CN111867565A - 使用耐受颗粒治疗乳糜泻 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及用于使用耐受免疫修饰颗粒来治疗乳糜泻的方法，所述耐受免疫修饰颗粒包封来自麦醇溶蛋白或其他相关蛋白的抗原物质。

Description

使用耐受颗粒治疗乳糜泻
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年2月8日提交的美国临时专利申请号62/628,233的优先权权益，所述申请以引用的方式整体并入本文。
技术领域
本公开涉及使用耐受免疫修饰颗粒来治疗乳糜泻的方法，所述耐受免疫修饰颗粒包封来自麦醇溶蛋白或其他相关蛋白的抗原物质。
通过引用并入以电子形式提交的材料
本申请包含计算机可读形式的序列表(文件名：52341_Seqlisting.txt；6,713字节；2019年2月8日创建)作为公开的单独部分，其以引用的方式整体并入。
背景技术
乳糜泻(CD)是一种常见的免疫病症，在欧洲血统的人群中估计患病率为0.3％至2.4％(Fasano 2012)。该疾病由于对膳食谷醇溶蛋白(主要是麦醇溶蛋白)的异常T细胞应答而在遗传易感受试者中发展，所述膳食谷醇溶蛋白在肠道内被组织转谷氨酰胺酶脱酰胺化。当脱酰胺化的麦醇溶蛋白特异性CD4+T细胞识别固有层中抗原呈递细胞(APC)上的人白细胞抗原(HLA)-DQ/8或HLA-DQ2呈递的其同源麦醇溶蛋白表位时，它们被激活并产生促炎性细胞因子，如干扰素-γ(IFN-γ)。这会触发炎症级联，导致CD活检结果所见的特征性隐窝增生和绒毛变平。在肠上皮中，麦醇溶蛋白还触发肠细胞局部产生白介素15(IL-15)。此IL-15增加上皮细胞上主要组织相容性复合体(MHC)I类表面抗原(如MHC I类多肽相关序列A)的表达，并且还增加上皮内T细胞(即CD8+αβT细胞和γδT细胞，天然杀伤[NK]细胞)上相应MHC受体(如NKG2D)的表达，导致上皮细胞破坏。(Fasano 2012；Green 2007；Leffler2017；Mazzarela 2008；Tack 2010)
T细胞活化引起的肠病产生通常在CD中观察到的慢性腹泻、腹胀/疼痛、便秘和其他胃肠道症状、肠通透性增加、吸收不良及隐匿性胃肠道出血。其他表现可能包括体重减轻、慢性疲劳、骨质疏松、难治性铁缺乏症、贫血、不育、儿童生长衰竭、关节炎、周围神经病变、疱疹样皮炎、麸质共济失调和恶性肿瘤(Farrell 2002；Fasano 2012；Fasano 2001；Green 2007；Leffler 2017)。在罕见病例中，CD患者(主要是儿童)会经历危及生命的代谢紧急事件，称为乳糜危象(celiac crisis)，其特征为继发于剧烈腹泻的低钾血症和酸中毒(Baranwal 2003，Farrell 2002；Fasano 2012)。
通过膳食改良来避免麸质，即“无麸质”饮食(GFD)是CD的唯一有效治疗方法，因为目前尚无药物能够可靠并安全地防止由于暴露于麸质而引起的粘膜损伤。虽然已显示GFD可以缓解疾病的许多症状，但严格依从性仍然很困难，并给乳糜泻患者的日常工作带来了额外负担。实际上，从饮食中完全消除麸质是不现实的，即使无意或少量重复摄入麸质也会阻止症状的完全恢复和肠道损伤的修复(Laurin 2002；Leffler 2017；Rubio-Tapia2013)。
国际专利公布WO 2010/060155公开了可能与乳糜泻有关的小麦蛋白的不同表位，并且描述了所有麸质蛋白在乳糜泻中都被认为是有毒的。在2006年，NCBI公共数据库Genbank包括来自制面包小麦(普通小麦)、大麦(Hordein vulgare)和黑麦(Secalecerale)的麸质蛋白的345个条目。
已经设计了许多疗法来诱导自身免疫疾病中的免疫耐受。但是，这些治疗在临床试验中仅产生边际功效(Kaukinen 2014)。
发明内容
使T细胞耐受麸质的治疗方法可以潜在地治愈CD，从而消除与终生GFD相关的负担以及与如癌症等疾病相关的共病。
本文提供了一种治疗受试者的乳糜泻的方法，其包括向所述受试者施用包封一种或多种麦醇溶蛋白抗原表位(GLIA)的耐受免疫修饰颗粒(TIMP)，其中所述颗粒以0.1至10mg/kg的剂量施用。
本文还提供了一种用于降低受试者对麸质的敏感性的方法，其包括向所述受试者施用包封一种或多种麦醇溶蛋白抗原表位(GLIA)的耐受免疫修饰颗粒(TIMP)，其中所述颗粒以约0.1至约10mg/kg的剂量施用。在各种实施方案中，TIMP-GLIA以约0.1mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg、8.0mg/kg或10mg/kg的剂量施用。在各种实施方案中，TIMP-GLIA以约8.0mg、80mg、320mg、640mg或800mg的剂量施用。
在各种实施方案中，TIMP-GLIA以单剂量或多剂量施用。
在各种实施方案中，TIMP-GLIA通过静脉内、皮下、肌内、腹腔内或经口施用。
在各种实施方案中，TIMP-GLIA包含聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)。在各种实施方案中，TIMP-GLIA在表面上是羧基官能化的，即羧化PLGA。
在各种实施方案中，TIMP-GLIA具有负ζ电位。在各种实施方案中，ζ电位在-80与-30mV之间、或在-70mV与-30mV之间、或在-60mV与-35mV之间、或在-50与-40mV之间。
在各种实施方案中，TIMP-GLIA包含聚乳酸:聚乙醇酸的共聚物比率为约50:50的聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)。在具体实施方式中描述了其他预期的共聚物比率。
在各种实施方案中，粒度为100至1500nm、或100至1000nm、或300至1000nm、或400至800nm、或200至700nm。
在各种实施方案中，一种或多种GLIA抗原选自由麦醇溶蛋白、麦谷蛋白、大麦醇溶蛋白和黑麦醇溶蛋白(Secalin)或其抗原性片段或表位组成的群组。在具体实施方式中更详细地描述了可预期用于颗粒中的可诱导麸质敏感和乳糜泻的示例性抗原表位。
在各种实施方案中，受试者接受无麸质饮食。在各种实施方案中，受试者具有HLA-DQ2.5(HLA-DQA1*0501/B1*0201)或HLA-DQ8.1(DQA1*0301/B1*0302)的遗传图谱。在各种实施方案中，受试者患有难治性乳糜泻。
在各种实施方案中，TIMP-GLIA颗粒的施用改善了乳糜泻或麸质敏感的一种或多种体征或症状。示例性症状包括但不限于一种或多种选自由以下组成的群组的症状：体重减轻、疲劳、头痛、铁缺乏症、叶酸缺乏症、维生素D缺乏症、维生素B12缺乏症、绒毛萎缩、肠粘膜损伤和低骨密度。一种或多种症状包括主观症状，如绒毛萎缩、四聚体染色、ELISPOT、miRNA、外来体、RNA和DNA。在各种实施方案中，TIMP-GLIA在30分钟、1小时、2小时、3小时或更长时间内输注。
