CN104878036A

CN104878036A - 一种模型拟合和基因改造提高蛋白表达效率的方法及应用

Info

Publication number: CN104878036A
Application number: CN201510214290.4A
Authority: CN
Inventors: 屠志刚; 刘晗青
Original assignee: Nanjing Tai De Bioisystech Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Laisen Research Institute of Biotechnology Co., Ltd.
Priority date: 2015-04-29
Filing date: 2015-04-29
Publication date: 2015-09-02
Anticipated expiration: 2035-04-29
Also published as: CN104878036B

Abstract

本发明涉及一种模型拟合和基因改造提高蛋白表达效率的方法及应用，本发明采用M-fold软件对目的蛋白核糖体蛋白L11的mRNA序列的二级结构进行拟合，输入起始密码子前约二十位和起始密码子后约五十位核苷酸序列进行拟合。根据拟合的二级结构，移除在起始密码子后的发夹结构，对发夹结构内的鸟嘌呤、胞嘧啶等进行针对性的突变，降低它们的含量，以腺嘌呤、胸腺嘧啶取代。进行定点突变后，用实验筛选目的蛋白提高了产量的突变体，并且以生物功能实验进一步验证突变体的生物功能，发现用该方法突变的突变体在增加核糖体蛋白L11表达的同时，对其生物学功能没有显著影响。这种基于模型拟合、定点突变和实验筛选来改善重组核糖体蛋白表达效率的方法，有较高的通用性和可行性，将同样适用于其他重组蛋白的大量表达和工业生产等。

Description

一种模型拟合和基因改造提高蛋白表达效率的方法及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种模型拟合和基因改造提高蛋白表达效率的方法及应用。

背景技术

随着现代基因工程和生物工程理论和技术的高速发展，无论是基础研究领域，还是生物医药、农业、环保和食品等应用领域，利用异源表达系统生产更高水平的目的重组蛋白都已成为研究热点和重点。相对于原始基因在自身宿主的表达，利用异源宿主表达重组蛋白具有许多优点：首先，异源表达可能显著提高目的蛋白的表达量；其次，异源表达中通常所选的宿主具有相对透彻的研究背景，以及成熟的发酵和分离纯化工艺，有利于提高生产效率、节约成本；另外，异源表达中通常所选的宿主具有生物安全性，在食品和医药方面，有利于避免使用病原宿主而引发的潜在风险。目前，与异源重组蛋白表达系统相关的技术尚未十分完善，以至于相关的产品的生产效率或良品率低下且价格昂贵，例如一些要治疗相关症状所必须用到的蛋白质类药物，往往会出现“供不应求”的局面和其他质量问题。可见，改善和提高重组蛋白的表达效率具有举足轻重的意义：首先，重组蛋白表达效率的提高，将会大大缩短应用重组蛋白的相关研究的周期，从而提高课题研究的效率；再者，重组蛋白表达效率的提高会很大程度地缩短某些蛋白质类药物或其他产品的生产周期，减少了大量的人力物力的投入，大大降低药物或其他蛋白质药物的成本；第三，重组蛋白表达效率的提高和改善可以扩展蛋白质类药物的生产规模，提高药物的质量，降低患者的治疗费用和增强疾病治疗的时效性。

