENFD)。

治疗范例：在实验开始时，将体重为200-225g的56只雌性Wistar大鼠随机分为5个实验组。第1组不予处理(CTRL，n＝10)；第2组用硼替佐米0.2mg/kg静脉注射治疗，每周3次，共8周(BTZ，n＝10)；第3组硼替佐米0.2mg/kg静脉注射，每周3次，4周，其后每周3次硼替佐米0.2mg/kg静脉注射和硼替佐米静脉注射90min前每天进行口服3mg/kg化合物A来联合治疗，进行4周(BTZ+化合物A 3，n＝12)；第4组硼替佐米0.2mg/kg静脉注射，每周3次，4周，其后进行每周三次硼替佐米0.2mg/kg静脉注射和硼替佐米静脉注射90min前每天进行口服10mg/kg化合物A来联合治疗，进行4周(BTZ+化合物A 10，n＝12)；第5组硼替佐米0.2mg/kg静脉注射，每周3次，4周，其后每周3次硼替佐米0.2mg/kg静脉注射和硼替佐米静脉注射90min前每天进行口服30mg/kg化合物A来联合治疗，，4周(BTZ+化合物A 30，n＝12)。在基线和治疗的8周后，进行了尾和指神经传导和电位振幅研究以及血液收集以研究蛋白酶体抑制作用。硼替佐米治疗4周和5周后进行行为测试(动态)。治疗8周后，从所有动物中收集坐骨神经、尾神经、DRG和足垫，并进行分析以研究形态学参数和IENFD。

评估

冯·弗雷测试

在顺铂研究中，在实验开始前几天将大鼠单独饲养并使其适应处理并适应VonFrey测试设备。在给药前获得基线测量值。按照先前描述的程序进行行为测试(28)。每个细丝被测试5次，并且测试持续直到记录了对特定细丝的3次退出响应。

动态麻醉仪测试

在硼替佐米研究中，使用动态麻醉仪测试(型号37450，Ugo Basile BiologicalInstruments，Comerio，意大利)评估了机械伤害感受性阈值。每2分钟对每侧的机械阈值轮流进行3次评估，以得出平均值。结果代表了动物所能承受的最大压力。

神经传导研究(NCS)

如先前在小鼠(29)和大鼠(30)中所述，确定了尾神经和指神经的NCV和电位振幅测量值。在给药之前进行基线NCS测量。然后将动物随机分配到具有相似平均NCS值的研究治疗组之一。在抗肿瘤药物给药完成后24小时和最后一次化合物A给药后1小时再次进行NCS测量。在所有记录期间，将动物用2％异氟烷麻醉，并俯卧在温暖的加热垫上，并监测直肠温度并将其保持在37.0-41.0℃之间。在增加电压的情况下，对每个神经节段进行至少3次刺激，最多进行6次刺激，直到达到最大反应为止。从刺激发作，以及从基线起的电位振幅对潜伏期进行评分。

DRG和坐骨神经形态

在奥沙利铂和硼替佐米实验结束时，在深度麻醉下处死动物。从5只/组动物中解剖出SN片段以及L5和L6 DRG，并包埋以进行分析，方法如前所述(31)。

IENFD分析

IENFD分析是针对如前所述(31)收集和处理的标本进行的。每次活检分为四个部分。以盲法对表皮内未髓鞘的轴突进行计数，并如前所述确定穿过真皮/表皮连接处的每毫米皮肤纤维的纤维密度。

统计分析

对于所有统计分析，均使用一或两种方差分析对数据进行比较，以比较均值组响应，然后使用Prism Graphpad软件版本4.03(GraphPad Inc，La Jolla，CA)进行Tukey或Dunnet事后比较，其显著性定义为p＜0.05。

结果

顺铂研究

食物摄入量和体重变化

与用赋形剂处理的大鼠相比，顺铂治疗引起每日食物摄入量和体重的显著降低(p<0.05，图1A，1B)。与单独使用顺铂相比，以3、10和30mg/kg的剂量进行化合物A治疗可增加总体食物摄入量和体重(p<0.05)。