在各种实施方案中，TIMP-GLIA以递增速率输注。在各种实施方案中，在初始输注15分钟后，递增速率加倍。在各种实施方案中，在输注的第二个15分钟之后，递增速率加倍，例如，是初始输注速率的4倍。在一些实施方案中，在约2.5小时内输注TIMP-GLIA，在第一个15分钟内以约20mL/小时输注，在下一个15分钟内以40mL/小时输注，并且在输注期间以80mL/小时输注。
在各种实施方案中，与非递增剂量施用相比，TIMP-GLIA的剂量递增施用减少补体激活。
在各种实施方案中，TIMP-GLIA每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每两个月一次、每三个月一次、每六个月一次或每年一次施用。
在各种实施方案中，TIMP-GLIA还包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
在各种实施方案中，施用导致受试者中巨噬细胞或单核细胞的凋亡。在各种实施方案中，施用诱导免疫无能。
在各种实施方案中，TIMP-GLIA与第二药剂联合施用。
在各种实施方案中，TIMP-GLIA以加强剂量的形式施用。在各种实施方案中，在需要时施用加强剂量，如通过分析试验所测定，例如通过皮肤点刺试验或外周血单核细胞水平的测量。
附图说明
图1是示出了乳糜泻患者的剂量方案的示意图。
图2是示出了健康受试者的剂量方案的示意图。
图3是示出了乳糜泻患者或健康志愿者的替代剂量方案的示意图。
图4示出了谷氨酰胺γ-谷氨酰转移酶2蛋白的序列(SEQ ID NO:3)。
图5A-5B示出了将TIMP-GLIA施用于单个(图5A)和重复给药(图5B)组中受试者的更新示意图。
图6A-6F示出了A部分个体受试者随时间变化的血浆TIMP-GLIA浓度，按剂量绘制。
具体实施方式
本公开提供了一种使用耐受免疫修饰颗粒来治疗乳糜泻的给药方案，所述耐受免疫修饰颗粒包封与乳糜泻和麸质敏感性相关的抗原表位。
定义
如本文所用，“颗粒”是指任何非组织来源的物质组合物，其可以是球体或类球体实体、珠或脂质体。根据上下文，术语“颗粒”、术语“免疫修饰颗粒”、术语“载体颗粒”和术语“珠”可以互换使用。另外，术语“颗粒”可用于涵盖珠和球体。
如本文所用，“TIMP”是指与抗原偶联的耐受免疫修饰颗粒。在一些实施方案中，抗原附着于TIMP的表面。在其他实施方案中，抗原被包封在TIMP内。
如本文所用，“带负电的颗粒”是指经修饰以具有小于零的净表面电荷的颗粒。
“羧化颗粒”或“羧化珠”或“羧化球体”包括已被修饰为在其表面上含有羧基的任何颗粒。在一些实施方案中，羧基的添加增强了吞噬细胞/单核细胞从循环中对颗粒的摄取，例如通过与清道夫受体如MARCO的相互作用。可以使用任何添加羧基的化合物来实现颗粒的羧化，所述化合物包括但不限于聚(乙烯-马来酸酐)(PEMA)。
如本文所用，“抗原部分”是指被宿主的免疫系统识别的任何部分，例如肽。抗原部分的实例包括但不限于麦醇溶蛋白、麦醇溶蛋白表位和本文所公开的其他相关蛋白。
术语“表位”是指任何分子能够被一个或多个抗原结合区处的选择性结合因子识别并结合并且可以引起免疫反应的那部分。表位通常由分子的化学活性表面基团组成，如氨基酸或碳水化合物侧链，并且具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。如本文所用的表位可以是连续的或非连续的/不连续的。麦醇溶蛋白的示例性不连续表位描述于美国专利9,616,113的表3中。
“肽”或“寡肽”是短氨基酸序列，通常长度介于3与100个氨基酸残基之间，并且包括天然存在的氨基酸残基和非天然存在的残基类似物，其可以单独使用或与天然存在的氨基酸残基组合使用，以使肽具有特定的构象特异性或特定的生物活性，如对蛋白水解的抗性。肽包括肽序列的重复，并且可以包括2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个以头对尾或头对头排列的氨基酸序列拷贝。肽包括二聚体、三聚体或更高级多聚体，例如通过与其他聚合或非聚合部分如PEG缀合而形成。
“多肽”是更长的氨基酸序列，通常长度为100个或更多个氨基酸残基，并且包括天然存在的氨基酸残基和非天然存在的残基类似物，其可以单独使用或与天然存在的氨基酸残基组合使用，以使多肽具有特定的构象特异性或特定的生物活性，如对蛋白水解的抗性。
如本文所用，“裸珠”或“裸颗粒”或“裸球体”是指未羧化的珠、颗粒或球体。
如本文所用，“促炎介质”或“促炎多肽”是指在受试者中诱导、维持或延长炎症的多肽或其片段。促炎介质的实例包括但不限于细胞因子和趋化因子。
如本文所用，术语“炎性单核细胞”是指表达CD14/CD26和CCR2的任何组合的任何髓样细胞。
如本文所用，术语“抑制性中性粒细胞”是指中性粒细胞和/或单核细胞衍生的抑制细胞。
如本文所用，术语“Th细胞”或“辅助T细胞”是指CD4+细胞。CD4+细胞通过免疫过程协助其他白细胞，包括使B细胞成熟为浆细胞和记忆B细胞，以及激活细胞毒性T细胞和巨噬细胞。T细胞在通过抗原呈递细胞(APC)的表面上表达的MHC II类分子与肽抗原一起呈递时被激活。
如本文所用，术语“Th1细胞”是指产生促炎介质的Th细胞的子集。Th1细胞分泌细胞因子以促进免疫应答并且部分通过介导中性粒细胞和巨噬细胞向受感染组织的募集而在宿主对抗病原体的防御中发挥作用。Th1细胞分泌包括IFN-γ、IL2、IL-10和TNFα/β的细胞因子，以协调对细胞内病原体如病毒和某些细菌的防御。
如本文所用，术语“Th2细胞”是指介导针对细胞外寄生虫、细菌、变应原和毒素的抗体介导的免疫应答的激活和维持的Th细胞的子集。Th2细胞通过产生各种细胞因子如IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-13和IL-17E(IL-25)来介导这些功能，这些细胞因子负责抗体产生、嗜酸性粒细胞激活和几种巨噬细胞功能的抑制，由此提供不依赖吞噬细胞的保护应答。
如本文所用，术语“Th17细胞”是指Th细胞的子集。Th17细胞分泌细胞因子以促进免疫应答，并通过介导中性粒细胞和巨噬细胞向感染组织的募集而在宿主对抗病原体的防御中发挥作用。TH17细胞分泌如IL-17、IL-21、IL-22、IL-24、IL-26和TNFα的细胞因子，以协调对包括真菌和细菌的细胞外病原体的防御。
术语“治疗有效量”在本文中用于表示有效改善或减轻所治疗疾病的症状或体征的本公开的靶标特异性组合物的量。
术语“乳糜泻”是指小肠的慢性炎性疾病。该疾病包括以不同程度的麸质敏感为特征的一系列病状，包括以扁平小肠粘膜(增生性绒毛萎缩)为特征的严重形式和以以下较轻症状为特征的其他形式，包括疲劳、慢性腹泻、营养吸收不良、体重减轻、腹胀、贫血以及发生骨质疏松症和肠道恶性肿瘤(淋巴瘤和癌)的风险显著增加。
术语“对麸质敏感”或“麸质敏感”是指其中暴露于麸质或其肽片段的受试者表现出乳糜泻的任何一种或多种症状或不当的T细胞应答的状态。在对麸质不敏感的受试者中，几乎没有或没有摄入麸质所引起的T细胞应答。相比之下，在对麸质敏感的受试者中，其摄入后对源自麸质的肽存在不当的CD4+T细胞介导的免疫应答。
耐受免疫修饰颗粒