重组蛋白的表达，就是利用重组DNA或重组RNA的技术使目的基因在宿主体内经过转录(逆转录)和翻译合成相应的蛋白质(多肽链)，为此，现今不少的研究表明，人们可以在此过程中基于不同的原理以不同的手段和技术来改善和提高重组蛋白的表达效率，例如：首先，在基因层面上，有研究表明，并非所有的目的基因都能在宿主内得到高效的表达，而目的基因本身的碱基序列也会影响到其表达效率，如对密码子的偏爱性、对密码子对的偏爱性、GC含量等等，因而人们可以根据这些特点来对目的基因进行修改和设计，对密码子对进行优化，做到目的基因对密码子和密码子对的协调化，从而达到提高重组蛋白表达效率的目的；再者，在目的基因转录层面上，某些DNA双链上就会出现“发夹”结构，而“发夹”结构出现的位置会不同程度地影响到目的基因的转录。当“发夹”结构出现在靠近编码区前的SD序列(Shine-Dalgarno序列)的前面，它能使部分与转录相关的酶与单链DNA充分结合，从而增强了转录的效率。当“发夹”结构出现在靠近SD序列的后面或者在编码区上，它会减缓与转录相关的酶在单链DNA上的移动速率，从而降低了转录的效率，两种结果截然不同。可见，人们可以根据情况来改变某些DNA中“发夹”结构的位置或者增减相应的“发夹”结构，从而提高目的基因的转录效率，来达到改善和提高重组蛋白的表达效率的目的；最后，在翻译的层面上，有研究表明翻译也受多个因素的影响：一方面，宿主体内的翻译条件在很大程度上影响着目的基因的翻译，如游离氨基酸的丰富度、酶活性等，因此人们可以通过有目的地改造宿主或者选用更好的宿主来提供一个更好的翻译条件，从而改善和提高重组蛋白的表达效率；另一方面，目的基因翻译的最终产物，即目的蛋白质(多肽链)，它们的水溶性或者是否能及时被排出宿主体外也在一定程度上影响了翻译的效率，这是因为水溶性差和不及时被排出宿主体外这两个因素会使目的基因的表达很快达到一个饱和状态，从而抑制了表达，大大降低了表达的持续性和效率。因此，人们可以通过对目的基因进行修饰设计，如引入融合标签，另外也可以通过使目的基因与分子伴侣或折叠酶共表达、替换氨基酸和改变培养基成分等途径，来增强翻译产物的水溶性，使其更快被排出宿主体外，从而增强表达的持续性，改善提高了重组蛋白的表达效率。

本发明是利用模型拟合技术来模拟目的基因的mRNA的空间结构，以此作为定点突变优化的依据，继而通过最终的筛选来确定最佳的目的基因突变改造方案，从而达到预期的以提高蛋白质翻译时的效率来改善重组蛋白表达效率的目的。

发明内容

本发明是利用模型拟合技术来模拟目的基因的mRNA的空间结构，以此作为定点突变的优化依据，来提高蛋白质翻译的速度，改善重组蛋白表达效率的方法。

本发明采用软件M-fold进行mRNA空间二级结构的拟合，利用分子生物学原理，通过定点突变移除起始密码子之后的茎环结构，并且实验筛选出重组蛋白高效表达的菌株，大大改善了重组蛋白的表达效率。

本发明的模型拟合、定点突变和实验筛选改善重组蛋白表达效率的具体技术方案如下：

(1)M-fold程序模拟目的蛋白的二级结构，当紧接着起始密码子后面(特别是编码2-7位蛋白质残基，即4-21位核苷酸序列)有二级茎环结构或碱基的胞嘧啶和鸟嘌呤(GC)含量较高时，蛋白质翻译的效率将大大下降，表达困难。模型蛋白E.coli的核糖体蛋白L11的mRNA用于M-fold的二级结构拟合，发现其二级结构确实在起始密码子之后有一个茎环。因此，富含腺嘌呤和胸腺嘧啶(AT)的密码子被尝试用在M-fold模拟程序中，之前的GlySerSer序列突变为LeuLeulle(序列TTATTAATT，LLI)或TyrTyrTyr(序列TATTATTAT，YYY)或完全删除(dGdSdS)，经过程序拟合，发现将移除茎环，在紧接着蛋白质起始密码子后进行这样的突变，一般不会影响蛋白的生物功能，但同时将大大改善翻译的起始速度，提高重组蛋白的表达效率。

(2)定点突变

蛋白质的质粒准备

BL21(DE3)pLysS L11单菌落被接种到有氨苄青霉素的LB培养基中37℃水浴经过两夜摇晃孵育。离心收获细胞后，储存在-80℃条件下。细胞用溶菌酶(Sigma-Aldrich)破膜，纯化质粒，真空干燥后保存于DEPC水中。浓度通过A₂₆₀测定，其序列由DNA测序来证实。

