CN111850088A - 一种中和壳聚糖抑菌性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种中和壳聚糖抑菌性的方法。本发明使用的中和壳聚糖抑菌剂的方法中使用的中和剂由四部分组分，包括蛋白、肌肉组织提取物、无机盐和水。使用此中和剂能在短时间内完全中和溶液中的壳聚糖、壳聚糖醋酸盐、壳聚糖季铵盐、羧甲基壳聚糖、羟丁基壳聚糖和琥珀酰壳聚糖的抑菌性。且本发明中和剂原料来源广泛，成本低廉，无毒无害无副作用，也不会影响微生物的生长繁殖。本发明的一种中和壳聚糖抑菌性的方法有望作为专用中和剂，解决壳聚糖及其衍生物的抑菌性鉴定和判定试验中缺少高效抑菌中和剂的问题。

Description

一种中和壳聚糖抑菌性的方法
技术领域
本发明属于消毒剂技术领域，具体涉及一种中和壳聚糖抑菌性的方法。
背景技术
根据卫生部卫生法制与监督司所颁布的《消毒技术规范》中对消毒剂及其对应的中和剂的鉴定和判定，在评价消毒剂对微生物的杀灭效果试验中，为使结果真实可靠，防止出现假阴性，试验作用时间到达规定时间时，要迅速终止消毒剂对微生物的消毒作用。最常采用的方法是用化学中和法消除消毒试验体系中残留消毒剂的消毒能力。
壳聚糖是甲壳素脱乙酰化后的产物，也是迄今为止发现的唯一一种海洋来源的天然碱性多糖。其具有优良的无毒性、生物相容性和生物可降解性，还具有良好的广谱抑菌性。研究表明，壳聚糖具有天然、广谱的抗菌性能，对多种细菌、霉菌具有杀灭作用，在食品保鲜、棉织物抗菌处理等方面有着广泛的应用。壳聚糖的抑菌性还可以扩展到很多衍生物，因此应用范围大大扩展。然而，评价壳聚糖抑菌效果的中和技术和中和剂选择方面还面临着诸多问题，例如，由于壳聚糖分子内和分子间有较强的氢键，只能溶于醋酸等特定的酸性溶剂中，而醋酸本身也具有一定的抑菌性，这样对壳聚糖自身抑菌贡献的评判就需要依靠抑菌中和剂的参与。
董德荣2013年报道了吐温80-卵磷脂对壳聚糖的中和作用，并认为吐温80-卵磷脂EPS溶液是一种理想的壳聚糖中和剂；然而，若先加中和剂将壳聚糖反应后，则灭菌效果与单纯的乙酸溶液类似。壳聚糖除了在醋酸溶液中具有抑菌性质以外，还可以产生很多壳聚糖衍生物同样具有与抑菌性，如壳聚糖醋酸盐、壳聚糖季铵盐、羧甲基壳聚糖等；再者壳聚糖抑菌性还与所抑制的菌种类有很大关系，因此，需要更准确的中和壳聚糖及其衍生抑菌性的方法。
本发明公开一种中和壳聚糖抑菌性方法，可有效中和壳聚糖消毒剂中的抑菌活性组分，且对试验微生物无害。以弥补已有的壳聚糖抑菌中和方法的不足。
发明内容
本发明针对壳聚糖没有高效抑菌中和剂的问题，发明了一种中和壳聚糖抑菌性的方法。
本发明使用了壳聚糖、中和剂及其对应的操作技术。
本发明使用的壳聚糖的衍生物，包括壳聚糖醋酸盐、壳聚糖季铵盐、羧甲基壳聚糖、羟丁基壳聚糖、琥珀酰壳聚糖。其抑菌的质量百分比浓度范围是0.01% ~ 2%。
本发明使用的中和剂由四部分组成，包括蛋白、肌肉组织提取物、无机盐和水，其各组分配比为（质量百分比%）：蛋白1.50% ~ 2.6%，肌肉组织提取物1.1% ~ 2.5%，无机盐0.5% ~ 1.5%，三组分混合后以水补充至100。
本发明使用的试验菌种有革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，其中革兰氏阴性菌包括大肠杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌；革兰氏阳性菌包括金黄色葡萄球菌、链球菌。试验菌种菌落密度范围为2.5×103 ~ 5×106 cfu/mL。