异常性疼痛

与赋形剂治疗的大鼠相比，顺铂治疗降低了大鼠的爪退缩阈值(p<0.01)，表明机械性超敏反应的发展。用10和30mg/kg的化合物A进行预处理可显著减轻这种痛觉过敏。在第3天到第5天，与赋形剂治疗的大鼠相比，以30mg/kg的剂量进行化合物A治疗实际上导致总体上爪退缩阈值显著提高(p<0.05)。3mg/kg的化合物A对顺铂诱导的痛觉过敏没有明显影响。

奥沙利铂研究

体重变化

与赋形剂治疗的小鼠相比，奥沙利铂治疗的小鼠从第10天到研究结束显示出明显的体重减轻(p<0.01)。与奥沙利铂治疗的小鼠相比，与奥沙利铂和10或30mg/kg化合物A共同治疗的动物显示出更少的体重减轻(p<0.01)。该效果在多个测试日达到统计学显著性(p<0.05)，其中10mg/kg的化合物A具有最强的效果(数据未显示)。

神经传导研究

与赋形剂治疗的小鼠相比，奥沙利铂的给药引起了指状和尾部NCV的显著降低(分别降低了10.6±1.6％和8±1.1％，p<0.01)。用10mg/kg和30mg/kg的化合物A同时治疗可显著预防这两种损伤(图2A，2C)。奥沙利铂(13.5+/-6.4％)也降低了数字电位幅度，尽管给定了可变性，但其影响并未达到统计学意义。化合物A的治疗趋向于使电位振幅降低正常化，因此与奥沙利铂治疗的小鼠相比，在30mg/kg时，数字电位振幅显著改善(提高了33+/-9％；p<0.01；图2B)。奥沙利铂治疗对尾神经电位幅度没有显著影响(图2D)。

病理检查

在用奥沙利铂处理的小鼠的DRG神经元细胞体或卫星细胞或坐骨神经中未观察到变性的变化，并且化合物A处理本身并未引起任何变性的变化(数据未显示)。

在足垫中，奥沙利铂治疗可显著降低IENFD(-31.7+3.5％，与赋形剂治疗的小鼠相比，p<0.01)。并行化合物A处理将IENFD完全标准化为10和30mg/kg的赋形剂处理的小鼠值(p<0.01；图3A)。

急性和慢性给药后的化合物A药代动力学

化合物A表现出非常高的有剂量依赖的坐骨神经和DRG暴露。在单次口服剂量为10和30mg/kg之后，化合物A易于吸收并分布在血浆和神经组织中，峰值浓度在给药后0.25-0.5小时内。化合物A在血浆中的终末半衰期很短(约1h)，但在坐骨神经中则明显更长(约4.7h)。浓度-时间曲线下的外推至无穷大(AUC_0-∞)的区域在血浆中最低，在坐骨神经和DRG中几乎高出3-4倍，并且与给药剂量相关，这表明化合物A透入周围神经系统的能力增强(表1，图4A-B)。在每天给药的30天后，化合物A的组织渗透指数(组织/血浆比率)进一步提高至SN的约9-12倍和DRG的18-19倍，表明化合物A在这些组织中明显积聚(表1和图4C)。

硼替佐米研究

体重变化

在预防性研究中，在头几周至第21天，与硼替佐米和不同剂量的化合物A联合治疗的动物在几个时间点的体重均明显高于CTRL和硼替佐米组。然而，这种差异在治疗结束时并不明显(数据未显示)。

在治疗性研究中，硼替佐米与化合物A共同治疗10天后，与CTRL和硼替佐米组相比，动物的体重显著增加。在治疗结束时，仅用BTZ+化合物A 30治疗的动物相对于CTRL和硼替佐米组显示出体重的显著增加(p<0.01，数据未显示)。

机械阈值

在两项硼替佐米研究中，抗肿瘤药的使用均降低了机械阈值。在预防性治疗的治疗结束时，用硼替佐米与化合物A联合治疗的组与CTRL相比没有显示出异常性疼痛，而在硼替佐米组中观察到了这一现象(p<0.001，图5A)。

