CN111850119A - 定量检测bst1、stab1和tlr4基因表达水平的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种定量检测BST1、STAB1和TLR4基因表达水平的方法及应用,具体涉及BST1、STAB1和TLR4基因在诊断早期肺癌试剂中的应用。肺癌是绝大多数国家主要的癌症死亡原因,早期诊断和早期治疗尤为重要。本发明为了根据肺癌的发生和发展机制,将与肺癌相互作用的T细胞作为研究对象,为肺癌的诊断提供全新视角。首先拟通过转录组测序技术检测早期肺癌病人、正常人外周血经分选后获得CD8+PD‑1+T细胞中差异表达基因;其次通过转录组微量建库和RT‑qPCR技术对测序结果进行验证;再次扩大样本量,确定CD8+PD‑1+T细胞中差异性表达的基因谱,为肺癌的早期诊断提供新的标志物。
Description
技术领域
本发明涉及基因诊断技术领域,具体涉及一组表达于肿瘤相互作用T细 胞的基因谱在早期肺癌诊断试剂中的应用,更具体涉及转录组微量建库实现 检测极少量CD8+PD-1+T细胞中差异性表达基因,将该基因谱BST1、STAB1 和TLR4应用于开发诊断早期肺癌的检测试剂。
背景技术
2018年国际癌症研究机构公布的最新全球癌症评估报告显示,肺癌是世 界上发病率和死亡率都位居前列的恶性肿瘤之一。我国国家癌症中心2017 年的统计数据同样显示肺癌是高居癌症发病率和死亡率之首。目前,早期患 者通过手术切除,并辅助以化疗,效果良好;但对晚期已转移的患者尚缺乏 有效的治疗手段,且预后差。因此,亟待寻找早期诊断肺癌病变的手段以减 少肺癌发病率和死亡率,如何将分子生物学的技术用于肺癌早期诊断,提高 早期肺癌的检出率是当前研究的热点之一。
近年来研究,对细胞程序性死亡受体1(PD-1;也称为CD279)及其配 体PD-L1(B7-H1或CD274)通路在肿瘤免疫逃逸的作用有了深入理解,在 肺癌外周血的T细胞也有PD-1/PD-L1通路的异常,常表现为CD8阳性T淋 巴细胞(CD8+T细胞)的PD1阳性表达,可能与T细胞与肿瘤的分泌相互 作用而形成,在早期肺癌的形成过程中,也可发现CD8+T细胞的PD1阳性表达。此外对于正常人群有慢病毒感染的,CD8+T细胞也会表达PD1。因 此区分正常人群和早期肺癌的与肿瘤相互作用T细胞基因表达谱可以用于 发现早期肺癌,外周血液方便研制实用的诊断试剂。
随着人类基因组学的解密,第二代测序技术是近年来高通量筛选分子标 志物的重要方法之一,已被广泛应用到肿瘤发生、发展的机制研究中。
以胸部X光片、螺旋CT、支气管内镜、痰液细胞学等检测手段用于肺 癌的筛检和早诊已有较多报道,但以上检查手段在敏感性、特异性、适用度 等方面存在局限性,近年来国内外研究人员对有关肺癌早期诊断的分子标志 物做了大量有益的探索。肺癌的标志物已有很多报道,如癌胚抗原(CEA)、 SCC、细胞角蛋白cytokeratins(CYFRA,TPA,and TPS)等可作为非小细胞 肺癌的早诊标志物,神经元特异性烯醇化酶(NSE)、ProGRP则可用于小细 胞肺癌的早期诊断,但这些标志物并没有很理想,原因如下:不是肺癌特异 性的,在其他肿瘤中也存在异常表达;灵敏度较差;标志物之间是否存在相 互联系不得而知。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种定量检测BST1、STAB1和TLR4基因表 达水平的方法及应用及检测BST1、STAB1和TLR4基因的制剂在制备诊断 肺癌制剂中的应用。进一步,所述的肺癌诊断制剂包括用微量RNA建库、 RNA-seq测序、荧光定量PCR方法检测外周血CD8+PD-1+T细胞中BST1、 STAB1和TLR4基因的表达。
本发明旨在找到特异性强,灵敏度高的bio-marker,有望提高肺癌的早 期诊断。首先拟通过转录组微量建库结合RNA-seq测序检测早期肺癌病人、 正常人外周血经分选后获得PD-1阳性CD8阳性T淋巴细(简称CD8+PD-1+T 细胞)中差异表达基因;其次通过RT-qPCR技术对测序结果进行验证;扩 大样本量,确定CD8+PD-1+T细胞中差异性表达的基因谱(BST1、STAB1 和TLR4),将BST1、STAB1和TLR4基因谱作为肺癌的早期诊断和治疗提 供新的靶点。
