CN111850028A - 一种提高蛋白表达效率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高蛋白表达效率的方法，包括如下步骤：S1将含蛋白基因的重组载体转化毕赤酵母，所述重组载体为重组表达载体；S2通过在目的基因的起始密码子ATG后插入一段编码特定氨基酸片段的核苷酸来提高表达效率；S3在起始密码子ATG后4‑21位核苷酸序列以腺嘌呤和胸腺嘧啶的密码子取代部分胞嘧啶和鸟嘌呤的密码子，移除起始密码子ATG后4‑21位核苷酸组成的茎环发夹结构；S4以载体的快速定点诱变试剂盒Stratagene QuikChange Site‑directed Mutagenesis Kit构建多个突变菌株。本发明具有较高的通用性和可行性，不仅可以用于改造任意目的基因以提高其表达效率，还可以用于构建具有高表达效率特征的表达载体，使目的基因的蛋白表达效率显著提高。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种提高蛋白表达效率的方法。
背景技术
巴斯德毕赤酵母表达系统是目前最优秀、应用最广泛的外源基因表达系统之一。巴斯德毕赤酵母表达系统作为真核表达系统，有许多其它蛋白表达系统所不具备的优点。可对表达的蛋白进行加工折叠和翻译后修饰，从而使表达出的蛋白具有生物活性，具有强有力的乙醇氧化酶(AOX1)基因启动子，可严格调控外源蛋白的表达，营养要求低，培养基廉价，生长快，与昆虫、哺乳动物等高等真核细胞相比，易于进行操作和培养。巴斯德毕赤酵母对需氧生长有强的偏好，这一生理学特性使它能高密度发酵生长，表达量高，有利于工业放大生产。巴斯德毕赤酵母自身分泌的蛋白(背景蛋白)非常少，有利于外源蛋白的分离和纯化。表达的外源蛋白可分泌到胞外，分泌的内源蛋白少，外源蛋白分离纯化简便；外源基因通过质粒整合到基因组上，基因工程菌株遗传稳定性好；胞内表达蛋白的分选和区域化，增加了表达蛋白的稳定性，减少表达产物对宿主菌的毒害作用；糖基化程度低，与酿酒酵母相比，巴斯德毕赤酵母不产生过度的糖基化；所分泌的糖蛋白的免疫原性较低，更利于临床应用。
高密度发酵是毕赤酵母提高蛋白表达量的一种重要策略，发酵工艺是高密度发酵的一个重要因素。但是高密度发酵过程中，各种条件难以控制，酵母细胞内部自由基积累严重，容易导致酵母死亡，进而影响了外源蛋白表达。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种提高蛋白表达效率的方法。
本发明提出的一种提高蛋白表达效率的方法，包括如下步骤：
S1将含蛋白基因的重组载体转化毕赤酵母，所述重组载体为重组表达载体；
S2通过在目的基因的起始密码子ATG后插入一段编码特定氨基酸片段的核苷酸来提高表达效率；
S3在起始密码子ATG后4-21位核苷酸序列以腺嘌呤和胸腺嘧啶的密码子取代部分胞嘧啶和鸟嘌呤的密码子，移除起始密码子ATG后4-21位核苷酸组成的茎环发夹结构；
S4以载体的快速定点诱变试剂盒Stratagene QuikChange Site-directedMutagenesis Kit构建多个突变菌株；
S41控制重组毕赤酵母生长阶段的温度为30℃，使用25％氨水和30％磷酸调节pH，使体系的pH控制在5.5，并按预设时间加入10ng/ml-1μg/ml的褪黑激素；
S5在高效表达阶段，当补料生长阶段结束后，将发酵温度降至22℃，同时流加含12mL/LPTM1的100％的甲醇；
S6控制发酵液中甲醇浓度达到20g/L，诱导90h后结束发酵；
S7用XL1-Blue超级感受态菌株大量复制、突变和保存重组蛋白的质粒；通过 PCR扩增和测序实验多种基因改造的突变；
S8将重组蛋白的质粒转化进 BL21(DE3)pLysS超级感受态菌株菌株，在LB培养基中培养并定时检测吸光度， 并加入诱导剂诱导重组蛋白过量表达；经过SDS-PAGE分离的蛋白质条带的分析测定，筛选出能提供最高产量的重组蛋白的突变体菌株。
优选的，所述的特定氨基酸序列为X1X2……Xn，其中X代表有4个或以上密码子的氨基酸，n大于或等于3。
优选的，所述氨基酸片段的序列为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：7-21、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：53-64、SEQ ID NO：89、 SEQ ID NO：91-94、SEQ ID NO：96-99、SEQ ID NO：101-104或SEQ ID NO：106-112 中的任一个。
优选的，所述氨基酸片段，其编码核苷酸的序列为SEQ ID NO：2-6、SEQ ID NO：22-48、SEQ ID NO：50-52、SEQ ID NO： 65-88、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：109或SEQ ID NO：113-140中的任一个。
本发明中，所述一种提高蛋白表达效率的方法，具有较高的通用性和可行性，不仅可以用于改造任意目的基因以提高其表达效率，还可以用于构建具有高表达效率特征的表达载体，使目的基因的蛋白表达效率显著提高。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
一种提高蛋白表达效率的方法，包括如下步骤：
S1将含蛋白基因的重组载体转化毕赤酵母，所述重组载体为重组表达载体；
S2通过在目的基因的起始密码子ATG后插入一段编码特定氨基酸片段的核苷酸来提高表达效率；
S3在起始密码子ATG后4-21位核苷酸序列以腺嘌呤和胸腺嘧啶的密码子取代部分胞嘧啶和鸟嘌呤的密码子，移除起始密码子ATG后4-21位核苷酸组成的茎环发夹结构；
S4以载体的快速定点诱变试剂盒Stratagene QuikChange Site-directedMutagenesis Kit构建多个突变菌株；
S41控制重组毕赤酵母生长阶段的温度为30℃，使用25％氨水和30％磷酸调节pH，使体系的pH控制在5.5，并按预设时间加入10ng/ml-1μg/ml的褪黑激素；
S5在高效表达阶段，当补料生长阶段结束后，将发酵温度降至22℃，同时流加含12mL/LPTM1的100％的甲醇；