在治疗性研究中(图5B)，在4周后，所有接受硼替佐米治疗的组与CTRL相比均显示出潜伏期缩短的异常性疼痛的发生，直至撤回(p<0.001 vs CTRL)。5周(即BTZ+化合物A联合治疗1周)后和治疗结束时，与CTRL相比，仅单独使用硼替佐米治疗的组有痛觉过敏，而所有与化合物A联合治疗的组均受到保护(p<0.001)。

神经传导研究

在预防性研究数字NCV中，单独使用硼替佐米或与化合物A 3和10mg/kg组合治疗的组显示出统计学上的显著降低(p<0.01 vs CTRL)，而与BTZ+化合物A 30共同治疗的组相对于CTRL无变化(图6A)。在治疗结束时，所有组相对于CTRL均未观察到数字电位振幅的变化(图6B)。

在预防性研究中，单独使用硼替佐米或与所有剂量的化合物A组合治疗的所有组均显示出尾部NCV(p<0.05)以及尾部电位振幅(p<0.01 vs CTRL，图6C，6D)的统计学显著降低。

在治疗性研究中，仅用硼替佐米治疗的动物中，指状神经NCV的减少有统计学意义(p<0.05vs.CTRL，图6E)，而在最高剂量化合物A联合用药的组中观察到潜在的振幅减少(p＜0.05 vs CTRL，图6F)。单独用硼替佐米或与所有剂量的化合物A组合治疗的所有组均显示出尾部NCV和电位幅度的统计学显著降低(p<0.001 vs CTRL，图6G，6H)。

病理检查

经硼替佐米治疗的小鼠偶有DRG感觉神经元变性和卫星细胞胞质空泡。在预防性研究中化合物A的共同给药对这些改变产生了不完全的保护。在坐骨神经中，在所有接受硼替佐米治疗的组中均出现轻度的轴突改变，并且不同剂量的化合物A共同给药不会改变这些改变。

在尾神经中，单独用硼替佐米治疗的动物的纤维密度降低，轴突和雪旺氏细胞变性，并且用硼替佐米和化合物A联合治疗的动物在不同剂量下显示出这些病理变化的轻度而非剂量依赖性降低。

当在治疗性研究中递送化合物A时，这些保护作用不存在。

与CTRL相比，硼替佐米的慢性治疗引起IENFD的统计学显著降低(p<0.001)。尽管观察到了抑制趋势，但所有剂量的化合物A均在预防剂中(图3B)显著阻止了由硼替佐米引起的IENFD降低，但在治疗环境中(图3C)则没有。

蛋白酶体抑制研究

硼替佐米的慢性治疗诱导了蛋白酶体活性的统计学显著抑制。在预防或治疗研究中，不同剂量化合物A的共同给药不会损害硼替佐米诱导的蛋白酶体抑制作用(数据未显示)。

下表列出了多种神经毒性模型中评估结果的摘要：

+化合物A对抗肿瘤药有显著作用；+/-化合物A对抗肿瘤药的部分有效；-化合物A对抗肿瘤药没有作用；＝抗肿瘤药没有作用

讨论

使用公认的急性和慢性临床前CIPN模型，我们测试了化合物A给药的效果。此外，在硼替佐米模型中，我们还证实没有干扰药物的抗肿瘤作用机制。这些动物模型已被广泛用于测试假定的神经保护治疗的有效性，从而为我们的研究提供了理论依据。

在所有测试条件下，我们始终观察到机械性异常性疼痛的减少。这些结果在硼替佐米模型中尤为重要，因为这是一种抗肿瘤药物，可诱导最痛苦，剂量限制的CIPN。正如顺铂研究的结果所示，在我们的研究中观察到的抗伤害感受作用非常迅速，并且由于化合物A对脑的高度透性，它可能是集中介导的。

但是，使用长期给药获得的结果表明，化合物A还具有一定的营养性外围作用，因为在奥沙利铂和硼替佐米模型中，化合物A均可有效防止药物引起的IENFD降低。值得注意的是，在治疗性研究中，异常性疼痛的减少仍然很明显，但与IENFD没有任何关系，因此进一步支持了中央镇痛作用与周围神经保护作用分离的假说，只有在小纤维萎缩之前开始化合物A治疗，后者才能够出现。