一种定量检测CD8+PD-1+T细胞中BST1、STAB1和TLR4基因表达水 平的方法,包括:从离体的外周血样本中提取分离(通过流式分选)得到 CD8+PD-1+T细胞,采用荧光定量PCR方法检测检测CD8+PD-1+T细胞中 BST1、STAB1和TLR4基因的表达水平;
所述的BST1基因为人源BST1基因,BST1基因序列信息由美国国立生 物技术信息中心(NCBI)提供,该基因位于四号染色体,基因组编号为 NC_000004.12,序列信息网站为(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/683);
所述的STAB1基因为人源STAB1基因,STAB1基因序列信息由美国国 立生物技术信息中心(NCBI)提供,该基因位于三号染色体,基因组编号 为NC_000003.12,序列信息网站为(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/23166);
所述的TLR4基因为人源TLR4基因,TLR4基因序列信息由美国国立 生物技术信息中心(NCBI)提供,该基因位于九号染色体,基因组编号为NC_000009.12,序列信息网站为(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/7099)。
所述的荧光定量PCR方法检测BST1、STAB1和TLR4基因的CDS区 域,含有三对特异性扩增的引物:
所述的BST1基因的引物上游引物序列为TGGGA AAATAGCCACCTCCT,下游引物序列为CCCTGCCATACAGAACATCG;
所述的STAB1基因的引物上游引物序列为 CAACATTAGTGGGAGGGTCTGG,下游引物序列为 GGGCACAAAGATGGTGTAGGC;
所述的TLR4基因的引物上游引物序列为 AGACCTGTCCCTGAACCCTATG,下游引物序列为TTAGACCTGTCCCTG AACCCTA。
定量检测CD8+PD-1+T细胞中BST1、STAB1和TLR4基因表达水平的制 剂在制备肺癌的诊断制剂(即肺癌早诊制剂)中的应用。
所述的应用,肺癌的诊断制剂采用荧光定量PCR方法检测BST1、STAB1 和TLR4基因的表达。所述的应用,荧光定量PCR方法检测BST1、STAB1 和TLR4基因的CDS区域,含有三对特异性扩增的引物:BST1基因的引物 上游引物序列为TGGGA AAATAGCCACCTCCT,下游引物序列为 CCCTGCCATACAGAACATCG;STAB1基因的引物上游引物序列为CAACATTAGTGGGAGGGTCTGG,下游引物序列为 GGGCACAAAGATGGTGTAGGC;TLR4基因的引物上游引物序列为 AGACCTGTCCCTGAACCCTATG,下游引物序列为TTAGACCTGTCCCTG AACCCTA。
与现有技术相比,本发明具有如下优点:
一、以免疫细胞为目标细胞,是肿瘤诊断新机制。
二、微量建库方法筛选差异基因有利于早期发现差异基因谱。
三、由于免疫细胞的异质性不大避免了肿瘤细胞的高异质性带来的敏感 性和特异性问题。
四、利用外周血样本作为基因检测对象,较方便实用。
五、本发明为了根据肺癌的发生和发展机制,将与肺癌相互作用的T细 胞作为研究对象,为肺癌的诊断提供全新视角。首先拟通过转录组测序技术 检测早期肺癌病人、正常人外周血经分选后获得CD8+PD-1+T细胞中差异表 达基因;其次通过转录组微量建库和RT-qPCR技术对测序结果进行验证;再 次扩大样本量,确定CD8+PD-1+T细胞中差异性表达的基因谱,为肺癌的早 期诊断提供新的标志物。
附图说明
图1为248例肿瘤患者、272例肺结核患者与620例健康体检者外周血 CD8+PD1+细胞占CD8+细胞的比例的示意图;
图2为支持向量机算法对17例早期肺癌患者及9例体检健康者的分类 分析图;其中,Batch代表批次,共三个批次;health代表体检健康者,lung 代表早期肺癌患者;