定点突变的引物设计

Stratagene QuikChange定点突变试剂盒用于构建多个突变菌株。引物设计根据以下原则：1.两个诱变引物在相反的质粒链上必须包含所需的突变和退火相同的顺序；2.引物长度应当在25到45个碱基之间，融解温度(Tm)≥78℃；3.所需的突变(删除或者插入)应该在引物中间，并且两边都有10到15个序列正确的碱基；4.引物的胞嘧啶和鸟嘌呤(GC)含量至少要40％，并且终止于一个或者多个C或G碱基。

定点突变

XL1-Blue超级感受态菌株被用来大量复制、突变和保存L11质粒。通过PCR扩增和测序证明，实验成功实现了预想的三种突变，对L11的质粒进行了改造，定点突变成功移除了茎环结构。

(3)实验筛选

将L11质粒转化BL21(DE3)pLysS超级感受态菌株菌株后，在LB培养基中培养并定时在550nm检测吸光度。约两小时后，加入1mM IPTG去诱导过量表达，并测定吸光度。经过SDS-PAGE分离的L11条带的经过分析测定，筛选出能提供最高产量的L11突变体。

(4)L11的生物学活性验证

本发明通过生物试验，将L11重新组装到大肠杆菌的核糖体中，发现蛋白质合成的速度完全未受L11突变的影响，验证了多种突变体的生物功能基本和野生型相同，无明显差异。

有益效果：

本发明的优点在于：利用M-fold程序模拟目的蛋白的二级结构，降低紧接着起始密码子后面(特别是编码2-7位蛋白质残基，即4-21位核苷酸序列)的碱基的胞嘧啶和鸟嘌呤(GC)含量，并移除二级的茎环结构，经过定点突变和筛选过量表达后的突变体，大大提高了重组蛋白的表达效率。此外，突变后的重组蛋白在生物功能上与野生型相当。本发明的改善重组蛋白表达效率的方法，在起始密码子后略改造目的基因，一般不改变基因和蛋白的生物功能，有较高的通用性和可行性，将同样适用于其他重组蛋白的大量表达和工业生产等。

附图说明

图1.在M-fold软件中拟合的核糖体蛋白L11野生型L11-WT的mRNA二级结构。起始密码子ATG用红色方框突出显示。

图2.在M-fold软件中拟合的核糖体蛋白L11定点突变的L11-YYY突变体的mRNA二级结构。起始密码子ATG用红色方框突出显示。

图3.在M-fold软件中拟合的核糖体蛋白L11定点突变的L11-LLI突变体的mRNA二级结构。起始密码子ATG用红色方框突出显示。

图4.在M-fold软件中拟合的核糖体蛋白L11定点突变的L11-dGdSdS突变体的mRNA二级结构。起始密码子ATG用红色方框突出显示。

图5.核糖体蛋白L11在SDS-PAGE的表达水平。数字表明IPTG诱导时间，Y表示YYY突变，L表示LLI突变，D表示GSS的删除，F表示野生型。样本稀释到相同的总蛋白量，并且以相同的体积上样。

图6.核糖体蛋白L11的多种突变体的表达量比较。数字表明IPTG诱导时间，Y表示YYY突变，L表示LLI突变，D表示GSS的删除，F表示野生型。样本稀释到相同的A550读数并且加载相同的体积。量化扫描显示Y6,L6,D6,和F6分别是64.4,59.8,23.2,25.9μ

图7.核糖体蛋白L11的多种突变体的合成蛋白质能力的生物活性检测。Y表示YYY突变，L表示LLI突变，WT表示野生型。依赖于聚尿苷(Poly(U))序列的聚苯丙氨酸(poly(Phe))合成测试。野生型L11(L11-WT)和L11-YYY突变体及L11-LLI突变体合成蛋白质的速率和最终的平衡都类似，没有显著性的差异。(◆L11-YYY；■L11-WT；▲L11-LLI)。

具体实施方式

实施例1.

mRNA二级结构拟合

在M-fold程序中，输入L11的mRNA序列。由于起始密码子之前的序列，包括SD序列等，可以与起始密码子之后的序列形成氢键和二级结构，并可以影响蛋白质的翻译速度，因此，输入20个左右的核苷酸序列进行二级结构拟合；同时，输入起始密码子之后的50个左右的核苷酸序列，保证mRNA在起始密码子之后有足够的长度进行折叠。