在一些实施方案中，本公开提供了组合物的用途，所述组合物包含：偶联至或包封在具有负ζ电位的载体颗粒中的抗原。在一些实施方案中，颗粒的ζ电位为约-100mV至约0mV。在一些实施方案中，颗粒的ζ电位为约-80mV至约-30mV、约-70mV至约-30mV、约-60mV至约-35mV或约-50mV至约-40mV。在一些实施方案中，颗粒是具有约50:50、80:20至约100:0的聚乳酸:聚乙醇酸的摩尔比的共聚物。在一些实施方案中，颗粒是聚(乳酸-共-乙醇酸)颗粒。
在一些实施方案中，颗粒的平均直径为约0.1μm至约10μm。在一些实施方案中，颗粒的平均直径为0.2μm至约2μm。在一些实施方案中，颗粒的直径为约0.3μm至约5μm。在一些实施方案中，颗粒的直径为约0.5μm至约3μm。在一些实施方案中，颗粒的直径为约0.5μm至约1μm。在一些实施方案中，颗粒的直径为约100至1500nm、约100至10000nm、约300至1000nm、约400至800nm或约200至700nm。
制备适用于本公开方法中的TIMP的方法描述于WO 2017/112899和WO 2017/143346中，其以引用的方式并入。
为了将本文所述的颗粒施用于人或测试哺乳动物，优选将颗粒配制成包含一种或多种无菌的药学上可接受的载体的无菌组合物。短语“药学上或药理学上可接受的”是指当使用本领域众所周知的如下所述的途径施用时不产生过敏或其他不良反应的分子实体和组合物。“药学上可接受的载体”包括任何和所有临床上有用的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。
所述颗粒通过任何合适的方式施用，包括肠胃外、皮下、腹腔内、肺内和鼻内。肠胃外输注包括静脉内、动脉内、腹腔内、肌内、皮内或皮下施用。优选地，通过注射来给药，最优选地静脉内注射或皮下注射，部分取决于施用是短暂的还是长期的。考虑了其他施用方法，包括局部施用，特别是经皮、经粘膜、直肠、经口或局部施用，例如通过靠近所需部位放置的导管。
根据施用途径，包含本文的颗粒作为活性成分的本公开的药物组合物可以包含无菌的药学上可接受的载体或添加剂。这种载体或添加剂的实例包括水、药学上可接受的有机溶剂、胶原、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧基乙烯基聚合物、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、海藻酸钠、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉钠、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、黄原胶、阿拉伯胶、酪蛋白、明胶、琼脂、双甘油、甘油、丙二醇、聚乙二醇、凡士林、石蜡、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HSA)、甘露醇、山梨醇、乳糖、药学上可接受的表面活性剂等。取决于本发明的剂型，适当时，所使用的添加剂选自但不限于上述物质或其组合。对于溶液或乳液来说，适合的载体包括例如水或醇溶液/水溶液、乳液或混悬液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外媒介物可包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏油或不挥发性油。静脉内媒介物可包括各种添加剂、防腐剂或流体、营养物或电解质补充剂。多种水性载体是合适的，例如无菌磷酸盐缓冲盐水溶液、抑菌水、水、缓冲水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸等，并且可以包括用于增强稳定性的其他蛋白质，如白蛋白、脂蛋白、球蛋白等，其经受温和化学修饰等。
预期所述颗粒可以进一步包含表面活性剂。表面活性剂可以是阴离子的、阳离子的或非离子的。泊洛沙姆和泊洛沙明家族中的表面活性剂通常用于颗粒合成。可以使用的表面活性剂包括但不限于PEG、Tween-80、明胶、葡聚糖、普朗尼克L-63、PVA、甲基纤维素、卵磷脂、DMAB和PEMA。另外，生物可降解和生物相容的表面活性剂包括但不限于维生素E TPGS(D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯)。在某些实施方案中，使用两种表面活性剂。例如，如果颗粒是通过双乳液法产生，则两种表面活性剂可以包括用于第一乳液的疏水性表面活性剂和用于第二乳液的疏水性表面活性剂。
通过将具有所需纯度的多肽结合剂与任选的生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合来制备多肽结合剂的治疗制剂以用于储存(Remington's PharmaceuticalSciences第16版,Osol,A.编著(1980))，采用冻干制剂或水溶液形式。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所用剂量和浓度下对接受者是无毒的，且包括缓冲液，如磷酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；氯化苯甲烃铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，如钠；金属配合物(例如，锌-蛋白质配合物)。
TIMP-GLIA颗粒
致耐受性免疫修饰颗粒(TIMP)-麦醇溶蛋白(“TIMP-GLIA”)是首创的非免疫抑制剂，用于特异性灭活或耐受麦醇溶蛋白特异性T细胞，从而消除和/或逆转CD的潜在病理。TIMP-GLIA也可以被认为是非传染性疾病治疗疫苗或“反向疫苗”(Steinman 2010)。
TIMP-GLIA由在PLGA(聚(DL-丙交酯-共乙交酯))颗粒的带负电的聚合物基质内的麦醇溶蛋白提取药物物质构成。TIMP通过PLGA颗粒的天然吞噬作用(一种非炎性过程)递送麦醇溶蛋白抗原。假设颗粒的这种吞噬作用导致主要在脾脏和肝脏中的抗原呈递细胞(APC)对麦醇溶蛋白的抗原呈递。麦醇溶蛋白特异性T细胞变得无能，或缺失，或转换为T调节细胞，从而使免疫系统耐受麦醇溶蛋白抗原，并消除通常由麦醇溶蛋白特异性T细胞响应于麦醇溶蛋白而启动的有害免疫级联。TIMP-GLIA被设计并用于特异性地处理和消除驱动CD的T细胞应答。(Getts 2015)。
示例性麦醇溶蛋白抗原在美国专利9,616,113中公开。麦醇溶蛋白(蛋白质-谷氨酰胺γ-谷氨酰转移酶2)的不连续表位包括D151、E153、E154、E155、E158、D306、N308、N310；SEQ ID NO:1725D434、E435、E437、D438；E329；E153；R19、E153、M659；或C277、H335、D358。诱导麸质敏感的其他蛋白质或肽在WO 2010/060155中公开，如SEQ ID NO:631-1116中所示。例如，“麸质”或“麸质蛋白”涵盖小麦中的α(α)、β(β)、γ(γ)和ω(ω)麦醇溶蛋白及低分子量和高分子量(LMW和HMW)麦谷蛋白；大麦中的B、C和D大麦醇溶蛋白；黑麦中的β、γ和CO黑麦醇溶蛋白；以及任选的燕麦中的燕麦醇溶蛋白。“麸质肽”是衍生自或包含在一种或多种麸质蛋白中的肽。麦醇溶蛋白是指麸质的含水醇溶性部分，特别但非排他地是衍生自小麦例如普通小麦(Triticum aestivum)的麸质。麦谷蛋白是指麸质的含水醇不溶性部分，特别但非排他地是衍生自小麦例如普通小麦的麸质。大麦醇溶蛋白是指衍生自大麦(Hordeinvulgare)的麸质。黑麦醇溶蛋白是指衍生自黑麦(Secale cerale)的麸质。Avedin是指衍生自燕麦(Avena sativa)的麸质。示例性抗原序列在WO 2010/060155的SEQ ID NO:1至1116中列出。