图3为31例肺癌外周血CD3+CD8+PD1+细胞中高表达BST1、STAB1 和TLR4基因图。
具体实施方式
实施例1本发明发现与体检健康的正常人、肺结核患者相比,肿瘤患者 外周血CD8+PD-1+T细胞高表达。
试剂和材料
Ficoll-Paque淋巴细胞分离液(GE),红细胞裂解液(BD PMG,货号 555899),流式抗体CD3 APC-H7(BD PMG,货号560176,),CD4 FITC(BD PMG,货号556615),CD8 PerCP(BDIS,货号652829),PD1 PE-CyTM7 (BD PMG,货号561272),其中IgG1κPE-CyTM7(BD PMG,货号557872) 作为Isotype Control。
实验方法:
材料的采集与准备:抽取248例肿瘤患者,620例健康体检者与272例 肺结核患者的外周血样本,抽取5ml静脉血置于血常规管子肝素抗凝后,用 淋巴细胞分离液分离出位于上中层界面处的那一白色云雾层的窄带,即单核 细胞(包括淋巴细胞和单核细胞)。经红细胞裂解液处理后用PBS重悬沉淀, 取20ul进行细胞计数。如上进行相同操作。
流式抗体染色与上机检测:按1×106/test进行染色,设置单阳组,IsotypeControl组和样本组,(单阳管:CD3/5ul或者CD4/20ul或者CD8/20ul或者 PD1/5ul;IsotypeControl管IgG1κPE-CyTM7/1ul;样本管: CD3/5ul+CD4/20ul+CD8/20ul+PD1/5ul)。用适量3%BSA溶液重悬单核细胞, 并转移至流式管内,采用BD FCS AriaIII进行分析,计算并收集 CD3+CD8+PD1+细胞数量。
实验结果
我们发现健康者与肺结核患者的CD3+CD8+PD1+细胞占CD8+总量的 平均值分别为0.19,0.23,肿瘤患者CD3+CD8+PD1+细胞比例显著高于体检 健康者(2.02,p<0.001),详见图1,如图1所示,流式结果显示肿瘤患者 外周血PBMC中CD3+CD8+PD1+细胞数量明显高于正常人、。
实施例2本发明发现早期肺癌患者外周血CD8+PD-1+细胞中高表达BST1、 STAB1和TLR4基因。
试剂和材料
见实施例1。
实验方法:
材料的采集与准备:我们选取实施例1中17例早期肺癌患者及9例体 检健康的正常人的外周血样本,后续处理同实施例1,抽取5ml静脉血置于 血常规管子肝素抗凝后,用淋巴细胞分离液分离出位于上中层界面处的那一 白色云雾层的窄带,即单核细胞(包括淋巴细胞和单核细胞)。经红细胞裂 解液处理后用PBS重悬沉淀,取20ul进行细胞计数。
流式抗体染色与上机检测:染色步骤同实施例1,采用BD FCS AriaIII 进行CD3+CD8+PD1+细胞的分析计数与分选,收集CD3+CD8+PD1+细胞, 并用RNA latter试剂混匀后冻于-80℃备用。
转录组测序:进行全转录组RNA提取、Dr GenTLE沉淀、双链cDNA 合成、末端修复、加A和接头、片段选择和PCR扩增、XP磁珠纯化扩增产 物、文库质量检测,产物合格后,按照Illumina公司的HiSeq 2500高通量测 序平台标准流程上机测序。
数据过滤和参考基因组比对
首先,为了保证数据分析的质量及可靠性,需要对raw reads进行过滤, 去除含有接头adapter reads和去除低质量reads等,得到每个样本约12Gb clean data,Q30不低于99.9%。
然后,利用HISAT2软件(http://ccb.jhu.edu/software/hisat2/faq.shtml)将clean reads与UCSCH.sapiens参考基因组(hg19)进行快速精确的比对,进而 获得reads在人参考基因组上的定位信息。同时,采用subread软件中的featureCounts工具分别过滤掉比对质量值低于10的reads,非成对比对上 的reads,以及比对到基因组多个区域的reads。该部分本项目所产生的测序 reads成功比对率不低于70%(total_map>70%)。
基因表达水平分析