用M-fold进行拟合后，发现野生型的L11的mRNA在起始密码子之后立即有一个发夹结构(图1)。因此，核糖体在翻译蛋白质时，极有可能在这个位置读取mRNA序列收到阻滞，降低翻译蛋白质的速度，最终导致重组蛋白产量的降低。同时，发现在这个发夹结构中出现了大量的C(胞嘧啶)和G(鸟嘌呤)。因此，以降低起始密码子之后的CG含量和除去发夹结构为目的，我们选取了多种突变的方式。A(腺嘌呤)和T(胸腺嘧啶)丰富的密码子被尝试用在M-fold模拟程序中，起始密码子后的三个氨基酸残基的GlySerSer更换为TyrTyrTyr(YYY，编码UAU UAU UAU)(图2)或LeuLeulle(LLI，编码UUA UUA AUU)(图3)或完全删除(dGdSdS)(图4)后，起始密码子后的发夹结构即被有效去除。序列中胞嘧啶和鸟嘌呤(GC)含量的降低还有助于核糖体翻译的顺利高速的翻译。

实施例2.

L11质粒纯化

BL21(DE3)pLysS L11单菌落被接种到20ml含l0μg/ml氨苄青霉素(Sigma-Aldrich)的LB培养基中，烧瓶在37℃条件下过夜摇晃孵育。第二天，5ml饱和的BL21(DE3)pLysS L11细胞被转移到500ml有l0μg/ml氨苄青霉素的极品肉汤培养基(terrific broth(Invitrogen))中，烧瓶在37℃条件下过夜摇晃孵育。细胞用Beckman离心机的GS-3转子在5,500rpm转速下离心10分钟后收集。细胞被液氮速冻，并储存在-80℃条件下。

细胞溶解在20ml含1mg/ml溶菌酶(Sigma-Aldrich)的溶液中。在溶液均一后，加40ml 1％SDS的0.2N NaOH溶液，同时沉淀染色体和质粒的DNA。溶液被放在冰上10分钟，加入20ml5M醋酸钾溶液(pH 4.8)，沉淀染色体DNA，而质粒DNA仍存在于溶液中。混合物被放在冰上20分钟，并用Beckman离心机在转速12,000rpm的时候离心30分钟(SS34转子)。然后0.6体积(～36ml)的异丙醇被加到上清液中沉淀质粒。溶液放在室温中静置15分钟。然后用Beckman离心机在4℃条件下转速12,000rpm的时候离心5分钟(SS34转子)。1ml 70％的乙醇被用来清洗质粒DNA。这些质粒DNA在真空条件下干燥之后，溶解在3ml T.E.缓冲液中(无菌、预冷的)。一份等量的5M LiCl(预冷的)加入到里面，样品放置在冰上20分钟。然后在4℃条件下用离心机在7,500rpm转速下离心25分钟(SS34转子)。一份等量的异丙醇被加到上层清液中并放在室温中静置15分钟。然后在4℃条件下用离心机在7,500rpm转速下离心25分钟(SS34转子)。70％的乙醇被用来清洗沉淀，它们在真空条件下被干燥后，这些颗粒被溶解在0.5ml pH 8.0的T.E.缓冲液中，最后5ml核糖核酸酶混合物(一种由两种高度纯化的不含脱氧核糖核酸酶的核糖核酸酶组成的混合物，核糖核酸酶A(RNase A，500U/ml)和核糖核酸酶T1(RNase T1，20,000U/ml))加入到溶液里，在37℃的条件下过夜孵育用来去除痕量RNA杂质。

过夜孵育后，同等体积(500μl)冰的13％PEG800，1.6M氯化钠被加入到反应的混合物中，充分混合。混合物放在冰上放置20分钟，并在微型离心机中在15,000rpm转速下离心20分钟。150μl T.E.缓冲液用来溶解沉淀。同等体积的苯酚加入到微量离心管，混合物在微型离心机中在8,000rpm转速下离心5分钟来去除可能的蛋白质杂质，然后同等体积的苯酚-氯仿和氯仿萃取被用来去除微量苯酚，十分之一体积的10M NH₄Ac和2份体积的100％乙醇被添加到水相中，混合物放在冰上30分钟。最终在微型离心机中在4℃时15,000rpm转速下离心15分钟，沉淀用70％的乙醇清洗两次。真空干燥后沉淀用100μl的DEPC-H₂O溶解。浓度通过A₂₆₀的读数来测定，DNA序列测定验证其序列。

实施例3.