在各种实施方案中，颗粒以约0.1至约10mg/kg的剂量施用。在各种实施方案中，TIMP-GLIA以约0.1mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg、8.0mg/kg或10mg/kg的剂量施用。在各种实施方案中，TIMP-GLIA以约8.0mg、80mg、320mg、640mg或800mg的剂量施用。还考虑了在所述剂量端点之内和之间的值。
脾脏和肝脏APC群体表达大量清道夫受体，它们在体内稳态期间每天在识别和循环垂死的白细胞、红细胞及其他碎片中起重要作用。APC的靶向和致耐受性刺激对于免疫耐受的诱导至关重要。重要的是，这些活动的发生不会触发炎症或破坏外周免疫耐受。TIMP已被设计来利用这种靶向途径。
体外研究表明，TIMP-GLIA不引起T细胞丝裂原活性。TIMP-GLIA不与T细胞受体(TCR)直接相互作用，也不通过结合T细胞、血小板和其他白细胞上表达的共刺激分子而引起T细胞激活。TIMP-GLIA通过抗原呈递细胞间接调节麦醇溶蛋白特异性T细胞。
先前使用单克隆抗体(即抗CD3、细胞毒性T淋巴细胞抗原4[CTLA-4])或小分子(雷帕霉素)尝试过的所有免疫耐受策略均未利用该途径。假设TIMP的作用机制取决于APC，特别是表达清道夫受体的脾边缘区巨噬细胞，如具有胶原结构的巨噬细胞受体(MARCO)以类似于清除凋亡碎片的方式对颗粒的摄取。使用颗粒或凋亡细胞的研究显示，治疗诱导脾脏中调节性细胞因子白介素-10(IL-10)和转化生长因子β(TGF-β)的产生，以及巨噬细胞上抑制性配体如程序性死亡1(PD-1)的上调。下游事件包括诱导T细胞无能和激活调节性T细胞。总体结果是消除促炎性T细胞活性、减少组织中白细胞的积聚及重要地疾病迹象的消失(Getts 2015)。
TIMP-GLIA颗粒的施用改善了乳糜泻或麸质敏感的一种或多种体征或症状。示例性症状包括但不限于一种或多种选自由以下组成的群组的症状：体重减轻、疲劳、头痛、铁缺乏症、叶酸缺乏症、维生素D缺乏症、维生素B12缺乏症、绒毛萎缩、肠粘膜损伤和低骨密度。参见，例如Woodward,Clin Exp Gastroenterol.2016；9:225-236。一种或多种症状包括主观症状，如绒毛萎缩、四聚体染色、ELISPOT、miRNA、外来体、RNA和DNA。
本公开考虑了通过调节Th1应答、Th2应答、Th17应答或这些应答的组合来调节耐受性。调节Th1应答包括改变例如干扰素-γ的表达。调节Th2应答包括改变例如IL-4、IL-5、IL-10和IL-13的任何组合的表达。典型地，Th2应答的增加(减少)将包括IL-4、IL-5、IL-10或IL-13中至少一种的表达的增加(减少)；更典型地，Th2应答的增加(减少)将包括IL-4、IL-5、IL-10或IL-13中至少两种的表达的增加，最典型地，Th2应答的增加(减少)将包括IL-4、IL-5、IL-10或IL-13中至少三种的增加，而理想地，Th2应答的增加(减少)将包括所有IL-4、IL-5、IL-10和IL-13的表达的增加(减少)。调节Th17包括改变例如TGF-β、IL-6、IL-21和IL-23的表达，以及影响IL-17、IL-21和IL-22的水平。
实施例
实施例1-TIMP-GLIA首次在人中给予的方案
先前在动物中进行的毒理学研究显示，在非GLP研究期间使用的TIMP-GLIA剂量为0、10、50、75、100和200mg/kg(HED：0、1.6、8、12、16和32mg/kg)，并在第1天和第8天静脉内施用，根据组织/血液采样要求，在第15天或第17天进行尸检。综上所述，在第1天和第8天静脉内施用时，TIMP-GLIA在10mg/kg下没有产生明显的毒理或病理作用。在>50mg/kg的剂量下，主要在肝脏和脾脏中观察到许多临床病理和微观组织病理学效应。在200mg/kg下，两只动物由于药物相关作用而被施以安乐死。
将经过上述产物纯化的TIMP-GLIA以0、4、10、50和75mg/kg(HED：0、0.64、1.6、8和12mg/kg)的剂量静脉内施用于大鼠(10只/性别/组)。输注发生在第1、8和15天，尸检在第16天进行。另外5只大鼠/性别/组接受了相同的给药方案，最后一次给药后有28天的恢复期，并在第43天进行尸检。在第1天和第8天向另外5只大鼠/性别/组给药，并在第11天施以安乐死以进行病理学研究，且在第1天和第8天向12只大鼠/性别/TIMP-GLIA组加6只/性别/对照组的组给药以测量TGLIA浓度随时间的变化，用于TK分析和细胞因子测量。最后一次抽血后，对TK/细胞因子组中的动物施以安乐死。
在整个研究过程中，所有动物均存活直至计划的尸检，并保持良好的健康状态。在研究过程中没有明显的异常临床发现，并且在体重、体重增加、食物消耗、眼科检查、身体检查、临床观察、功能观察组、体温和血清细胞因子水平上均未发现与药物相关的作用。对在第16天或第43天终止的各性别和剂量组的动物的尸检时获得的组织的显微镜评估结果没有表现出任何病理学上显著的发现。
本公开提供了一项1期、首次在人体中(FIH)的、2部分、多中心研究，以评估TIMP-GLIA在CD患者和健康受试者中的安全性、耐受性和PK。
A部分是一项交错给药的传统的、开放标签的、单次递增剂量(SAD)研究。A部分中的剂量递增和队列规模是基于I期研究的公认方法(Le Tourneau 2009,Rubinstein2003)。A部分包括加速滴定2+2和传统的3+3设计，其中每个群体(CD和健康受试者)中有快速剂量递增。
每个群体的连续队列将接受单一剂量的TIMP-GLIA。将根据各自的安全性数据对每个群体(CD或健康受试者)分别做出有关给药进展或终止的决定。
将合格的受试者(至少19名CD受试者和至少19名健康受试者)纳入递增剂量队列(对于2个剂量水平n＝2/队列，随后对于5个剂量水平n＝3/队列)。TIMP-GLIA将在第1天以单次静脉内输注进行施用。部分A中采用交错给药策略。
对于CD受试者，在向下一个受试者给药之前，至少将经过168小时(7天)。在向后续受试者给药之前，将评估给药后至少24小时获得的样品的不良事件(AE)、生命体征、脉搏血氧饱和度和心电图(ECG)和实验室数据(血清化学、凝血、血液学和尿液分析、细胞因子)。
对于健康受试者，在向下一个受试者给药之前，至少将经过48小时。这对应于受试者将从诊所出院的时间，条件是研究者认为不需要延长医疗监督。在向后续受试者给药之前，将评估给药后至少24小时获得的样品的不良事件(AE)、生命体征、脉搏血氧饱和度和心电图(ECG)和实验室数据(血清化学、凝血、血液学和尿液分析)。