为了消除测序深度和基因长度因素对基因的表达量的影响,因此需要用 一个参数FPKM(expected number of Fragments Per Kilobase of transcript sequence perMillions base pairs sequenced)进行校正。RPKM是将比对到基 因的reads数目除以比对到基因组上的所有reads数目(以million为单位)与 RNA的长度(以kb为单位)。首先,利用软件Cufflinks v1.0.32将mapped reads 进行FPKM标准化转化,一般FPKM>1认为基因表达的阈值。
为了衡量生物学重复性,我们需要进行样本间相关性分析,相关性系数 约接近1,表明样品之间的表达模式的相似度越高,也说明实验的可靠性和 样本选择的合理性。根据各样本所有基因的FPKM值用Pearson correlation 方法计算组内及组间样本的相关性系数。
基因差异表达分析
基因差异表达的分析数据为基因表达水平分析中的reads数据,而不是 FPKM。对于有生物学重复的样品,我们通常采用DESeq(Anders et al,2010) 方法进行分析,其根据标准化的reads count均值计算FoldChange,同时也会 对每个基因在所有比较组合的差异显著性p value(pval)以及多重假设检验 校正后p值(qvalue/padj)进行分析。对每个比较组合的差异基因(上调和 下调基因)进行数目统计,再设置log2FoldChange阈值和padj值来筛选差 异表达的基因。对有生物学重复试验的差异基因进行筛选,阈值设定一般为: |log2(FoldChange)|>1且qvalue<0.05。
支持向量机(SVM)算法进行分类
我们使用支持向量机算法(SVM)对样本(健康与疾病)进行分类,该 分类器是使用mlr包在R中实现的。
实验结果
与健康者相比,我们发现早期肺癌患者外周血CD8+PD-1+T细胞中14 个差异表达基因BST1、STAB1、TLR4、ASIC1、ARHGEF10、CHST13、 CLEC12A、CTSS、GCA、KLF4、PLEKHS1、PURA、TCN2、TLR8基因, 且依赖于这14个基因,肿瘤与健康者有明显的分类趋势,且平均错误分类 误差(mmce)小于0.01(图2)。这三个差异表达明显基因是我们研究的重 点。
实施例3 RT-qPCR验证肺癌CD3+CD8+PD1+细胞中14个差异基因的表达 水平
试剂和材料
采集31例肺癌外周血、4例肺部肉芽肿性炎症及17例肺结核患者外周 血,采集标准见实施例1。
实验方法
外周血的处理,流式抗体染色与上机检测见实施例1,流式分选后得到 CD3+CD8+PD1+细胞。
RNA的提取
按凯杰RNeasy Micro Kit的标准操作抽提总RNA,分选后细胞加入配好 含350μlβ-ME的Buffer RLT和350μL 70%乙醇,剧烈震荡混匀后过MinElute 过滤柱,≥10000rpm离心15s,弃废液。加入350μL Buffer RW1,≥10000rpm 离心15s,弃废液。滤柱膜上加入80μLDNase I(10μL)与RDD(70μL), 静置15min,加入350μL Buffer RW1≥10000rpm离心15s,弃废液。加入配 好的RPE 500μL(RPE与4倍体积的乙醇混合),≥10000rpm,离心15s, 弃废液。加入80%的乙醇500μL,≥10000rpm,离心2min,弃废液。把滤 柱放入新的1.5mL收集管,向膜的中心加入14μL无RNA水,静置2min, 离心2min。
微量建库
Dr GenTLE沉淀
得到RNA后进行微量建库,步骤如下:首先加入1/10体积的3M sodium Acetate(PH5.2),2.5倍体积的无水乙醇,4μL Dr GenTLE,充分混匀,12000 rpm,4℃,离心15min,弃上清,留白色沉淀。加入70%乙醇,12000rpm, 4℃,离心5min,弃上清,干燥沉淀。2μL水复溶,待SMART-seq2。将 Dr GenTLE沉淀产物与1μL 10mM dNTP,1μL 10uM Oligo-dT Primer混合后加入2μL裂解液,该4μL的体系置于PCR仪内,72℃,3min孵育,热 盖温度为75℃,裂解完成后立即置于冰上1min。