L11质粒的定点突变的引物设计

载体的快速定点诱变工具盒(Stratagene QuikChange site-directed mutagenesis kit)用于构建多个突变体。引物设计根据以下原则：1.两个引物在相反的质粒链上必须包含所突变的一致的序列；2.引物长度应当在25-45个碱基之间，熔化温度(Tm)≥78℃时；3.所需的突变(删除或者插入)的位置应该在引物中间，并且两边都有10到15个序列正确的碱基；4.引物最低的胞嘧啶和鸟嘌呤(GC)含量40％，并且终止于一个或者多个C或G碱基。

T_m＝81.5+0.41(％GC)-675/N-错配％ (反应式1)

T_m＝81.5+0.41(％GC)-675/N(针对插入或删除) (反应式2)

N是引物中碱基的长度，GC百分比和错配的百分比是整数。

设计的引物如下所示，基因突变处用黑体加下划线来突出显示。

L11-dGdSdS突变体所用引物：

引物1:5’-GTG ATG ATG ATG ATG ATG CAT GGT ATA TCT CCT TCT-3’

引物2:5’-AGA AGG AGA TAT ACC ATG CAT CAT CAT CAT CAT CAC-3’

L11-YYY突变体所用引物：

引物1:5’-GCT GCT GTG ATG ATG ATG ATG ATG ATA ATA ATA CAT GGT ATA TCT CC-3’

引物2:5’-GG AGA TAT ACC ATG TAT TAT TAT CAT CAT CAT CAT CAT CAC AGC AGC-3’L11-LLI突变体所用引物：

引物1:5’-GCT GCT GTG ATG ATG ATG ATG ATG AAT TAA TAA CAT GGT ATA TCT CC-3’

引物2:5’-GG AGA TAT ACC ATG TTA TTA ATT CAT CAT CAT CAT CAT CAC AGC AGC-3’

实施例4.

定点突变

50ng的L11质粒，125ng的引物1，125ng的引物2，5μl的10倍反应缓冲液，1μl dNTP溶液，1μl的25U/ml Pfu turbo DNA聚合酶，用自制的DEPC-H₂O(0.1％)配成50μl PCR反应液。PCR程序分为四个循环：1.95℃一个循环，30秒；2.每个循环95℃30秒、55℃1分钟、68℃5.11分钟，共十二个循环；3.68℃一个循环，10分钟；4.4℃，无限时。在PCR反应完成后，1μl的10U/μl DpnI限制性内切酶被添加到管中，混合物在37℃孵育一个小时切断母链。50μl的XL1-Blue超级感受态细胞被加入到14-ml预冷的BD Falcon聚丙烯圆底管中。1μl的PCR反应液被转移到14-ml管中，然后在冰上放置30分钟，转化反应是在42℃热脉冲45秒，然后继续冰浴两分钟，被预热到42℃的0.5ml的NZY⁺(0.02g/ml LB肉汤、12.5mM MgCl₂、12.5mM MgSO₄、0.4％(w/v)葡萄糖)培养液被加入到这个14-ml管中，在37℃培养一个小时，250μl的转化过的XL1-Blue细胞被平铺在LB琼脂板上(含氨苄青霉素(0.1mg/ml)和四环素(0.03mg/ml))。这些板在37℃时培养36-48个小时，单菌落被接种到12-ml的LB肉汤中，过夜孵育。突变后的序列经过DNA测序验证。