CD受试者的研究调查期的持续时间长达91天(筛选长达28天+1个治疗日+第60天+/-3天的随访)。此外，在第60天门诊就诊之后(即第90天、第120天和第180天，全部+/-3天)需要由医疗保健从业者进行电话随访。在一个实施方案中，对于单剂量接受者，研究的持续时间可以长达73天(即，筛选期长达28天+研究期长达45天[第42天+/-3天])。
在另一个实施方案中，健康受试者的研究调查期的总持续时间为长达91天(筛选长达28天+1个治疗日+第60天+/-3天的随访)。
B部分将使用选自A部分的剂量水平遵循重复剂量设计。同意的受试者将在第-1天进入临床研究部门进行基线评估之前28天(第-28天至第-1天)内接受筛选。
B部分将是3名受试者的重复剂量研究，所述受试者将在第1天接受第一次输注，并在第8天接受第二次输注。B部分的剂量选择将基于出现的安全性和耐受性数据。在第二剂量后观察B部分中的第一名受试者至少48小时，然后向B部分中的其余受试者给药。对于CD受试者，在第二剂后将经过至少168小时(7天)，并且在向下一个受试者给药之前确认安全性。对于健康受试者，在第二剂后将经过至少48小时，并且在向下一个受试者给药之前确认安全性。
此后，可以在参与的临床站点中于同一天或多天向B部分中的受试者给药，以满足操作需要。如果B部分的3名受试者中有1名发生了剂量限制性毒性，安全委员会可以决定以相同的剂量招募另外3名受试者，以确认不明确的安全性或耐受性发现。根据出现的安全性数据，他们还可能建议以较低的剂量招募3名受试者的另一队列，以辨别重复给药的安全性概况。重复给药将为使用2剂量方案的安全和可耐受给药在未来的概念验证(POC)临床试验中进行研究提供支持。
B部分总剂量：CD受试者的研究调查期的总持续时间长达91天(筛选长达28天+2个治疗日，间隔7天+最后一剂后第60天+/-3天的随访)。此外，在第60天门诊就诊之后(即第90天，第120天，第180天，全部+/-3天)需要由医疗保健从业者进行电话随访。在一个实施方案中，对于重复剂量接受者，研究的总持续时间长达80天(即，筛选期长达28天+研究期长达52天[第49天+/-3天])。
B部分：健康受试者的研究调查期的总持续时间长达91天(筛选长达28天+2个治疗日，间隔7天+最后一剂后第60天+/-3天的随访)。
起始剂量：各自通过加速滴定1+1方案，在1名受试者中探索0.1mg/kg、然后0.5mg/kg的起始剂量。然后根据标准3+3递增方案，从1mg/kg的剂量开始向3名受试者的队列给药。当更可能观察到药理作用时，较大的队列使用1mg/kg。计划的剂量和基本原理列于下表1及图1和2中。
表1
Figure BDA0002622794360000161
NOAEL：未观察到不良反应水平
PAD：药理活性剂量
在替代的给药方案中，可以通过静脉内输注，以8mg、80mg、320mg、640mg或800mg向受试者(健康或乳糜泻)施用TIMP-GLIA(图3)。例如，对于80kg受试者，8.0mg起始水平大约等于0.1mg/kg。表2列出了在此水平下的剂量递增。
表2计划的剂量水平和基本原理
Figure BDA0002622794360000171
主要终点：安全性的特征在于AE的发生率、严重性和可逆性、身体检查结果、12导联ECG结果、通过脉搏血氧饱和度测定的动脉氧饱和度水平、生命体征、测量结果、抗麦醇溶蛋白抗体(即抗药物抗体)、常规临床实验室检查结果(血液学、血清化学、凝血、尿液分析)和专门的实验室检查结果(例如急性期细胞因子；其他血管/血栓标记物；通过胰蛋白酶激活肥大细胞；补体标记物、外周血T细胞增殖)，临床表现为出现过敏反应/类过敏反应/细胞因子释放综合征或IRR的全身症状。
对用于细胞因子测试(TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-4、IL-5、IFN-δ、IL-8、IL-10、GM-CSF、MIP1α、MIP1β、GROα、IFNα、分形素、IP-10、IL-1α、IL-1β、EGF和其他细胞因子)而抽取的样品进行分析。如果症状没有出现，除非医学监测人员、赞助者或安全委员会另有规定或在符合确定的样品稳定性所必需时，否则在试验结束时可以分析用于细胞因子测试的预定的给药前和给药后8小时至24小时的样品。如果在暴露于TIMP-GLIA测定后进行外周血T细胞响应于麦醇溶蛋白的离体刺激的增殖，则结果将在研究结束时报告，或由赞助者、医学监测人员或安全委员会另行指定。耐受性的特征是在没有剂量限制性毒性下而达到的剂量递增程度。
次要终点：TIMP-GLIA的PK将通过非房室分析从血浆TIMP-GLIA浓度-时间曲线推导出。主要的PK参数是最大观测浓度(Cmax)、最后可测量浓度(Clast)、最大观测浓度的时间(Tmax)以及从时间零到外推至无穷大的曲线下面积(AUCinf)和从时间零到最后可测量浓度的时间的浓度-时间曲线下面积(AUClast)。
如果可行，那么将推导出其他PK变量：终末消除半衰期(t1/2)、在给药间隔内的曲线下面积(AUCτ)、从时间零(给药时)到时间t的曲线下面积，其中基于观察到的数据(AUCt)确定相关t、总身体清除率(CL)、分布体积(Vd)和累积指数(Racc)。终末半衰期将计算为t1/2＝ln(2)/λz，其中λz是终末速率常数。λz将被估算为以浓度的自然对数为响应变量及时间为解释变量的线性回归的斜率。来自曲线的最后部分的有效观察结果(近似线性)将用于分析。
另外，该研究将在研究第14天、第30天(A部分)或第38天(B部分)和第60天评估针对TIMP-GLIA的循环抗麦醇溶蛋白抗体(即抗药物抗体)的滴度。
受试者：受试者患有表征如下的乳糜泻：
a.根据诊断时最新的专家指南，受试者具有活检证实的乳糜泻病史(肠道组织学显示绒毛萎缩)；以及
b.受试者对HLA-DQ2.5(HLA-DQA1*0501/B1*0201)或HLA-DQ8.1(DQA1*0301/B1*0302)呈阳性。HLA-DQ2.5(HLA-DQA1*0501/B1*0201)和HLA-DQ8.1(DQA1*0301/B1*0302)的表型分析是通过生物分析实验室进行的，并且如果之前没有做过或未知，可以在筛选访问时进行评估；
c.受试者在招募前约2个月没有已知的麸质暴露，并且愿意在研究期间维持无麸质饮食；
d.受试者具有在正常范围内的总免疫球蛋白A(IgA)滴度，或具有部分IgA缺乏症(约5％的乳糜泻患者)，其定义为在筛选时降低的血清IgA水平3-70mg/dL，并且受试者在筛选时具有阴性或弱阳性重组人转谷氨酰胺酶(tTG)特异性IgA滴度或对于具有选择性IgA缺乏症的受试者(约2％的乳糜泻患者)，脱酰胺化麦醇溶蛋白肽(DGP)特异性IgG滴度在筛选时是阴性或弱阳性的。总血清免疫球蛋白A(IgA)、组织转谷氨酰胺酶(tTG)特异性IgA抗体或脱酰胺化醇溶蛋白肽(DGP)特异性IgG抗体将在生物分析实验室进行测量。
健康受试者(n＝至少22)在筛选访问时是年龄18至65岁(含端点)的成年男性或女性。健康受试者在筛选访问时的体重指数(BMI)>16kg/m2，其中最小体重为33kg，最大体重为129kg(含端点)，(或者替代地，最小体重>45kg(99.0lb)，最大体重为121kg(266.2lb)，并且如果BMI<18(“体重过轻”)或>25(“体重过重”或“肥胖”)，否则在研究者看来是健康的。健康受试者也在研究标准所要求的临床实验室测试的指定范围内。