逆转录
反应体系:500ng总RNA(按浓度计算体积),2μL 5×SuperScript II First-Strand Buffer,2μL 5M Betaine,0.9μL 100mM MgCl2,0.25μL 100mM DTT,0.1μL 100uMTSO,0.25μL 40U/μL RNAse inhibitor,0.5μL 200U/μL SSII,反应体系为6μL,热盖温度75℃,反应条件如下,如表1所示:
表1
此步后,所有mRNAs的第一链cDNA合成完毕。
PCR预扩增
扩增体系:10μL逆转录产物,12.5μL5 X KAPA HiFi HotStart ReadyMix, 0.25μL10uM IS PCR Primer,2.25μL Nuclease-free water。总体系25μL,按 下述条件预扩增,如表2所示:
表2
XP磁珠纯化
室温下重悬AmPure XP Beads,按1:1比例取25μL到1.5mL离心管中, 将25μL离心管中的预扩增产物加入到磁珠中轻轻吹打混匀10次,室温下 孵育8min;将离心管置于磁力架上吸附5min,待液体澄清后,吸去;在不 扰动磁珠的情况下加入200μL 80%乙醇,静置30s后,吸去,重复洗涤一遍; 室温下,干燥3~5min,磁珠有轻微裂痕后即可取下离心管,加入19μL水, 吹打混匀,室温静置2min;磁力架吸附2min,取出液体(19ul)至一洁净 的离心管中;取1ul用于Qubit、1ul用于2100检测。合格结果为:条带范 围在500bp~7kb,其中,在1.5~2kb附近会出现一个峰。
Real Time荧光定量PCR(Real time quantitative polymerase chainreaction, RT-qPCR)
得到的逆转录样品进行可进行RT-qPCR,体系及步骤如下:
在冰上配制如下反应体系,如表3所示:
表3
PCR扩增程序如下,如表4所示:
表4
使用新引物时需要验证引物的溶解曲线是否良好,要将RT-qPCR产物进 行2%琼脂糖凝胶电泳分析,鉴定出正确大小的片段才能保证PCR扩增产物 的准确性和特异性。用Microsoft Excel进行基因表达的相对定量分析,目的 基因(target gene,T)的表达量以内参基因(reference gene,R)的表达量 作为参照,数据计算为2Ct R-Ct T。
实验结果:
BST1、STAB1、TLR4三个基因具有许多重要的功能,其中BST1(CD157) 又叫ADP-核糖基环化酶2,是脂质错定的双功能胞外酶,它能够催化核糖 核巧酸环化和水解。BST1在急性髓细胞性白血病、90%以上的原发性上皮 性卵巢癌和恶性胸膜间皮瘤等中均有表达,且其表达水平与疾病的预后相关, 且目前正在研究CD157作为急性髓细胞性白血病免疫疗法的靶标。STAB1 是一类清道夫受体,其表达影响巨噬细胞噬菌作用的能力,并被证实是噬菌作用的受体,参与凋亡和吞噬衰老细胞。TLR4是Toll样受体家族中研究最 多的成员,它主要表达于细胞膜上,尤其是树突状细胞和巨噬细胞,以脂多 糖结合蛋白-CD14-TLR4三聚体形式识别脂多糖,并将炎症信号传导入细胞, 其参与多种疾病的演变过程,尤其在炎症和宿主防御反应等方面起着至关重 要的作用。
我们研究发现31例肺癌外周血CD3+CD8+PD1+细胞中高表达BST1、 STAB1和TLR4基因(ct值17-25),4例肺部肉芽肿性炎症与17例肺结核患 者外周血CD3+CD8+PD1+细胞中BST1、STAB1和TLR4基因低表达(ct值 29-检测不到),详见图3。该结果提示通过检测周血CD3+CD8+PD1+细胞中 BST1、STAB1和TLR4基因组合的表达水平,可以区分肺癌和非肺癌患者。 而这三个基因还具有其他许多重要的功能,其中BST1(CD157)又叫ADP- 核糖基环化酶2,是脂质错定的双功能胞外酶,它能够催化核糖核巧酸环化 和水解。BST1在急性髓细胞性白血病、90%以上的原发性上皮性卵巢癌和 恶性胸膜间皮瘤等中均有表达,且其表达水平与疾病的预后相关,且目前正 在研究CD157作为急性髓细胞性白血病免疫疗法的靶标。STAB1是一类清 道夫受体,其表达影响巨噬细胞噬菌作用的能力,并被证实是噬菌作用的受 体,参与凋亡和吞噬衰老细胞。TLR4是Toll样受体家族中研究最多的成员, 它主要表达于细胞膜上,尤其是树突状细胞和巨噬细胞,以脂多糖结合蛋白 -CD14-TLR4三聚体形式识别脂多糖,并将炎症信号传导入细胞,其参与多 种疾病的演变过程,尤其在炎症和宿主防御反应等方面起着至关重要的作用。