L11-YYY序列如下所示：

AGTCCTCTRATATTTTGTTTACTTTAAGAAGGAGATATACCTATTATTATCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTAAGAAAGTAC AAGCCTATGTCAAGCTGCAGGTTGCAGCTGGTATGGCTAACCCGAGTCCGCCAGTAGGTCCGGCTCTGGGTCAGCAGGGCGTAAACATCATGGAATTCTCCAAAGCGTTCAACGCAAAAACTGATTCCATCGAAAAAGGTCTGCCGATTCCGGTAGTAATCACCGTTTACGCTGACCGTTCTTTCACTTTCGTTACCAAGACTCCGCCGGCAGCAGTTCTGCTGAAAAAAGCGGCTGGTATCAAGTGTGGTTCCGGTAAGCCGAACAAAGACAAAGCGGGTAAAATTTCCCGCGCTCAGCTGCAGGAAATCGCGCAGACCAAAGCTGCCGACATGACTGGTGCCGACATTGAAGCGATGACTCGCTCCATCGAAGGTACTGCACGTTCCATGGGCCTGGTAGTGGAGGACTAATGGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTATATCCGGATATCCACAGGACGGGTGTGGTCGCCATGATCGCGTAGTCGATAGTGGCTCCAAGTAGCGAAGCGAGCAGGACTGGGCGGCGGCCAAAGCGGTCGGACAGTGCTCCGAGAACGGGTGCGCATAGAAATTGCATC

L11-LLI序列如下所示：

AGTCCTCTRATATTTTGTTTACTTTAAGAAGGAGATATACCTTATTAATTCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTAAGAAAGTAC AAGCCTATGTCAAGCTGCAGGTTGCAGCTGGTATGGCTAACCCGAGTCCGCCAGTAGGTCCGGCTCTGGGTCAGCAGGGCGTAAACATCATGGAATTCTCCAAAGCGTTCAACGCAAAAACTGATTCCATCGAAAAAGGTCTGCCGATTCCGGTAGTAATCACCGTTTACGCTGACCGTTCTTTCACTTTCGTTACCAAGACTCCGCCGGCAGCAGTTCTGCTGAAAAAAGCGGCTGGTATCAAGTGTGGTTCCGGTAAGCCGAACAAAGACAAAGCGGGTAAAATTTCCCGCGCTCAGCTGCAGGAAATCGCGCAGACCAAAGCTGCCGACATGACTGGTGCCGACATTGAAGCGATGACTCGCTCCATCGAAGGTACTGCACGTTCCATGGGCCTGGTAGTGGAGGACTAATGGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTATATCCGGATATCCACAGGACGGGTGTGGTCGCCATGATCGCGTAGTCGATAGTGGCTCCAAGTAGCGAAGCGAGCAGGACTGGGCGGCGGCCAAAGCGGTCGGACAGTGCTCCGAGAACGGGTGCGCATAGAAATTGCATC

说明：

—起始密码子

GCTAAGAAAGTACAAGCC---L11序列开始处

突变位置：紧接着ATG起始密码子后的1-9个核苷酸(加深显示)

实施例5.

核糖体蛋白L11表达水平的改善

以上经过序列验证的质粒用以上相同的方法转化到BL21(DE3)pLysS超级感受态细胞中大量表达L11蛋白，培养基使用LB(含氨苄青霉素0.1mg/ml)。

不同的L11突变体以其野生型作为参照。它们的表达水平在过量表达实验中平行测定。1ml过夜培养的饱和的细胞液被稀释到100ml有着0.1mg/m氨苄青霉素的LB培养基中，这些细胞在37℃环境下孵育1个小时。1ml LB培养基在0、1小时的时间点时被取出并读出在550nm处的吸光度，经过1小时后，加入1mM IPTG去诱导过量表达。LB培养基在IPTG诱导后每小时包括都被取出1ml用于读数。样本根据A550读数，上样相同的总蛋白量，并用14％SDS-PAGE分析。结果表明，表明突变体TyrTyrTyr(YYY，编码UAU UAU UAU)和突变体LeuLeulle(LLI，编码UUA UUA AUU)中，L11的表达分别增加了2.8和2.6倍(图5)。三次独立实验的L11突变体表达量的变化如图6所示。

实施例6.