S6控制发酵液中甲醇浓度达到20g/L，诱导90h后结束发酵；
S7用XL1-Blue超级感受态菌株大量复制、突变和保存重组蛋白的质粒；通过 PCR扩增和测序实验多种基因改造的突变；
S8将重组蛋白的质粒转化进 BL21(DE3)pLysS超级感受态菌株菌株，在LB培养基中培养并定时检测吸光度， 并加入诱导剂诱导重组蛋白过量表达；经过SDS-PAGE分离的蛋白质条带的分析测定，筛选出能提供最高产量的重组蛋白的突变体菌株。
本发明中，所述的特定氨基酸序列为X1X2……Xn，其中X代表有4个或以上密码子的氨基酸，n大于或等于3。
本发明中，所述氨基酸片段的序列为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：7-21、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：53-64、SEQ ID NO：89、 SEQ ID NO：91-94、SEQ ID NO：96-99、SEQ ID NO：101-104或SEQ ID NO：106-112 中的任一个。
本发明中，所述氨基酸片段，其编码核苷酸的序列为SEQ ID NO：2-6、SEQ ID NO：22-48、SEQ ID NO：50-52、SEQ ID NO： 65-88、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：109或SEQ ID NO：113-140中的任一个。
本发明：将含蛋白基因的重组载体转化毕赤酵母，所述重组载体为重组表达载体；通过在目的基因的起始密码子ATG后插入一段编码特定氨基酸片段的核苷酸来提高表达效率；在起始密码子ATG后4-21位核苷酸序列以腺嘌呤和胸腺嘧啶的密码子取代部分胞嘧啶和鸟嘌呤的密码子，移除起始密码子ATG后4-21位核苷酸组成的茎环发夹结构；以载体的快速定点诱变试剂盒Stratagene QuikChange Site-directed Mutagenesis Kit构建多个突变菌株；控制重组毕赤酵母生长阶段的温度为30℃，使用25％氨水和30％磷酸调节pH，使体系的pH控制在5.5，并按预设时间加入10ng/ml-1μg/ml的褪黑激素；在高效表达阶段，当补料生长阶段结束后，将发酵温度降至22℃，同时流加含12mL/LPTM1的100％的甲醇；控制发酵液中甲醇浓度达到20g/L，诱导90h后结束发酵；用XL1-Blue超级感受态菌株大量复制、突变和保存重组蛋白的质粒；通过 PCR扩增和测序实验多种基因改造的突变；将重组蛋白的质粒转化进 BL21(DE3)pLysS超级感受态菌株菌株，在LB培养基中培养并定时检测吸光度，并加入诱导剂诱导重组蛋白过量表达；经过SDS-PAGE分离的蛋白质条带的分析测定，筛选出能提供最高产量的重组蛋白的突变体菌株。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种提高蛋白表达效率的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1将含蛋白基因的重组载体转化毕赤酵母，所述重组载体为重组表达载体；
S2通过在目的基因的起始密码子ATG后插入一段编码特定氨基酸片段的核苷酸来提高表达效率；
S3在起始密码子ATG后4-21位核苷酸序列以腺嘌呤和胸腺嘧啶的密码子取代部分胞嘧啶和鸟嘌呤的密码子，移除起始密码子ATG后4-21位核苷酸组成的茎环发夹结构；
S4以载体的快速定点诱变试剂盒Stratagene QuikChange Site-directedMutagenesis Kit构建多个突变菌株；
S41控制重组毕赤酵母生长阶段的温度为30℃，使用25％氨水和30％磷酸调节pH，使体系的pH控制在5.5，并按预设时间加入10ng/ml-1μg/ml的褪黑激素；
S5在高效表达阶段，当补料生长阶段结束后，将发酵温度降至22℃，同时流加含12mL/LPTM1的100％的甲醇；
S6控制发酵液中甲醇浓度达到20g/L，诱导90h后结束发酵；
S7用XL1-Blue超级感受态菌株大量复制、突变和保存重组蛋白的质粒；通过 PCR扩增和测序实验多种基因改造的突变；
S8将重组蛋白的质粒转化进 BL21(DE3)pLysS超级感受态菌株菌株，在LB培养基中培养并定时检测吸光度， 并加入诱导剂诱导重组蛋白过量表达；经过SDS-PAGE分离的蛋白质条带的分析测定，筛选出能提供最高产量的重组蛋白的突变体菌株。
2.根据权利要求1所述的一种提高蛋白表达效率的方法，其特征在于，所述的特定氨基酸序列为X1X2……Xn，其中X代表有4个或以上密码子的氨基酸，n大于或等于3。
3.根据权利要求2所述的一种提高蛋白表达效率的方法，其特征在于，所述氨基酸片段的序列为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：7-21、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：53-64、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：91-94、SEQ ID NO：96-99、SEQ ID NO：101-104或SEQ ID NO：106-112 中的任一个。
4.根据权利要求2所述的一种提高蛋白表达效率的方法，其特征在于，所述氨基酸片段，其编码核苷酸的序列为SEQ ID NO：2-6、SEQ ID NO：22-48、SEQ ID NO：50-52、SEQ IDNO： 65-88、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：109或SEQ ID NO：113-140中的任一个。
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| PB01 | Publication | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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