本发明使用的中和剂中和壳聚糖抑菌性的技术方法是: 取50 μL抑菌剂于离心管内并加入0.35 mL蒸馏水，加入4.5 mL中和剂混匀，反应5 min后，再加入0.1 mL的试验菌悬液，混匀，作用10 min后吸取1.0 mL接种于固体LB琼脂平皿中，三组平行实验，置于37 ℃培养箱中倒置培养18 h，做菌落培养计数。
本发明使用的中和剂中的蛋白可以是卵清蛋白、乳清蛋白，也可以是蛋白酶水解蛋白如胰蛋白胨以及鱼肉蛋白肽; 使用的肌肉组织提取物包括猪肉提取物、鸡肉提取物、牛肉提取物或肉类浸膏；使用的无机盐是指可溶性无机盐，包括氯化钾、氯化钠、硝酸钾、硝酸钠、硫酸钠、硫酸钾。
本发明所使用的中和剂可以是任意两种蛋白、肌肉组织提取物或无机盐混合使用。包括任意两种蛋白按1：1到1：10之间的比例混合，包括任意两组组织提取物之间按1：1到1：10之间的比例混合，包括任意两种无机盐按1：1到1：10之间的比例混合。
本发明所使用的中和剂在用于中和壳聚糖及其衍生物的抑菌性前可先在115 ~125 ℃高温下处理20 ~ 50分钟，冷却后使用可达到最优中和剂效果。
本发明的一种中和壳聚糖抑菌性方法，能快速有效的中和溶液中的壳聚糖、壳聚糖醋酸盐、壳聚糖季铵盐、羧甲基壳聚糖、羟丁基壳聚糖和琥珀酰壳聚糖的抑菌性。中和剂和中和产物不会影响试验微生物的生长繁殖，也不会破坏培养基的营养成分。本发明所用中和剂原料来源广泛，成本低廉，无毒无害无副作用。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，本发明并不局限于以下实施例。
实施例1：用于0.1%壳聚糖醋酸盐定量杀灭5×105 cfu/mL大肠杆菌试验的中和剂，根据质量百分比组成如下：卵清蛋白1%；乳清蛋白1%；猪肉提取物1.1%；氯化钾0.7%，硝酸钾0.3%，余量为水。
实施例2：用于1%羧甲基壳聚糖定量杀灭2×104 cfu/mL金黄色葡萄球菌试验的中和剂，根据质量百分比组成如下：鱼肉蛋白肽2%；牛肉提取物1%；猪肉提取物1%；氯化钠0.5%；氯化钾1%，余量为水。
实施例3：用于0.5%壳聚糖溶液定量杀灭8×105 cfu/mL绿脓杆菌试验的中和剂：根据质量百分比组成如下：乳清蛋白1.5%；胰蛋白胨1.1%；鸡肉提取物2.5%；，硫酸钾2%，余量为水。
实施例4：用于1.5%羟丁基壳聚糖定量杀灭2.5×103 cfu/mL变形杆菌试验的中和剂，根据质量百分比组成如下：卵清蛋白2.6%；牛肉浸膏2.5%；硫酸钠0.5%，硝酸钠0.5%，余量为水。
实施例5：用于0.01%壳聚糖季铵盐定量杀灭5×106 cfu/mL链球菌试验的中和剂，根据质量百分比组成如下：鱼肉蛋白肽2%；猪肉提取物1.5%，鸡肉提取物1%；氯化钠0.5%，余量为水。
实施例6：用于1%琥珀酰壳聚糖定量杀灭2×105 cfu/mL金黄色葡萄球菌试验的中和剂，根据质量百分比组成如下：乳清蛋白1.2%；鱼肉蛋白肽1.2%；猪肉提取物1%，牛肉提取物1%；硫酸钠0.5%；硫酸钾0.5%，余量为水。
按上述实施例 1~ 6中的各组份的含量配置中和剂，并在使用前先在115 ~ 125℃高温处理20 ~ 50分钟。