核糖体蛋白L11突变体的活性检测

70S核糖体的制备

以如下条件培养大肠杆菌(E.coli)AM77细胞，提取70S核糖体，该种细胞的核糖体缺乏L11蛋白。15L培养液由150g胰化(蛋白)胨,150g酵母提取物,192g Na2HPO4·7H2O,45g KH2PO4,7.5g NaCl,1.5g MgSO4·7H2O pH 7.0,75g葡萄糖,4.5g利福平配制而成。60-70g冷冻的细胞重悬于两倍体积的裂解缓冲液(20mM Tris-HCl(pH 7.5)、100mM NH₄Cl、10mM MgAc₂、0.5mM EDTA和3mM 2-巯基乙醇)中，以French press的方式高压裂解细胞。之后离心去除细胞碎片。取出约25ml上清液，置于22ml的1.1M蔗糖溶液上，以30,000rpm的速度离心21小时(Beckman离心机，Ti 45转子)。沉淀物重悬于30ml的AM77纯化缓冲液，并置于10ml的1.1M蔗糖溶液中，再次以30,000rpm的速度离心21小时(Beckman离心机，Ti 45转子)。重复这一步骤两次，最终重悬于AM77纯化缓冲液中。70S核糖体最终在10％到50％的蔗糖溶液中用区带离心分离纯化。收集70S的峰，用液氮速冻并保存在-80℃。活性检测方法：依赖于聚尿苷(Poly(U))序列的聚苯丙氨酸(poly(Phe))合成

该反应在缓冲液TAM₁₀(T₂₀A₁₀₀M₁₀)中进行，该缓冲液由20mM Tris-HCl(pH 7.5)，100mM NH₄Cl和10mM MgCl₂组成。翻译起始复合物(Initiation complex)由0.3μM 70S核糖体,0.3μg/μL mRNA(序列是UUUUUUUUU……)和[¹⁴C]同位素标记的-AcPhe-tRNA^Phe(0.36μM)在37℃反应5分钟所形成。此外，3.2μM[³H]-Phe-tRNA^Phe、2.8mM 2-巯基乙醇、0.005mg/ml丙酮酸激酶、0.5mM磷酸烯醇式丙酮酸、0.6mM三磷酸鸟苷(GTP)、0.6μM EF-G混合均匀后加入到起始复合物中。反应混合物均分为若干等分，每4μL该反应混合物在反应0秒，20秒，40秒，80秒，2分钟，4分钟，6分钟，10分钟，15分钟和30分钟后以0.3mL5％冰的三氯乙酸溶液淬灭。反应加入0.6μM EF-Tu后在37℃孵育并计时。收集所有时间点的反应液后，在95℃加热15分钟，在冰上冷却，用硝化纤维膜过滤，并用1mL 5％冰的三氯乙酸溶液清洗滤膜。烘干滤膜后，读出每个时间点的放射读数。背景读数用加EF-Tu之前的反应混合物来读取，一般在200CPM左右。经过校正的多种核糖体蛋白L11突变体的依赖于Poly(U)序列的poly(Phe)合成测试结果如图7所示。L11-WT(野生型)，L11-YYY(YYY突变体)和L11-LLI(LLI突变体)三种不同L11突变体的合成蛋白质的速度和功能相当，无明显差异。该实验至少重复三次以上。因此，这些结果进一步验证了在紧接着起始密码子之后位置的突变一般不影响这些蛋白的生物活性。

Claims

1.一种模型拟合和基因改造提高蛋白表达效率的方法，其特征在于，用M-fold程序模拟目的蛋白的二级结构，输入起始密码子ATG前二十位和起始密码子后五十位核苷酸序列，来模拟其mRNA的二级结构；经过程序拟合，在起始密码子ATG后4-21位核苷酸序列以腺嘌呤和胸腺嘧啶的密码子取代部分胞嘧啶和鸟嘌呤的密码子，移除起始密码子ATG后4-21位核苷酸组成的茎环发夹结构；接着，以载体的快速定点诱变试剂盒Stratagene QuikChange Site-directedMutagenesis Kit构建多个突变菌株；引物设计根据以下原则：1.两个诱变引物在相反的质粒链上必须包含所需的突变和退火相同的顺序；2.引物长度应当在25到45个碱基之间，融解温度≥78℃；3.所需的突变，包括了删除或者插入突变，应该在引物中间，并且两边都有10到15个序列正确的碱基；4.引物的胞嘧啶和鸟嘌呤含量至少要40％，并且终止于一个或者多个胞嘧啶和鸟嘌呤碱基；紧接着，可以用XL1-Blue超级感受态菌株大量复制、突变和保存重组蛋白的质粒；通过PCR扩增和测序实验多种基因改造的突变；此后，将重组蛋白的质粒转化进BL21(DE3)pLysS超级感受态菌株菌株，在LB培养基中培养并定时检测吸光度，并加入诱导剂诱导重组蛋白过量表达；经过SDS-PAGE分离的蛋白质条带的分析测定，筛选出能提供最高产量的重组蛋白的突变体菌株。