TIMP-GLIA：对于此项研究，TIMP-GLIA由在PLGA颗粒的带负电(-35mV至-50mV)的聚合物基质中的麦醇溶蛋白提取物构成，所述PLGA颗粒的平均尺寸为400nm至800nm，并且近似尺寸分布为约200nm至约700nm。每mg的PLGA颗粒含有约10μg精制的麦醇溶蛋白。
TIMP-GLIA以冻干粉末形式在一次性使用的20mL玻璃小瓶中供应，其含有约1mg精制的麦醇溶蛋白和100mg PLGA颗粒。TIMP-GLIA将用2.5mL无菌注射用水(SWI)重构，并进一步用0.9％氯化钠注射液USP稀释用于输注。在制备当天，使用受控输注装置通过静脉内输注来施用药物溶液。药房手册(Pharmacy Manual)中提供了具体的重构和稀释和储存说明书。将TIMP-GLIA小瓶在2℃至8℃(36℉至46℉)下储存，并在安全的温度受监控且限制进入的位置处避光。
给药和方案：最初，TIMP-GLIA通过受控输注装置以静脉内输注施用一次。计划的剂量范围如图1、图2和图3中所示。给药将在A部分的第1天和B部分的第1天和第8天进行(重复给药)(间隔7天)。例如，在A部分中，受试者以0.1mg/kg、0.5mg/kg和1mg/kg在单次静脉内输注中给药。在某些研究队列中，将各自通过加速滴定1+1方案在1名受试者中探索0.1mg/kg、然后0.5mg/kg的起始剂量。然后根据标准3+3递增方案，从1mg/kg的剂量开始向3名受试者的队列给药。对于3+3输注，可以以1.0mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg、6.0mg/kg或8.0mg/kg中的每个向3名受试者给药，并且如果有退出事件，可以将另外的1至3名受试者加入到组中。还可以根据此方案，使用图3所示的剂量向受试者给药。
作为安全预防措施，应在给药后24小时内保持静脉通路以供紧急使用。在给药日，受试者在开始输注前约2小时禁食食物和饮料后和输注结束后1小时，受试者将接受分配的研究药物。可以随意提供水。
在剂量水平下的所有受试者已完成第3天(给药后48小时)的研究程序后，通过安全委员会对当前队列的安全数据[不良事件(AE)、生命体征、12导联ECG、临床实验室测试]和来自先前队列的可用累积AE数据相对于停止规则的评估来确定剂量的总体安全性和耐受性。
剂量减少：根据出现的安全数据，安全委员会可推荐向1名受试者(加速滴定1+1，A部分)或3名受试者(标准3+3，A部分和B部分)的队列以低于计划水平的剂量给药，以便更好地鉴定TIMP-GLIA的最大耐受剂量。
通过外周放置的静脉内插管或通过在合适的前臂静脉中直接静脉穿刺来收集血液样品。将在禁食条件下并按照可接受的实验室程序/方案收集用于临床化学的样品。
分析方法
肥大细胞激活和补体激活以及补充血管/血栓评估：对过敏反应/类过敏反应或IRR的症状(例如，发热、恶心、畏寒、僵硬、低血压、心动过速、乏力、头痛、皮疹、咽喉发痒和呼吸困难)进行随访，进行其他实验室测试以检测肥大细胞激活(胰蛋白酶)、补体激活(C3a、C5a、CH50、C5-9)和血管/血栓标记物(D-二聚体、vWG、ICAM-1、纤维蛋白原、凝血酶原片段1,2和P-选择素)。从所有受试者获得给药前样品，如果临床上指示，需要时(prn)从有症状的受试者处获得另外的给药后样品。如果临床表现为过敏反应/类过敏反应或IRR，应立即分析样品并尽快将结果报告给研究者。
用于PBMC分离的全血：在给药前从所有受试者获得样品。如果临床上指示出现了过敏反应/类过敏反应/细胞因子释放综合征或IRR的症状，则需要时将收集额外的样品。如果临床上指示，将从全血样中分离出外周血单核细胞(PBMC)，以通过酶联免疫斑点(ELISpot)测定确定产生IFN-γ和IL-10的T细胞的数目和响应于离体麦醇溶蛋白刺激的T细胞增殖(通过确定的增殖测定)。仅在临床上有指示或由赞助者酌情决定并在试验结束时或符合确定的样品稳定性所必需时才对结果进行分析。
细胞因子分析：用于测定急性期细胞因子(TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-4、IL-5、IFN-δ、IL-8、IL-10、GM-CSF、MIP1α、MIP1β、GROα、IFNα、分形素、IP-10、IL-1α、IL-1β或其他细胞因子)的样品是在给药前和给药后24小时内(例如8小时和24小时)收集(对于所有受试者)。需要时从表现出过敏反应/类过敏反应/细胞因子释放综合征或IRR的全身症状如发热、恶心、畏寒、僵硬、低血压、心动过速、乏力、头痛、皮疹、咽喉发痒和呼吸困难的受试者中获得额外的样品。抗麦醇溶蛋白抗体(即，抗药物抗体)的测量和通过C1q结合的免疫复合物检测和血清中的Raji细胞测定将使用有效的方法在适当的生物分析实验室进行。例如，脱酰胺化麦醇溶蛋白肽(DGP)特异性IgG抗体将用作抗药物抗体测试。
实施例2
在人中首次给予TIMP-GLIA的安全性和耐受性评估
在本研究中，将以上实施例1中列出的进行研究的标准与下述变更一起使用。
对于纳入标准，患者在筛选访问时是年龄18至75岁(含端点)的成年男性或女性。受试者在筛选访问时的体重指数(BMI)>16kg/m2，其中最小体重为33kg，最大体重为129kg(含端点)，并且如果BMI<18(“体重过轻”)或>25(“体重过重”或“肥胖”)，否则在研究者看来是健康的。
不需要对CD患者进行基因分型，但是活检证实CD已足够。而且，受试者在筛选访问前至少10天没有已知的麸质暴露，并且在研究期间维持无麸质饮食。
研究：为了建立TIMP-GLIA在人中的安全性、耐受性和药代动力学(PK)，将23名经活检证实患有乳糜泻(CD)的受试者纳入一项2部分1期多中心研究中。研究的A部分评估了TIMP-GLIA的单次递增剂量；B部分评估了TIMP-GLIA的重复(第1天和第8天)递增剂量。在第1天/第1剂量的28天内筛选同意受试者的资格。受试者在给药前12小时和给药后48小时内被限制在临床研究单位内。在第180天之前，追踪所有受试者的安全性。通过身体检查、心电图、遥测术、脉搏血氧饱和度、生命体征、不良事件(AE)、血清化学、全血计数与鉴别、血清细胞因子和趋化因子、血浆补体水平、麦醇溶蛋白特异性T细胞增殖和细胞因子分泌、以及脱酰胺化麦醇溶蛋白肽(DGP)免疫球蛋白G(IgG)来评估安全性和耐受性。在给药前、30分钟、35分钟、输注结束、每次给药后1、4、12、24、48和144小时测量PK。在整个试验过程中，由独立的数据监测委员会监测安全性。
在研究的A部分中，向17名受试者施用单次静脉内(IV)剂量的TIMP-GLIA，其范围为0.5mg/kg至8mg/kg(图5A)。TIMP-GLIA在30分钟内输注，但有2名受试者以8mg/kg输注了约2.5小时。一旦在先前的受试者中证实了安全性和耐受性，便间隔至少7天向受试者给药。当在先前的剂量水平中证实了安全性和耐受性时，剂量逐步递增。
在研究的B部分中，在第1天和第8天，向6名受试者施用2个静脉内剂量的TIMP-GLIA，其范围为2至8mg/kg，最大为650mg(图5B)。TIMP-GLIA在约2.5小时内输注。当在先前的剂量水平中确认安全性和耐受性时，剂量逐步升高。