Claims (5)
1.一种定量检测CD8+PD-1+T细胞中BST1、STAB1和TLR4基因表达水平的方法,其特征在于,包括:提取分离离体的外周血样本,通过流式分选得到CD8+PD-1+T细胞,采用荧光定量PCR方法检测检测CD8+PD-1+T细胞中BST1、STAB1和TLR4基因的表达水平。
2.根据权利要求1所述的定量检测CD8+PD-1+T细胞中BST1、STAB1和TLR4基因表达水平的方法,其特征在于,所述的荧光定量PCR方法检测BST1、STAB1和TLR4基因的CDS区域,含有三对特异性扩增的引物:
所述的BST1基因的引物上游引物序列为TGGGAAAATAGCCACCTCCT,下游引物序列为CCCTGCCATACAGAACATCG;
所述的STAB1基因的引物上游引物序列为CAACATTAGTGGGAGGGTCTGG,下游引物序列为GGGCACAAAGATGGTGTAGGC;
所述的TLR4基因的引物上游引物序列为AGACCTGTCCCTGAACCCTATG,下游引物序列为TTAGACCTGTCCCTGAACCCTA。
3.定量检测CD8+PD-1+T细胞中BST1、STAB1和TLR4基因表达水平的制剂在制备肺癌早诊制剂中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,肺癌的诊断制剂采用荧光定量PCR方法检测BST1、STAB1和TLR4基因的表达。
5.根据权利要求4所述的应用,荧光定量PCR方法检测BST1、STAB1和TLR4基因的CDS区域,含有三对特异性扩增的引物:
BST1基因的引物上游引物序列为TGGGA AAATAGCCACCTCCT,下游引物序列为CCCTGCCATACAGAACATCG;STAB1基因的引物上游引物序列为CAACATTAGTGGGAGGGTCTGG,下游引物序列为GGGCACAAAGATGGTGTAGGC;TLR4基因的引物上游引物序列为AGACCTGTCCCTGAACCCTATG,下游引物序列为TTAGACCTGTCCCTGAACCCTA。
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---|---|---|---|---|
WO2021243951A1 (zh) * | 2020-06-04 | 2021-12-09 | 吴式琇 | 定量检测bst1、stab1和tlr4基因表达水平的方法及应用 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1852974A (zh) * | 2003-06-09 | 2006-10-25 | 密歇根大学董事会 | 用于治疗和诊断癌症的组合物和方法 |
CN102271686A (zh) * | 2008-11-04 | 2011-12-07 | 艾德拉药物股份有限公司 | 通过反义寡核苷酸来调制Toll样受体4表达 |
US20150315643A1 (en) * | 2012-12-13 | 2015-11-05 | Baylor Research Institute | Blood transcriptional signatures of active pulmonary tuberculosis and sarcoidosis |
US20200147210A1 (en) * | 2017-05-11 | 2020-05-14 | The General Hospital Corporation | Methods and compositions of use of cd8+ tumor infiltrating lymphocyte subtypes and gene signatures thereof |