2.根据权利要求1所述一种模型拟合和基因改造提高蛋白表达效率的方法，其特征在于，用M-fold程序模拟目的蛋白mRNA的二级结构，紧接着起始密码子后面编码2-7位蛋白质残基位置有二级茎环结构移除和碱基的GC含量降低。

3.利用权利要求1所述的方法改造的核糖体重组蛋白L11，其特征在于，所述L11对应的核苷酸序列如I或II所示：

I：L11-YYY序列：

AGTCCTCTRATATTTTGTTTACTTTAAGAAGGAGATATACCTATTATTATCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTAAGAAAGTACAAGCCTATGTCAAGCTGCAGGTTGCAGCTGGTATGGCTAACCCGAGTCCGCCAGTAGGTCCGGCTCTGGGTCAGCAGGGCGTAAACATCATGGAATTCTCCAAAGCGTTCAACGCAAAAACTGATTCCATCGAAAAAGGTCTGCCGATTCCGGTAGTAATCACCGTTTACGCTGACCGTTCTTTCACTTTCGTTACCAAGACTCCGCCGGCAGCAGTTCTGCTGAAAAAAGCGGCTGGTATCAAGTGTGGTTCCGGTAAGCCGAACAAAGACAAAGCGGGTAAAATTTCCCGCGCTCAGCTGCAGGAAATCGCGCAGACCAAAGCTGCCGACATGACTGGTGCCGACATTGAAGCGATGACTCGCTCCATCGAAGGTACTGCACGTTCCATGGGCCTGGTAGTGGAGGACTAATGGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTATATCCGGATATCCACAGGACGGGTGTGGTCGCCATGATCGCGTAGTCGATAGTGGCTCCAAGTAGCGAAGCGAGCAGGACTGGGCGGCGGCCAAAGCGGTCGGACAGTGCTCCGAGAACGGGTGCGCATAGAAATTGCATC

II：L11-LLI序列：

AGTCCTCTRATATTTTGTTTACTTTAAGAAGGAGATATACCTTATTAATTCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTAAGAAAGTACAAGCCTATGTCAAGCTGCAGGTTGCAGCTGGTATGGCTAACCCGAGTCCGCCAGTAGGTCCGGCTCTGGGTCAGCAGGGCGTAAACATCATGGAATTCTCCAAAGCGTTCAACGCAAAAACTGATTCCATCGAAAAAGGTCTGCCGATTCCGGTAGTAATCACCGTTTACGCTGACCGTTCTTTCACTTTCGTTACCAAGACTCCGCCGGCAGCAGTTCTGCTGAAAAAAGCGGCTGGTATCAAGTGTGGTTCCGGTAAGCCGAACAAAGACAAAGCGGGTAAAATTTCCCGCGCTCAGCTGCAGGAAATCGCGCAGACCAAAGCTGCCGACATGACTGGTGCCGACATTGAAGCGATGACTCGCTCCATCGAAGGTACTGCACGTTCCATGGGCCTGGTAGTGGAGGACTAATGGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTATATCCGGATATCCACAGGACGGGTGTGGTCGCCATGATCGCGTAGTCGATAGTGGCTCCAAGTAGCGAAGCGAGCAGGACTGGGCGGCGGCCAAAGCGGTCGGACAGTGCTCCGAGAACGGGTGCGCATAGAAATTGCATC。