结果：
不良事件：在研究的A部分和B部分中对患者的评估揭示，TIMP-GLIA在高达8mg/kg的剂量下是安全且可耐受的。在研究的A部分期间，接受单次8mg/kg剂量的4名受试者中有2名经历了轻度至中度输注反应(IR)。第一名受试者在输注约5分钟时出现皮疹(2级)、收缩期低血压(2级)和浓度紊乱(1级)。研究人员中止了输注，症状在几分钟内消失。第二名受试者经历潮红(2级)、恶心(1级)、呕吐(1级)、背痛(1级)和视觉改变(1级)。研究人员中止了输注，并用苯海拉明治疗受试者。症状在几分钟内消失，且重新开始输注并完成输注，无进一步事件。
在回顾A部分的所有安全性数据后，数据监测委员会建议1)将TIMP-GLIA颗粒稀释在200mL生理盐水(最初为100mL)中，以及2)在约2.5小时内输注所述颗粒-前15分钟为20mL/小时，接下来15分钟为40mL/小时，然后在输注期间为80mL/小时。
在研究的B部分期间，在两次输注期间输注约10分钟时，接受4mg/kg的1名受试者(共2名)经历了轻度背痛。研究人员短暂中断了第一次输注，没有中断第二次输注。在接受重复剂量的TIMP-GLIA的其他5名受试者的任一者中，没有其他AE的报道。
在A部分或B部分的任何受试者中均未报告严重的AE(SAE)。除1例AE外，所有AE均≤2级(中度)；1名受试者报告了被研究人员视为与TIMP-GLIA不相关的3级(非乳糜泻)结肠炎。在≥2名受试者中观察到的最常见事件包括：潮红(n＝5，22％)、头痛(n＝4，17％)、背痛(n＝3，13％)、疲劳(n＝2，9％)、腹痛(n＝2、9％)和腹泻(n＝2、9％)。仅在单次剂量受试者中观察到潮红。A部分中的2名受试者经历了背痛(1名为4mg/kg，1名为8mg/kg)，相比之下，重复剂量组中为1名受试者(4mg/kg)。没有任何其他AE的趋势。
血清细胞因子和趋化因子：通过ELISA测量以下细胞因子和趋化因子的水平：EGF、分形素、GM-CSF、GROα、IFN-α、IFN-γ、IL-1α、IL-1β、IL-2可溶性受体、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-17、IP-10、MIP1α、MIP1β和TNF-α)。在给药前、每次给药后8和24小时、7和14天在A部分和B部分中取样。在每次给药后的14天内，任何血清细胞因子或趋化因子(包括炎性细胞因子)都没有临床上的显著变化。
麦醇溶蛋白特异性离体T细胞增殖和细胞因子释放：从A部分(仅4和8mg/kg剂量组)和B部分的患者中收集全血以分离外周血单核细胞(PBMC)。给药前和给药后7天收集全血。使用标准化和经过验证的测定法进行抗原特异性(在这种情况下为麦醇溶蛋白)离体T细胞增殖和细胞因子释放测定(IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-13、TNF-α)。简言之，将从每个受试者中分离的PBMC以100,000个细胞/孔的浓度铺在多孔测定板中，并用单独的培养基(阴性对照)、抗CD3(阳性对照)、CEFT MHC-II合并肽(阳性对照)或麦醇溶蛋白免疫显性肽(α麦醇溶蛋白-QLQPFPQPELPYPQPQS(SEQ ID NO:1)或ω麦醇溶蛋白-PFPQPEQPFPW(SEQ ID NO:2))刺激。孵育48-72小时后，收集培养上清液以使用Mesoscale Discovery(MSD)多重细胞因子平板进行细胞因子分析。使用Promega的
Figure BDA0002622794360000242
测定试剂，通过基于发光的测定来测量T细胞增殖。
在任何剂量组中均未观察到T细胞增殖或细胞因子水平的变化。下表3A-D显示了，B部分受试者按剂量组的T细胞增殖(表3A)和炎性细胞因子IFN-γ(表3B)、IL-4(表3C)和IL-6(表3D)相对于基线的变化。
表3A
Figure BDA0002622794360000241
表3B
Figure BDA0002622794360000251
表3C
Figure BDA0002622794360000252
Figure BDA0002622794360000261
表3D
Figure BDA0002622794360000262
补体激活：为了确定TIMP-GLIA施用对补体激活的影响，在给药前、输注15和30分钟时以及输注后24小时从研究的B部分的患者中收集血样。通过ELISA测量每个受试者的样品中补体C3a、C5a和SC5B-9的水平。表4A-C显示了补体标记物、剂量组和受试者的结果。
表4A
Figure BDA0002622794360000271
表4B
Figure BDA0002622794360000272
表4C
Figure BDA0002622794360000273
Figure BDA0002622794360000281
TIMP-GLIA PK：如上所述，对于A和B部分中的受试者，在下列时间点获得血浆样品以用于PK：给药前、30分钟、35分钟、输注结束、每次给药后1、4、12、24、48和144小时时的PK。个体受试者血浆TIMP-GLIA浓度随时间的变化(给药后经过的实际时间)将用于使用非房室分析推导PK参数：最大观测浓度(Cmax)、最后可测量浓度(Clast)、最大观测浓度的时间(Tmax)以及从时间零到外推至无穷大的曲线下面积(AUCinf)和从时间零到最后可测量浓度的时间的浓度-时间曲线下面积(AUClast)。通过血浆麦醇溶蛋白的水平所测量的个体受试者血浆TIMP-GLIA浓度随时间的变化并按剂量绘制在图6A-F中。
来自1期首次在人体中的多中心临床试验的数据表明，以0.1至8mg/kg的剂量静脉内施用的TIMP-GLIA通常是安全且耐受性良好的。报道的最常见AE是潮红、头痛、背痛、疲劳、腹痛(n＝2，9％)和腹泻。所有AE均为轻度至中度。如通过血清细胞因子和趋化因子没有增加，PBMC中麦醇溶蛋白特异性T细胞增殖和细胞因子分泌也没有增加所证明，没有免疫激活的证据。
接受单剂量的8mg/kg TIMP-GLIA的四名受试者中的两名经历轻度至中度输注反应。在接受重复剂量的TIMP-GLIA的受试者中未观察到输注反应(B部分)。但是，在输注15和30分钟时观察到补体水平(C3a和SC5b-9)的短暂增加，但在给药后24小时恢复到基线水平。受试者的血清细胞因子和趋化因子、麦醇溶蛋白特异性T细胞增殖或细胞因子分泌、C1q结合或DGP-IgG水平都没有增加，这表明该反应不是IgE介导的，而是补体激活相关的假过敏反应(CARPA)的结果。补体增加机制的研究正在进行中。如通过血浆麦醇溶蛋白水平所测量的TIMP-GLIA的PK似乎与剂量成比例，并且在施用24小时内恢复到基线水平。
对于本领域技术人员而言，如在上述示例性实施例中所阐述的本公开中的许多修改和变化是显而易见的。因此，仅应将所附权利要求书中出现的这种限制置于本公开中。
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序列表
<110> 库尔制药开发公司(COUR PHARMACEUTICALS DEVELOPMENT COMPANY INC.)