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---|---|---|---|---|
CN101625361A (zh) * | 2009-02-26 | 2010-01-13 | 中国人民解放军第二军医大学 | 一种慢性乙型肝炎患者免疫状态的诊断方法 |
JP6257655B2 (ja) * | 2013-03-01 | 2018-01-10 | アメリカ合衆国 | 末梢血から腫瘍反応性t細胞の濃縮された集団を作製する方法 |
EP2806274A1 (en) * | 2013-05-24 | 2014-11-26 | AIT Austrian Institute of Technology GmbH | Lung cancer diagnostic method and means |
CN105087485A (zh) * | 2015-07-10 | 2015-11-25 | 上海鑫宸医疗科技有限公司 | 一种肿瘤特异性til细胞的培养方法 |
CN106834228B (zh) * | 2017-01-17 | 2021-03-23 | 上海新长安生物科技有限公司 | 一种体外扩增cd8+t细胞及其细胞亚群的方法 |
CA3057041A1 (en) * | 2017-03-15 | 2018-09-20 | Hyogo College Of Medicine | Novel biomarkers for cancer immunotherapy |
CN109777872B (zh) * | 2017-11-15 | 2021-04-02 | 北京大学 | 肺癌中的t细胞亚群及其特征基因 |
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Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1852974A (zh) * | 2003-06-09 | 2006-10-25 | 密歇根大学董事会 | 用于治疗和诊断癌症的组合物和方法 |
CN102271686A (zh) * | 2008-11-04 | 2011-12-07 | 艾德拉药物股份有限公司 | 通过反义寡核苷酸来调制Toll样受体4表达 |
US20150315643A1 (en) * | 2012-12-13 | 2015-11-05 | Baylor Research Institute | Blood transcriptional signatures of active pulmonary tuberculosis and sarcoidosis |
US20200147210A1 (en) * | 2017-05-11 | 2020-05-14 | The General Hospital Corporation | Methods and compositions of use of cd8+ tumor infiltrating lymphocyte subtypes and gene signatures thereof |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
农靖颖: "与肺癌治疗及预后相关的新的生物标志物初探", 《中国博士学位论文全文数据库》 * |
李小红等: "PD-1 + 肿瘤浸润性CD8 + T 淋巴细胞的表型鉴定及功能研究", 《第三军医大学学报》 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2021243951A1 (zh) * | 2020-06-04 | 2021-12-09 | 吴式琇 | 定量检测bst1、stab1和tlr4基因表达水平的方法及应用 |
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