除此作用外，化合物A减轻了由慢性多次给药奥沙利铂引起的一些神经生理缺陷，，并在较小程度上也减轻了硼替佐米引起的一些神经生理缺陷，这支持了化合物A在神经系统感觉神经元外周分支的髓鞘纤维的附加活性。实际上，这种直接在周围神经中测量并主要反映大有髓纤维活动的神经生理学明显作用不能归因于中枢事件，而可能是由于保留了周围轴突的响应数目。

对化合物A钟形的剂量反应，也观察到10mg/kg。

化合物A穿透CNS的显著能力，以及其周围神经营养活性，非药物特异性活性以及可能用于治疗癌症恶病质的用途，使得化合物A在经历神经毒性诱导化疗的癌症患者中成为独特的神经保护剂。

实施例7

化合物A对人类志愿者心血管的作用(第1阶段研究)

该研究是作为一项单中心，随机，双盲，安慰剂对照的1期研究进行的，健康男性受试者接受单次递增剂量的化合物A口服治疗。认为剂量递增设计适合研究这种新化合物在人类的第一个单剂量的安全性和耐受性。在每个队列中，六名受试者在第1天接受单次口服剂量的化合物A，两名受试者接受安慰剂。

人群批次1:10mg化合物A

人群批次2:0.1mg化合物A

人群批次3:0.3mg化合物A

人群批次4:1.0mg化合物A

每个受试者以随机方式接受单次口服剂量的化合物A或安慰剂。在第1天的早晨进行研究药物的施用。研究药物的适当施用由研究者或代表监督。这包括检查口腔和颊腔。研究药物或安慰剂以含粉末的明胶胶囊形式提供；他们与240毫升水一起口服。受试者以经禁食的状态给药(给药前至少8小时未进食)。直到给药后4小时，才解除禁食限制。

在给药前1天(第-1天)和给药后第1天至给药后72小时记录12导联心电图。此外，从计划给药前至少约12小时到给药后24小时为止，均记录Holter-ECG。取纸质心电图时，在相同的时间点取三份样本(间隔1分钟)。在第-1天测量生命体征(血压，脉搏频率，体温[耳廓测量])，然后在给药前第1天至给药后72小时进行测量。使用ECG系统(Marquette Hellige)在研究流程图中按计划记录了12导联ECG。在给药后36、48和72小时记录一式三份的ECG。静坐至少5分钟或静坐至少15分钟后，在从Holter-ECG提取ECG的时间点上，在仰卧位置记录ECG(以留出足够的时间)。以50mm/s的纸速和10mm/mV的幅度的纸速绘制ECG，所有导线的记录时间为10秒，每根导线至少3个波，但最好5个波。评估了以下ECG参数：心率，PR间隔，QRS间隔，QT间隔，QTcB(使用Bazett校正公式)和QTcF(使用Fridericia校正公式)。

治疗组之间给药后平均收缩压和舒张压和体温均无临床相关变化或存在差异。对于用化合物A处理的组，观察到脉搏率降低。

图7和8显示了获得的结果。他们显示出明显的剂量相关心率降低，在给药后1至3小时达到最大。在服用0.1、0.3、1.0和10mg化合物A后的1至3个小时，平均心率(Holter-ECG数据，取三重读数平均值的平均值)最大降低了5.1bpm，6.8bpm，15.9bpm和18.3bpm，相比之下，安慰剂给药后最大下降为6.9bpm。给药后6小时再次达到给药前水平。在1.0和10mg剂量组中观察到最低的心率值。

引文

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Claims (4)

1.化合物3-(1-(2,3-二氯-4-甲氧基苯基)乙基)-1-甲基-1-(1,3,3-三甲基哌啶-4-基)脲一盐酸盐在制备用于治疗神经疼痛的药物中的用途。

2.如权利要求1的用途，其中以游离碱表示的所述化合物的剂量为0.03至10mg。

3.如权利要求1或2的用途，其中所述化合物从外部施用于中枢神经系统。

4.如权利要求3的用途，其中所述化合物通过选自以下的途径给药：口服，经口，经颊，舌下，经眼，经皮，由皮，静脉内，肌内，吸入或直肠。