<120> 使用耐受颗粒治疗乳糜泻
<130> 32821/52341/PC
<150> US 62/628,233
<151> 2018-02-08
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 1
Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro Glu Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Gln
1 5 10 15
Ser
<210> 2
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 2
Pro Phe Pro Gln Pro Glu Gln Pro Phe Pro Trp
1 5 10
<210> 3
<211> 687
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 3
Met Ala Glu Glu Leu Val Leu Glu Arg Cys Asp Leu Glu Leu Glu Thr
1 5 10 15
Asn Gly Arg Asp His His Thr Ala Asp Leu Cys Arg Glu Lys Leu Val
20 25 30
Val Arg Arg Gly Gln Pro Phe Trp Leu Thr Leu His Phe Glu Gly Arg
35 40 45
Asn Tyr Glu Ala Ser Val Asp Ser Leu Thr Phe Ser Val Val Thr Gly
50 55 60
Pro Ala Pro Ser Gln Glu Ala Gly Thr Lys Ala Arg Phe Pro Leu Arg
65 70 75 80
Asp Ala Val Glu Glu Gly Asp Trp Thr Ala Thr Val Val Asp Gln Gln
85 90 95
Asp Cys Thr Leu Ser Leu Gln Leu Thr Thr Pro Ala Asn Ala Pro Ile
100 105 110
Gly Leu Tyr Arg Leu Ser Leu Glu Ala Ser Thr Gly Tyr Gln Gly Ser
115 120 125
Ser Phe Val Leu Gly His Phe Ile Leu Leu Phe Asn Ala Trp Cys Pro
130 135 140
Ala Asp Ala Val Tyr Leu Asp Ser Glu Glu Glu Arg Gln Glu Tyr Val
145 150 155 160
Leu Thr Gln Gln Gly Phe Ile Tyr Gln Gly Ser Ala Lys Phe Ile Lys
165 170 175
Asn Ile Pro Trp Asn Phe Gly Gln Phe Glu Asp Gly Ile Leu Asp Ile
180 185 190
Cys Leu Ile Leu Leu Asp Val Asn Pro Lys Phe Leu Lys Asn Ala Gly
195 200 205
Arg Asp Cys Ser Arg Arg Ser Ser Pro Val Tyr Val Gly Arg Val Val
210 215 220
Ser Gly Met Val Asn Cys Asn Asp Asp Gln Gly Val Leu Leu Gly Arg
225 230 235 240
Trp Asp Asn Asn Tyr Gly Asp Gly Val Ser Pro Met Ser Trp Ile Gly
245 250 255
Ser Val Asp Ile Leu Arg Arg Trp Lys Asn His Gly Cys Gln Arg Val
260 265 270
Lys Tyr Gly Gln Cys Trp Val Phe Ala Ala Val Ala Cys Thr Val Leu
275 280 285
Arg Cys Leu Gly Ile Pro Thr Arg Val Val Thr Asn Tyr Asn Ser Ala
290 295 300
His Asp Gln Asn Ser Asn Leu Leu Ile Glu Tyr Phe Arg Asn Glu Phe
305 310 315 320
Gly Glu Ile Gln Gly Asp Lys Ser Glu Met Ile Trp Asn Phe His Cys
325 330 335
Trp Val Glu Ser Trp Met Thr Arg Pro Asp Leu Gln Pro Gly Tyr Glu
340 345 350
Gly Trp Gln Ala Leu Asp Pro Thr Pro Gln Glu Lys Ser Glu Gly Thr
355 360 365
Tyr Cys Cys Gly Pro Val Pro Val Arg Ala Ile Lys Glu Gly Asp Leu
370 375 380
Ser Thr Lys Tyr Asp Ala Pro Phe Val Phe Ala Glu Val Asn Ala Asp
385 390 395 400
Val Val Asp Trp Ile Gln Gln Asp Asp Gly Ser Val His Lys Ser Ile
405 410 415
Asn Arg Ser Leu Ile Val Gly Leu Lys Ile Ser Thr Lys Ser Val Gly
420 425 430
Arg Asp Glu Arg Glu Asp Ile Thr His Thr Tyr Lys Tyr Pro Glu Gly
435 440 445
Ser Ser Glu Glu Arg Glu Ala Phe Thr Arg Ala Asn His Leu Asn Lys
450 455 460
Leu Ala Glu Lys Glu Glu Thr Gly Met Ala Met Arg Ile Arg Val Gly
465 470 475 480
Gln Ser Met Asn Met Gly Ser Asp Phe Asp Val Phe Ala His Ile Thr
485 490 495
Asn Asn Thr Ala Glu Glu Tyr Val Cys Arg Leu Leu Leu Cys Ala Arg
500 505 510
Thr Val Ser Tyr Asn Gly Ile Leu Gly Pro Glu Cys Gly Thr Lys Tyr
515 520 525
Leu Leu Asn Leu Asn Leu Glu Pro Phe Ser Glu Lys Ser Val Pro Leu
530 535 540
Cys Ile Leu Tyr Glu Lys Tyr Arg Asp Cys Leu Thr Glu Ser Asn Leu
545 550 555 560
Ile Lys Val Arg Ala Leu Leu Val Glu Pro Val Ile Asn Ser Tyr Leu
565 570 575
Leu Ala Glu Arg Asp Leu Tyr Leu Glu Asn Pro Glu Ile Lys Ile Arg
580 585 590
Ile Leu Gly Glu Pro Lys Gln Lys Arg Lys Leu Val Ala Glu Val Ser
595 600 605
Leu Gln Asn Pro Leu Pro Val Ala Leu Glu Gly Cys Thr Phe Thr Val
610 615 620
Glu Gly Ala Gly Leu Thr Glu Glu Gln Lys Thr Val Glu Ile Pro Asp
625 630 635 640
Pro Val Glu Ala Gly Glu Glu Val Lys Val Arg Met Asp Leu Leu Pro
645 650 655
Leu His Met Gly Leu His Lys Leu Val Val Asn Phe Glu Ser Asp Lys
660 665 670
Leu Lys Ala Val Lys Gly Phe Arg Asn Val Ile Ile Gly Pro Ala
675 680 685

Claims (30)

1.一种治疗受试者的乳糜泻的方法，其包括向所述受试者施用包封一种或多种麦醇溶蛋白抗原表位(GLIA)的耐受免疫修饰颗粒(TIMP)，其中所述颗粒以0.1至10mg/kg的剂量施用。
2.一种用于降低受试者对麸质的敏感性的方法，其包括向所述受试者施用包封一种或多种麦醇溶蛋白抗原表位(GLIA)的耐受免疫修饰颗粒(TIMP)，其中所述颗粒以0.1至10mg/kg的剂量施用。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述TIMP-GLIA以单剂量或多剂量施用。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述TIMP-glia是静脉内、皮下、肌内、腹膜内或经口施用的。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述TIMP-GLIA包括聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述TIMP-GLIA在表面上是羧基官能化的。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述TIMP-GLIA具有负ζ电位。
8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述ζ电位为-80至-30mV之间。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述ζ电位为-60至-35mV之间。
10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述TIMP-GLIA包含聚乳酸:聚乙醇酸的共聚物比率为约50:50的聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)。
11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中粒度为100与1500nm之间。
12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中粒度为100与1000nm之间。
13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中粒度为400与800nm之间。
14.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种GLIA抗原选自由麦醇溶蛋白、麦谷蛋白、大麦醇溶蛋白、黑麦醇溶蛋白组成的群组。
15.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者接受无麸质饮食。
16.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述TIMP-GLIA在30分钟、1小时、2小时、3小时或更长时间内输注。
17.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述TIMP-GLIA以递增速率输注。
18.如权利要求17所述的方法，其中与非递增剂量施用相比，所述施用减少补体激活。
19.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者具有HLA-DQ2.5(HLA-DQA1*0501/B1*0201)或HLA-DQ8.1(DQA1*0301/B1*0302)的遗传图谱。
20.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者患有难治性乳糜泻。
21.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述施用改善乳糜泻或麸质敏感的一种或多种体征或症状。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述一种或多种症状选自由体重减轻、疲劳、头痛、铁缺乏症、叶酸缺乏症、维生素D缺乏症、维生素B12缺乏症、肠粘膜损伤和低骨密度组成的群组。
23.如权利要求21所述的方法，其中乳糜泻的一种或多种体征是从由绒毛萎缩、四聚体染色、ELISPOT、miRNA、外来体、DNA和RNA组成的群组中鉴定的。
24.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述TIMP-GLIA每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每两个月一次、每三个月一次、每六个月一次或每年一次施用。
25.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述TIMP-GLIA还包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
26.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述施用导致所述受试者中巨噬细胞或单核细胞的凋亡。
27.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述施用诱导免疫无能。
28.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述TIMP-GLIA与第二剂联合施用。
29.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述TIMP-GLIA以加强剂量的形式施用。
30.如权利要求29所述的方法，其中如通过皮肤点刺试验或外周血单核细胞水平所确定，在需要时施用所述加强剂量。
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