壳聚糖及其衍生物抑菌性试验的试验方法是: 抑菌组取50 μL抑菌剂于离心管内并加入4.85 mL蒸馏水，再加入0.1 mL的已稀释至对应浓度的试验菌悬液，混匀，作用15min后吸取1 mL接种于固体LB琼脂平皿中，三组平行实验组，置于37℃培养箱中倒置培养18h，做活菌培养计数，平均菌落数记为a。对照组为取4.9 mL蒸馏水，再加入0.1 mL的已稀释至对应浓度的试验菌悬液，混匀，作用15 min后吸取1 mL接种于固体LB琼脂平皿中，三组平行实验组，置于37℃培养箱中倒置培养18 h，做活菌培养计数，平均菌落数记为b。
抑菌率计算公式如下：
抑菌剂抑菌率R1 = （b-a）/ b × 100%
实施例1-6各组的抑菌率结果见表1。
中和剂中和试验的试验方法是: 中和剂组为取50 μL抑菌剂于离心管内并加入0.35 mL蒸馏水，加入4.5 mL中和剂混匀，反应5 min后，再加入0.1 mL的试验菌悬液，混匀，作用10 min后吸取1.0 mL接种于固体LB琼脂平皿中，三组平行实验，置于37℃培养箱中倒置培养18 h，做活菌培养计数，平均菌落数记为c；对照组和抑菌组的技术方法和上述抑菌试验中相同，空白对照组平均菌落数记为d，抑菌组平均菌落数记为e。
中和率计算公式为：
中和剂中和率R2 = （c-d）/ e × 100%
实施例1 - 6各组的中和剂中和率结果见表1。
表1
抑菌剂抑菌率R<sub>1</sub> 中和剂中和率R<sub>2</sub> 是否可在15分钟内完成中和
实施例1 100% 100% 是
实施例2 85% 100% 是
实施例3 100% 100% 是
实施例4 80% 100% 是
实施例5 100% 100% 是
实施例6 92% 100% 是
由表1结果可知，实施例1 ~ 6中所使用的壳聚糖及壳聚糖衍生物在对应浓度下均有较高的抑菌效率，所有实施例中抑菌剂抑菌率均高于80%。而实施例1 ~ 6中所使用的中和剂也均能在15分钟的反应时间内100%中和对应抑菌剂的抑菌性。说明本发明的中和剂可以快速高效的中和对应浓度的壳聚糖及其衍生物，包括壳聚糖醋酸盐、壳聚糖季铵盐、羧甲基壳聚糖、羟丁基壳聚糖和琥珀酰壳聚糖的抑菌性。

Claims (4)

1.一种中和壳聚糖抑菌性的方法，其特征在于，用于质量百分比0.01% ~ 2%的壳聚糖或壳聚糖的衍生物包括壳聚糖醋酸盐、壳聚糖季铵盐、羧甲基壳聚糖、羟丁基壳聚糖和琥珀酰壳聚糖细菌杀灭试验的中和剂，所述中和剂含有蛋白、肌肉组织提取物、无机盐和水。
2.根据权利要求1所述的一种中和壳聚糖抑菌性的方法，其特征在于，所述中和剂组分中蛋白可为蛋白胨、鱼肉蛋白肽、卵清蛋白、乳清蛋白；肌肉组织提取物可为牛肉提取物、猪肉提取物、鸡肉提取物、牛肉浸膏；无机盐可为氯化钠、氯化钾、硝酸钠、硝酸钾、硫酸钠、硫酸钾。
3.根据权利要求1所述的一种中和壳聚糖抑菌性的方法，其特征在于，所述中和剂各组分质量百分比范围为：蛋白1.5% ~ 2.6%，肌肉组织提取物1.1% ~ 2.5%，无机盐0.5% ~1.5%。
4.根据权利要求1所述的一种中和壳聚糖抑菌性的方法，其特征在于，所述中和剂用于壳聚糖对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的杀灭试验，其中革兰氏阴性菌包括大肠杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌；革兰氏阳性菌包括金黄色葡萄球菌、链球菌。
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